Het toepassen van een induceerbare Expression Systeem om interferentie van bacteriële virulentiefactoren met intracellulaire signalering Studie

Het algemene doel van het volgende experiment is om de interferentie van bacteriële virulentiefactoren met intracellulaire signalering te bestuderen. Dit wordt bereikt door stabiele cellijnen te vestigen die het eiwit van belang tot expressie brengen. Om de activiteit op bulkcelniveau te bestuderen, wordt in een tweede stap een induceerbaar expressievectorsysteem gemaakt, waarmee een signaleringscascade van de gastheercel in een gedefinieerde stap kan worden geactiveerd. Vervolgens wordt geanalyseerd of het eiwit van belang kan interfereren met de activatie van de signaleringscascade van de gastheercel om het punt van activiteit van het betreffende eiwit te preciseren; de resultaten tonen op basis van western blotting-analyse aan dat de virulentiefactor KA B van cozy yellow Burnett interfereert met de apoptotische cascade stroomafwaarts van backs en stroomopwaarts van de activatie van cascade drie.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van de infectiebiologie, zoals het identificeren van de cruciale stap in een signaaltransductiecascade waarbij een specifiek bacterieel effectorproteïne interfereert. Dit zal ons niet alleen helpen om beter te begrijpen hoe pathogene micro-organismen hun gastheren manipuleren, maar ook hoe deze fundamentele cellulaire processen functioneren. Hoewel deze methode inzicht kan bieden in bacteriële strategieën om apoptotische celdood te voorkomen, kan zij ook worden toegepast op andere signaaltransductiesystemen binnen het veld van de celdood, zoals oncose of pyroptose, of op signaleringsnetwerken die betrokken zijn bij celproliferatie, genregulatie of reacties van het immuunsysteem.

Deze procedure zal worden gedemonstreerd door Stephanie Besler, een promovendus uit het laboratorium van Mann. Begin deze procedure door HEK 2 93-cellen die GFP of GFP, say B stabiel tot expressie brengen, uit te platen in een 12-wells plaat met een dichtheid van 100 000 cellen per well.

Bereid vervolgens DNA en polyethyleen-transfectiereagens afzonderlijk voor in 75 µL opt-medium en laat dit vijf minuten bij kamertemperatuur incuberen voor complexvorming. Incubeer beide mengsels vervolgens samen gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Voeg daarna de polyethyleen-DNA-oplossing druppelgewijs toe aan de cellen en incubeer bij 37 °C in 5% CO2.

Induceer vijf uur na transfectie de expressie van de pro-apoptotische eiwitten door één microgram per milliliter doxycycline aan het kweekmedium toe te voegen. Incubeer de cellen vervolgens gedurende 18 uur bij 37 °C in 5% CO₂ onder de lichtmicroscoop. Inspecteer de cellen op de inductie van celdood voordat u ze oogst.

Onderzoek de geïnduceerde apoptotische cellen, die detecteerbaar zijn door de aanwezigheid van apoptotische lichamen. Verwijder vervolgens het supernatant en was de gehechte cellen. Was één keer met warm PBS en resuspendeer de cellen in 100 µL van twee x Laemmli-monsterbuffer.

Verwarm vervolgens gedurende vijf minuten bij 95 °C en bewaar het daarna bij -20 °C voor later gebruik. Laad daarna zes µL van een commerciële eiwitladder als molecuulgewichtsmarker. Laad vervolgens ongeveer 40.000 cellen per monster op een 12% SDS-PAGE-gel.

Run de gels in een gelelektroforesesysteem bij een constante spanning van 180 volt gedurende 45 tot 60 minuten met een eenvoudige laly-loopbuffer. Breng de eiwitten vervolgens over op PVDF-membranen bij een constante spanning van 16 volt gedurende 60 minuten. Gebruik hiervoor een trans blot SD semi-droge transfercel en blok vervolgens de membranen in 10 milliliter MPT gedurende één uur bij kamertemperatuur.

Verdun zeven µL anti-cleaved PARP-antilichaam in zeven mL MPT. Incubeer het PVDF-membraan gedurende de nacht bij vier °C met de antilichaamoplossing. Verwijder de antilichaamoplossing en voer drie wasbeurten van 10 minuten uit met PBS 0,05% Tween 20. Incubeer de membranen na de incubatie gedurende één uur bij kamertemperatuur met 1,4 µL mierikrootperoxidase-geconjugeerde secundaire antilichamen, verdund in zeven mL MPT.

Was de membranen drie keer met PBS 0,05% Tween 20 en detecteer de mierikwortelperoxidase-activiteit met een commerciële kit volgens het protocol van de fabrikant. Gebruik vervolgens standaardapparatuur voor filmontwikkeling om de eiwitbanden te visualiseren. Verwijder daarna de gebonden antilichamen door de membranen na drie wasbeurten met PBS 0,05% Tween 20 gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur te incuberen met zeven milliliter western blot stripping buffer; probeer de membranen vervolgens overnacht bij vier graden Celsius met vier microliter anti-actine-antilichaam in vier milliliter MPT.

Voer de volgende dag drie wasstappen van 10 minuten uit op de membranen met ongeveer 10 milliliter PBS 0,05% Tween 20, en incubeer de membranen vervolgens met 1,4 microliter peroxidase-geconjugeerde secundaire antilichamen uit mierikruid, verdund in zeven milliliter MPT. Na een incubatietijd van één uur bij kamertemperatuur worden de membranen drie keer gewassen met PBS 0,05% Tween 20. Detecteer de mierikruidperoxidase-activiteit met een commerciële kit en gebruik standaardapparatuur voor filmontwikkeling om de eiwitbanden te visualiseren. In dit experiment werden whole cell lysates van HEK 2 93 GFP- en HEK 2 93 GFP sabe-cellen ge-immunoblot voor GFP om stabiele expressie aan te tonen.

De representatieve flowcytometrie-analyse van HEK 2 93 GFP- en HEK 2 93 GFP sabe-cellen toont de intensiteit van de GFP-expressie. HEK 2 93 GFP- en HEK 2 93 GFP sabe-cellen werden gedurende zes uur behandeld met vier micromolair sporin om intrinsieke apoptose te induceren. Apoptose werd geanalyseerd via een cleaved PARP immuno-blot-analyse, waarbij werd vastgesteld dat de PARP-splitsing in HK 2 9 3 GFP SA B-cellen afnam in vergelijking met HK 2 93 GFP-cellen.

CB beschermt tegen bax-geïnduceerde apoptose, maar niet tegen caspase-3-geïnduceerde apoptose. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om zoveel mogelijk componenten van de signaleringsroute te onderzoeken om te helpen de interactiestap te identificeren. Het is daarnaast raadzaam om eiwitten te testen die geactiveerd worden in zowel hun rusttoestand als hun geactiveerde toestand, om te bepalen of het gekozen effector-eiwit interfereert met de route zelf, of juist met de activatiestap na deze procedure.

Andere methoden, zoals knockdown, knockout, yeast two-hybrid pull-down, analyses van posttranslationele modificaties of proteolytische stabiliteitsassays, kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals: wat zijn de exacte moleculaire mechanismen die deze microbiële effectoren gebruiken om de normale fysiologie van de gastheercel te manipuleren? En hoe draagt dit bij aan het overleven en de verspreiding van het pathogeen?