Het toepassen van een induceerbare Expression Systeem om interferentie van bacteriële virulentiefactoren met intracellulaire signalering Studie
June 25th, 2015
De hier beschreven methode wordt gebruikt om de apoptotische signaleringskaskade te induceren in gedefinieerde stappen om de activiteit van een anti-apoptotisch bacterieel effector-eiwit te onderzoeken. Deze methode kan ook worden gebruikt voor inductieve expressie van pro-apoptotische of toxische eiwitten, of voor het onderzoeken van interferentie met andere signaalwegen.
Het algemene doel van het volgende experiment is om interferentie van bacteriële virulentiefactoren met intracellulair signaalgedrag te bestuderen. Dit wordt bereikt door stabiele cellijnen te creëren, die het eiwit van belang tot expressie brengen. Om de activiteit ervan op bulkcelniveau te bestuderen als tweede stap, wordt een induceerbaar expressievectorsysteem gemaakt, dat het activeren van een gastheercelsignaalcascade op een gedefinieerd punt mogelijk maakt. Vervolgens wordt geanalyseerd of het eiwit van belang kan interfereren met de activering van de gastheercelsignaalcascade om het actiepunt van het eiwit van belang te beperken, de resultaten tonen dat de cozy yellow Burnett virulentiefactor KA B interfereert met de apoptotische cascade stroomafwaarts van backs en stroomopwaarts van cascade drie activering op basis van western blotting-analyse.
Deze methode kan helpen om belangrijke vragen op het gebied van infectieuze biologie te beantwoorden, zoals het identificeren van de sleutelstap in een signaaltransductiecascade waarop een bepaald bacterieel effectoreiwit interfereert. Dit zal ons niet alleen helpen beter te begrijpen hoe pathogene micro-organismen hun gastheren manipuleren, maar ook hoe deze basale cellulaire processen functioneren. Hoewel deze methode inzicht kan geven in bacteriële strategieën om apoptotische celdood te voorkomen, kan deze ook worden toegepast op andere signaaltransductiesystemen op het gebied van celdood, zoals ons of pyro ptose, of ook op signaalnetwerken die betrokken zijn bij celproliferatie, genexpressie of reacties door het immuunsysteem.
Demonstratie van deze procedure zal worden gedaan door Stephanie Besler, een afgestudeerde student van het laboratorium van Mann. Begin deze procedure door HEK 2 93 cellen die stabiel GFP of GFP, zeggen B, uitdrukken, in een 12-wellplaat te zaaien met een dichtheid van 100.000 cellen per well.
Bereid vervolgens DNA en polyethyleen gemiddeld transfectie reagens afzonderlijk in 75 microliters opt medium en incubeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur voor complexvorming. Incubeer beide mengsels samen gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Voeg daarna de polyethyleen DNA-oplossing druppelsgewijs toe aan de cellen en incubeer bij 37 graden Celsius in 5% koolstofdioxide.
Vijf uur na transfectie induceert u de expressie van de pro-apoptotische eiwitten door één microgram per milliliter doxycycline toe te voegen aan het kweekmedium. Incubeer vervolgens de cellen gedurende 18 uur bij 37 graden Celsius in 5% koolstofdioxide onder een lichtmicroscoop. Inspecteer de cellen op inductie van celdood voorafgaand aan het oogsten.
Onderzoek de geïnduceerde apoptotische cellen, die detecteerbaar zijn door de aanwezigheid van apoptotische lichamen. Verwijder vervolgens het supernatant en was de gehechte cellen. Was de cellen eenmaal met warm PBS en suspendeer ze in 100 microliters van twee x lamby monsterbuffer.
Verwarm gedurende vijf minuten op 95 graden Celsius en bewaar vervolgens voor later gebruik bij min 20 graden Celsius. Laad vervolgens zes microliter van een commerciële eiwitladder als molecuulgewichtmarker. Laad vervolgens ongeveer 40.000 cellen per monster op een 12%SDS paginagel.
Laat de gels draaien in een gelelektroforesesysteem onder een constante spanning van 180 volt gedurende 45 tot 60 minuten met een x laly-loopbuffer. Breng vervolgens de eiwitten over op PVDF-membranen bij een constante spanning van 16 volt gedurende 60 minuten. Gebruik een trans blot SD semi-dry transfercel, blokkeer vervolgens de membranen in 10 milliliter MPT gedurende een uur bij kamertemperatuur.
Verdun zeven microliter van anti-gesplitst PARP-antilichaam in zeven milliliter MPT. Incubeer het PVDF-membraan met de antilichaamoplossing gedurende een nacht bij vier graden Celsius. Verwijder de antilichaamoplossing en voer drie 10 minuten wasbeurten uit met PBS 0,05% Tween 20, incubeer de membranen met 1,4 microliter paardenradijsperoxidase geconjugeerd secundair antilichaam verdund in zeven milliliter MPT gedurende een uur bij kamertemperatuur na de incubatie.
Was de membranen drie keer met PBS 0,05% Tween 20, detecteer paardenradijsperoxidase-activiteit met een commercieel kit volgens het protocol van de fabrikant. En gebruik standaardapparatuur voor filmontwikkeling om de eiwitbanden zichtbaar te maken. Verwijder vervolgens gebonden antilichamen door de membranen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in te kweken met zeven milliliter western blot stripbuffer na drie wasbeurten met PBS 0,05% Tween 20, probeer de membranen met vier microliter van anti-actine antilichaam in vier milliliter MPT gedurende een nacht bij vier graden Celsius.
De volgende dag voert u drie 10 minuten wasbeurten uit op de membranen met ongeveer 10 milliliter PBS 0,05% Tween 20, incubeer vervolgens de membranen met 1,4 microliter paardenradijsperoxidase geconjugeerd secundair antilichaam verdund in zeven milliliter MPT Na een uur incubatie bij kamertemperatuur. Was de membranen drie keer met PBS 0,05% Tween 20, detecteer paardenradijsperoxidase-activiteit met een commercieel kit en gebruik standaardapparatuur voor filmontwikkeling om eiwitbanden zichtbaar te maken. In dit experiment werden hele cellysaten van HEK 2 93 GFP en HEK 2 93 GFP sabe cellen geïmmunoblot voor GFP om stabiele expressie te tonen.
De representatieve flowcytometrieanalyse van HEK 2 93 GFP en HEK 2 93 GFP sabe cellen toont de intensiteit van de GFP-expressie. HEK 2 93 GFP en HEK 2 93 GFP sabe cellen werden behandeld met vier micromolar sporin gedurende zes uur om intrinsieke apoptose te induceren. Apoptose werd geanalyseerd door gesplitst PARP immunoblotanalyse waarin PARP-splitsing werd gevonden om af te nemen in HK 2 9 3 GFP SA B cellen in vergelijking met HK 2 93 GFP cellen.
CB beschermt tegen bax-geïnduceerde apoptose, maar niet tegen caspase drie-geïnduceerde apoptose. Bij het implementeren van deze procedure is het belangrijk om zoveel mogelijk componenten van de signaalroute te onderzoeken om de interactiestap te identificeren. Het is ook goed om eiwitten te testen die zowel in hun grond- als geactiveerde toestand
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie onderzoekt hoe bacteriële virulentiefactoren interfereren met intracellulaire signaalroutes, met bijzondere aandacht voor apoptotische signaalcascades. Door gebruik te maken van induceerbare expressiesystemen, kunnen onderzoekers de activiteit van specifieke eiwitten en hun effecten op signaalroutes in gastcellen onderzoeken.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Celsignaaloverdracht
- Bacteriele pathogenese
- Apoptose
Achtergrond
- Het begrijpen van bacteriële manipulatie van gastcellenprocessen is cruciaal voor infectiebiologie.
- Apoptotische signaalroutes zijn belangrijke doelen voor bacteriële effectoreiwitten.
- Het identificeren van interferentiepuntjes kan mechanismen van pathogeniteit onthullen.
- Deze methode kan ook worden toegepast op andere celdoodroutes en signaalnetwerken.
Doel van de studie
- Om de interferentie van bacteriële eiwitten met signaalroutes in gastcellen te analyseren.
- Om specifieke stappen in apoptotische signaalroutes te identificeren die worden beïnvloed door bacteriële virulentiefactoren.
- Om het begrip te verbeteren van hoe pathogenen gastverdediging ontwijken.
Gebruikte methoden
- Opzetten van stabiele cellijnen die het eiwit van belang tot expressie brengen.
- Creëren van een induceerbaar expressievectorsysteem.
- Activering van signaalroutes in gastcellen op gedefinieerde stappen.
- Western blotting-analyse om interferentie met apoptotische signaalroutes te beoordelen.
Belangrijkste resultaten
- De Burnett-virulentiefactor KA B interfereert met de apoptotische cascade.
- Interferentie vindt plaats stroomafwaarts van specifieke signaalcomponenten.
- De resultaten geven inzicht in de mechanismen van bacteriële virulentie.
- De methodologie kan worden aangepast voor het bestuderen van andere signaalroutes.
Conclusies
- Deze methode is effectief voor het onderzoeken van bacteriële interferentie in signaalroutes.
- De bevindingen dragen bij aan het begrip van pathogene strategieën.
- Potentiële toepassingen reiken uit tot verschillende celdood- en signaalmechanismen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Dissecting the precise step at which bacterial virulence factors interfere with host intracellular signaling is critical for target validation and mechanistic de-risking in infectious disease drug discovery. This inducible expression system enables functional mapping of protein or small molecule effects within defined signaling cascades, supporting predictive confidence in early-stage portfolio decisions. The approach is directly relevant for prioritizing anti-virulence strategies and clarifying host-pathogen interaction mechanisms.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of therapeutic hypotheses by pinpointing effector action within signaling pathways.
- Supports biological de-risking by clarifying whether targets act upstream or downstream of key pathway nodes.
- Facilitates functional target validation through inducible, step-specific pathway activation.
- Improves predictive confidence for advancing anti-infective candidates.
Screening & Assay Development
- Prepares validated cellular systems for downstream screening of bacterial effectors or small molecules.
- Standardizes pathway activation and readout conditions for reproducible quantitative analysis.
- Enables robust comparison of compound or protein effects at defined signaling steps.
- Supports scalable assay development for high-content screening platforms.
Translational & Preclinical Research
- Aligns mechanistic findings with disease-relevant host-pathogen interactions.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation of anti-virulence strategies.
- De-risks translational advancement by clarifying molecular mechanisms of host manipulation.
- Supports biomarker identification for pathway-specific intervention points.
Pipeline & Workflow Integration
This inducible system integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies to lead identification and preclinical validation of anti-infective agents.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway mapping for bacterial effector proteins.
- Screening: Provides reproducible, quantitative readouts for comparing intervention effects at specific signaling nodes.
- Analytics: Enables statistical analysis of pathway inhibition or activation using immunoblot and flow cytometry outputs.
- Translational Research: Bridges mechanistic insights to preclinical models of host-pathogen interaction.
- Enterprise Reuse: Offers a modular platform adaptable to diverse signaling pathways and effector classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible workflows for pathway interrogation.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by clarifying intervention points.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of anti-virulence and host-targeted strategies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in inducible expression systems and cell signaling analysis.
- Needs access to cell culture, transfection, and immunoblotting infrastructure.
- Demands cross-team standardization of pathway activation and readout protocols.
- Adaptable to various cell lines and signaling pathways with appropriate validation.
- Dependent on availability of well-characterized pathway components and quantitative assays.
