Methoden om de gevoeligheid van hoge resolutie Melting Single Nucleotide Polymorphism genotypering in Malaria Verhoog

Het algemene doel van het volgende high resolution melt-experiment is het verhogen van de detectiegevoeligheid voor mutante allelen die in lage concentraties in individuele monsters aanwezig zijn. Dit wordt bereikt door eerst het geëxtraheerde DNA voor te bereiden door het template te verdunnen tot de benodigde volumes en concentraties. De tweede stap is het voorbereiden van de assays met asymmetrische verhoudingen van de forward- en reverse-primer om de opbrengst van het template-probe-product te verhogen.

Na het voorbereiden van de reacties wordt de annealingtemperatuur ingesteld tussen de smelttemperaturen van de probe wanneer deze gebonden is aan respectievelijk het wildtype- of het mutanttemplate. De laatste stap is het analyseren van de geamplificeerde producten op het geschikte HRM-platform. Uiteindelijk maken de amplificatiebias van het mutantallel en probe-gebaseerde asymmetrische PCR een gevoeligere detectie mogelijk van uitdagende SNP-mutaties bij lage concentraties in monsters.

Deze verhoogde gevoeligheid is nuttig voor mutatiesurveillance in populaties. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals standaard high resolution melting of TaqMan-genotypering, is dat het een verhoogde gevoeligheid mogelijk maakt voor allelen die in lage concentraties aanwezig zijn, en dat het genotypering mogelijk maakt van SNP's die zich in het genoom dicht bij elkaar bevinden. Bovendien kan deze methode inzicht verschaffen in de verspreiding van drugresistentie bij de malariaparasiet.

Het kan ook worden toegepast op andere systemen, zoals de surveillance van andere typen infectieziekten zoals HIV of het detecteren van zeldzame kankervarianten in een celpopulatie. De procedure zal worden gedemonstreerd door Caitlin Durphy, een technicus uit ons laboratorium.

Templates voor high resolution melting of HRM worden klaargemaakt van Plasmodium falciparum-monsters die rechtstreeks zijn verkregen uit het bloed van patiënten die deelnemen aan veldonderzoeken. De monsters kunnen worden bewaard op filterpapier, op rapid detection tests of als gepellette rode bloedcellen; monsters kunnen ook cultuur-geadapteerd worden om in vitro te groeien. Enkele standaard laboratoriumstammen voor analyse kunnen worden besteld bij het malaria research and reference reagent resource center. Monsters kunnen worden geëxtraheerd uit volbloed, rode bloedcellen of filterpapier, of direct worden gebruikt vanuit gepellette rode bloedcellen of culturen voor directe amplificatie vanuit gepellette rode bloedcellen.

Bepaal eerst de parasitemie van de rode bloedcellen met behulp van dunne-uitstrijkmicroscopie volgens de procedure van de Centers for Disease Control and Prevention. Rode bloedcellen met een parasitemie boven de 0.5% worden vervolgens 1 op 400 verdund. In TE worden drie µL verdunde rode bloedcellen gebruikt voor elke reactie van vijf tot 10 µL; vanwege de variabiliteit tussen positieve en negatieve controles moeten deze altijd worden opgenomen in HRM-analyses.

Bereid verdunningen van 10 picogram tot 10 nanogram per ene microliter van het plasmide of standaarden met sequentie-geverifieerde snip-genotypes als positieve controles. Gebruik PCR-water als negatieve controle zonder template voor de amplificatiereacties. Begin deze procedure met het bereiden van 10 x werkvoorraden van de primers en probes.

Hetzelfde protocol is van toepassing op assays met 96-wells platen, 384-wells platen, strips van acht buisjes of glazen capillairen. Voor de doeleinden van deze demonstratie worden echter alleen 96-wells platen en glazen capillairen gebruikt. Deze tabel toont de aanbevolen 10 x werkvoorraadconcentraties alsook de uiteindelijke concentraties voor HRM-genotypering op basis van geblokkeerde probes.

Bereid de reactiemengsels in elke put voor. Voeg één µL van elk van de 10 x werkvoorraad forward- en reverse-primers en probes toe. Voeg vier tot vijf µL HRM mastermix, één µL template en PCR-waardig water toe voor een totaal reactievolume van 10 µL.

Herhaal deze stappen voor elke glazen capillair. Dek de platen en glazen capillaires af. Gebruik optische plaatafdichtingen voor plaatgebaseerde amplificatie en plastic doppen voor capillairgebaseerde systemen.

Zorg dat de dekking volledig is en dat de platen en doppen volledig zijn afgesloten en vastgezet om verdamping te voorkomen. Centrifugeer de monsters tijdens de amplificatie om luchtbellen te verwijderen.

Centrifugeer de platen in een tafelcentrifuge gedurende drie minuten bij 1.800 ×g. Centrifugeer de glazen capillairen in een picofuge gedurende 10 tot 15 seconden. Plaats de reactieplaat en de glazen capillairen in een thermocycler en voer de standaard protocollen uit voor geblokkeerde probes of MAAB-amplificatie. Ga na de PCR-amplificatie over tot de smeltanalyse via de interface van de systeemsoftware.

Smelt de plaat van 40 °C tot 80 °C om zowel de smeltpieken van de probe als van het amplicon te genereren. De eerste stap van de smeltanalyse op de LightCycler 480 is de normalisatie van de negatieve afgeleide van de genormaliseerde fluorescentie ten opzichte van de temperatuurweergave. Verplaats de normalisatiebalken zodat ze het smeltgebied van de probe omsluiten.

Het smeltgebied van de probe is de lagere temperatuur van de twee smeltgebieden. De normalisatiebalken moeten zich aan de basis van de smeltpieken bevinden. Selecteer na normalisatie 'bereken groepen' om monsters indien nodig automatisch aan groepen toe te wijzen, of wijs monsters handmatig toe aan specifieke groepen.

Selecteer monsters die niet zijn geamplificeerd of die grillige smeltpieken vertonen. Ga vervolgens naar 'new call' en selecteer 'negative'. Selecteer daarna eventuele overgebleven onjuist geclassificeerde monsters, ga naar 'new call', selecteer de juiste groepering en klik op 'apply change'. Ken genotypen toe voor elke groep op basis van de standaarden.

Nadat is bevestigd dat de berekende groepen correct zijn, selecteert u 'edit group names' onder het tabblad 'grouping'. Voer de genotypen van de standaarden in het overeenkomstige gekleurde vak in. Als standaard 3D seven bijvoorbeeld een bekend C-genotype heeft en zich in groep één bevindt, dan hebben alle monsters in groep één genotype C; druk op 'results' om de genotypen naast de monsters weergegeven te krijgen.

Exporteer tot slot de resultaten als een TXT-bestand voor verdere analyse van de steekproefpopulatie. Noteer na afloop van de run op de light cycler 2.0 de monsternamen en posities onder de monstergegevens. Label vóór het starten van de analyse de negatieve controles en de genotypen van de smeltstandaarden. Start de smeltanalyse door analyse te selecteren, genotypering te kiezen onder smeltkurveanalyse en op OK te drukken.

Om de gevoeligheid van de automatische groepering te verhogen, selecteert u alle monsters zodat deze in het plot van de smeltcurves worden weergegeven. Verschuif de normalisatiebalk naar de bovenste grens van de smeltpieken van de probes. Controleer of de monsters correct zijn gegroepeerd door elke groep onder de groepsnaam individueel te selecteren.

Exporteer de genotypen voor elk monster door alle monsters te selecteren, de gegevens te kopiëren en deze in een werkblad te plakken. De grafiek van de negatieve afgeleide van de genormaliseerde fluorescentie ten opzichte van de temperatuur is doorgaans de meest directe manier om smeltpieken te visualiseren en genotypen te bepalen. Door het analysevenster in te stellen op alleen een probe-regio, ontstaat een duidelijke differentiatie van pieken die overeenkomen met specifieke SNP's.

Perfecte matches resulteren in hogere smeltpieken, aangegeven in het rood. SNP-mismatches hebben lagere smelttemperaturen, aangegeven in het grijs wanneer beide allelen in een monster aanwezig zijn. Prob-gebaseerde HRM-analyse representeert beide allelen als twee piekcurves in het oranje, waarbij pieken die overeenkomen met enkelvoudige allelmonsters in het rood en grijs worden weergegeven; het progressief verlagen van de smelttemperatuur tijdens amplificatie resulteert in een bias richting het mutante allel, gerepresenteerd door de linkerpiek in een poly-genomisch of poly-allelisch monster.

Deze amplificatiebias van het mutante allel resulteert in een HRM-gevoeligheid waarmee minderheidsallelen die in minder dan 1% voorkomen in polygenomische of polyallellische monsters kunnen worden gedetecteerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de monsterkwaliteit essentieel is. Kleine verschillen in buffconcentraties kunnen de HRM-curves verschuiven.

Het gebruik van controles is een nuttige manier om resultaten te standaardiseren. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u probe-gebaseerde asymmetrische PCR en mutant allel amplificatiebias kunt gebruiken om malaria SNP's uit diverse monstertypes nauwkeurig en sensitief te genotyperen.