Methoden om de gevoeligheid van hoge resolutie Melting Single Nucleotide Polymorphism genotypering in Malaria Verhoog

Het algemene doel van het volgende hoge resolutie smeltexperiment is om de gevoeligheid van detectie van mutante allelen die in lage concentraties in individuele monsters aanwezig zijn, te verhogen. Dit wordt bereikt door eerst geëxtraheerd DNA te bereiden door de template te verdunnen tot de noodzakelijke volumes en concentraties. De tweede stap is om de assays voor te bereiden met asymmetrische verhoudingen van de voorwaartse en achterwaartse primer om het template-probe-product te verhogen.

Na het voorbereiden van de reacties, wordt de annealing temperatuur ingesteld tussen de smelttemperaturen van de probe wanneer deze gebonden is aan de wildtype of mutante template. De laatste stap is om de geamplificeerde producten te analyseren op het juiste HRM-platform. Uiteindelijk zorgen mutante allelamplificatie bias en op probe gebaseerde asymmetrische PCR voor een gevoeliger detectie van uitdagende SNP-mutaties bij lage concentraties die in monsters aanwezig zijn.

Deze verhoogde gevoeligheid is nuttig voor mutatiebewaking in populaties. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals standaard hoge resolutie smelten of tac man genotypering, is dat het een verhoogde gevoeligheid toestaat voor allelen die in lage concentraties aanwezig zijn, en ook genotypering van SNPs mogelijk maakt die zich in de nabijheid van elkaar in het genoom bevinden. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de verspreiding van geneesmiddelresistentie bij de malariaparasiet.

Het kan ook worden toegepast op andere systemen zoals surveillance van andere typen infectieziekten zoals HIV of het detecteren van zeldzame kankervarianten in een populatie van cellen. De procedure zal worden gedemonstreerd door Caitlin Durphy. Een technicus uit ons laboratorium.

Templates voor hoge resolutie smelten of HRM worden bereid uit plasmodium falciparum monsters die rechtstreeks zijn verkregen uit het bloed van patiënten die deelnemen aan veldonderzoeksstudies. De monsters kunnen worden bewaard op filterpapier, op snelle detectietests of als gepeletteerde rode bloedcellen. De monsters kunnen ook worden aangepast om in vitro te groeien. Enkele standaard laboratoriumstammen voor analyse kunnen worden besteld vanuit het malaria onderzoeks- en referentie reagensen resource centrum. Monsters kunnen worden geëxtraheerd uit vol bloed, rode bloedcellen of filterpapier, of direct worden gebruikt uit gepeletteerde rode bloedcellen of kweek voor directe amplificatie uit gepeletteerde rode bloedcellen.

Bepaal eerst de para van de rode bloedcellen met behulp van dunne uitstrijk microscopie volgens de procedure van de Centers for Disease Control and Prevention. Rode bloedcellen met para's boven 0,5% worden vervolgens verdund tot 1 op 400. In TE worden drie microliters van verdunde rode bloedcellen gebruikt voor elke vijf tot 10 microliter reactie. Vanwege de variabiliteit tussen positieve en negatieve controles moeten deze altijd worden opgenomen in HRM-analyses.

Bereid 10 picogram tot 10 nanogram per microliter verdunningen van plasmide of standaarden met sequentie-verifieerde snip genotypen als positieve trolls. Gebruik PCR-kwaliteit water als een negatief controle zonder template voor de amplificatiereacties. Begin deze procedure door 10 x werkstocks van de primers en probes te bereiden.

Hetzelfde protocol is van toepassing op assays die 96-well platen, 384-well platen, achtbuisjesstrips of glas capillairen gebruiken. Maar voor het doel van deze demonstratie, zullen alleen 96-well platen en glas capillairen worden gebruikt. Deze tabel toont aanbevolen 10 x werkstockconcentraties evenals eindconcentraties voor geblokkeerd probe gebaseerde HRM genotypering.

Bereid reactiemengsels voor elke put. Voeg één microliter van elk van de 10 x werkstock voorwaartse en achterwaartse primers en probes toe. Vier tot vijf microliters van de HRM master mix, één microliter van de template en PCR-kwaliteit water voor een totaal reactievolume van 10 microliter.

Doe hetzelfde voor elke glas capillair. Bedek de platen en glas capillairen. Gebruik optische plaatverzegelingen voor plaatgebaseerde amplificatie en plastic doppen voor capillairgebaseerde systemen.

Zorg ervoor dat de dekking compleet is en dat platen en doppen volledig zijn verzegeld en beveiligd om verdamping te voorkomen. Tijdens de amplificatie. Spuit de monsters om luchtbellen te verwijderen.

Spuiten platen in een tafelcentrifuge gedurende drie minuten bij 1.800 keer G. Spuit glas capillairen in een pico fuge gedurende 10 tot 15 seconden. Plaats de reactieplaat en glas capillairen in een thermische cycler en voer standaard geblokkeerde probe of MAAB amplificatie protocollen uit. Na PCR-amplificatie gaat u verder met de smeltanalyse vanuit de systeemsoftware interface.

Smelt de plaat van 40 graden Celsius tot 80 graden Celsius om zowel probe- als amplicon-smeltpieken te produceren. De eerste stap smeltanalyse op de light cycler four 80 is normalisatie van de negatieve afgeleide van genormaliseerde fluorescentie met betrekking tot temperatuurweergave. Beweeg normalisatiebalken om de probe smeltregio te omringen.

De probe smeltregio is de lagere temperatuur van de twee smeltregio's. De normalisatiebalken moeten zich aan de basis van de smeltpieken bevinden. Na normalisatie, selecteer groepen berekenen om monsters automatisch aan groepen toe te wijzen indien nodig, herverdeel monsters handmatig naar specifieke groepen.

Selecteer monsters die niet zijn geamplificeerd of die getande smeltpieken hebben. Ga vervolgens naar nieuwe oproep en selecteer negatief. Na het selecteren van eventuele resterende verkeerd geclassificeerde monsters, ga naar nieuwe oproep, selecteer de juiste groepering en klik op wijziging toepassen. Wijs genotypen toe voor elke groep op basis van de standaarden.

Nadat u hebt bevestigd dat de berekende groepen correct zijn, selecteert u groepsnamen bewerken onder de groeperingstab. Voer de genotypen van de standaarden in in de overeenkomstige gekleurde vakjes. Bijvoorbeeld, als standaard 3D zeven een bekend C-genotype heeft en zich in groep een bevindt, dan hebben alle monsters in groep een genotype C. Druk op resultaten en genotypen worden naast monsters weergegeven.

Exporteer ten slotte de resultaten als een TXT-bestand voor verdere populatieanalyse van monsters. Nadat de run is voltooid op de light cycler 2.0, noteer de monsters namen en posities onder monstersgegevens. Voordat u met de analyse begint, labelt u de negatieve controles en de genotypen van de smeltstandaarden. Begin de smeltanalyse