Name: Het toepassen van een induceerbare Expression Systeem om interferentie van bacteriële virulentiefactoren met intracellulaire signalering Studie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Leer hoe bacteriële virulentiefactoren interfereren met intracellulaire signaaltransductie via een induceerbaar expressiesysteem. Deze methode onthult mechanismen van pathogene manipulatie van gastheercellen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) via de Collaborative Research Initiative 796 (SFB796) aan A.L. en C.B., en via de ERA-NET PathoGenoMics 3de oproep aan A.L.

1. Het genereren van stabiele cellijnen die het beoogde eiwit <ol><li> Bereid media door het toevoegen van warmte geïnactiveerd FCS en 1% penicilline / streptomycine commercieel verkrijgbaar Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met GlutaMAX-I, pyruvaat, en 4,5 g / l D-glucose. </li><li> Ontwikkel HEK293 cellen in medium bij 37 ° C in 5% CO 2. Sub-kweken cellen elke derde dag. Verwijder het medium en resuspendeer de cellen in 15 ml vers medium. Pipetteer 1 ml in een nieuwe 75 cm 2 celkweek kolf en voeg 14 ml media. </li><li> Analyseer het aantal cellen met een hemocytometer. </li><li> Seed HEK293 cellen in een 6-wells plaat met een dichtheid van 2 x 10 5 cellen per putje en incubeer 24 uur. </li><li> Voor transfectie gebruiken protocol van de fabrikant van het transfectie reagens. Transfecteren van cellen met pEGFP-C2 of pEGFP-C2-CAEB met de transfectie-reagens. Voor gebruik warmen de transfectie Reagent en de vereiste RT media. Met een 3: 1 verhouding van transfectiereagens tot DNA. <ol><li> In detail Pipetteer 1,5 ui transfectie reagens direct in 50 gl serumvrij DMEM medium. Bij complexvorming, pipet 0,5 ug DNA dat codeert GFP of GFP-CAEB de transfectie-reagens dat mengsel en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Transfecteren cellen door toevoeging van het reactiemengsel in een druppelsgewijze wijze en incubeer bij 37 ° C in 5% CO2 gedurende 24 uur. </li></ol></li><li> Voeg 1 mg / ml geneticine voor selectie van GFP-positieve klonen bij 37 ° C in 5% CO 2. </li><li> Na 6 dagen isoleren enkele cellen door flow cytometrie sorteren in een 96-putjesplaat herbergen medium en HEK293 supernatant in een 1: 1 ratio. Genereer HEK293 supernatant uit gekweekte confluente HEK293 cellen die gedurende 15 minuten bij 4966 x g gecentrifugeerd. </li><li> Op de volgende dag vervangen door kweekmedium met medium dat 1,50; mg / ml geneticine. Verander een keer per week media. Indien de cellen vormen confluente monolaag, overbrengen naar een 24-wells plaat. Sub-kweken cellen tweemaal per week in een verhouding van 1: 5 in medium dat 1,5 mg / ml geneticine. Tenslotte analyseert het percentage GFP-positieve cellen door immunoblot-analyse en flowcytometrie. </li></ol> 2. Analyse van stabiele cellijnen door immunoblotanalyse <ol><li> Verwijder de supernatant en was de aangehechte cellen eenmaal met warm PBS. Resuspendeer de cellen in 100 gl 2 x Laemmli-monsterbuffer, verwarm gedurende 5 minuten bij 95 ° C en bewaar bij -20 ° C. </li><li> Laad ca. 4 x 10 4 cellen per monster op een 12% SDS-PAGE gel. Bovendien load 6 pi van een commercieel proteïneladder als molecuulgewichtsmerker. Run gels een gelelektroforese systeem onder een constante spanning van 180 V gedurende 45-60 min met 1 x Laemmli loopbuffer. </li><li> Blot eiwitten op PVDF-membranen (poriëngrootte van 0.45 pm) bij een constante spanning van 16 V gedurende 60 min onder toepassing van een Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell. </li><li> Block membranen in 10 ml van 5% niet vette droge melk in PBS / 0,05% Tween 20 (MPT) gedurende 1 uur bij KT. </li><li> Verdun 4 ui van anti-GFP antilichaam in 4 ml van MPT en membranen geïncubeerd O / N bij 4 ° C. </li><li> Voer drie wasstappen 10 minuten met 10 ml PBS / 0,05% Tween 20. </li><li> Incubeer membranen met 0,8 ul horseradish peroxidase-geconjugeerde secundaire antilichamen in 4 ml van MPT. </li><li> Na 1 uur incubatie bij KT, membranen driemaal wassen met PBS / 0,05% Tween 20 (zoals beschreven in 2.6) en detecteren mierikswortel peroxidase activiteit met een commerciële kit volgens het protocol van de fabrikant. Solliciteer standaard apparatuur voor film ontwikkeling eiwitbanden te visualiseren. </li></ol> 3. Analyseer de cellen met behulp van een flowcytometer. <ol><li> Resuspendeer cellen in PBS. Gebruik HEK293 cellen als negatieve controle naar voren te passen scatter (FSC) en zijwaartse verstrooiing (SSC), zodat de cellen op schaal. Teken een hek op levende cellen door exclusief cel wambuizen, aggregaten en celresten. </li><li> Pas de fotomultiplicatorbuis (PMT) winst, zodat de ongekleurde cellen aan de linkerkant van het histogram voor de FL1-kanaal (488 nm argon laser). </li><li> Om de fluorescentie-intensiteit van HEK293-GFP en HEK293-GFP-CAEB cellen te analyseren openen het histogram van de FL1-kanaal en het verwerven van 10.000 gebeurtenissen op de gated bevolking. </li><li> Analyseer de gegevens met behulp van FACS-analyse software. </li></ol> 4. Transfectie van de stabiele cellijn met de induceerbare expressie vectorsysteem <ol><li> Seed HEK293 cellen die stabiel tot expressie GFP of GFP-CAEB in een 12-wells plaat met een dichtheid van 1 x 10 5 cellen / putje. </li><li> 19 uur na het zaaien, co-transfecteren van de cellen met regulator plasmide en respons plasmide ofwel coderen Bax of geactiveerd caspase 3. <ol><li> Co-transfecteren van de stabiele HEK293 cellenmet 100 ng pWHE125-P regulator plasmide (figuur 2) en 100 ng van de plasmiden response pWHE655-hBax of pWHE655-revCasp3 (Figuur 3) en 0,4 pl polyethyleenimine. </li><li> Bereid de DNA en polyethyleenimine transfectiereagens elk in 75 pl Opti-MEM medium en incubeer gedurende precies 5 minuten bij kamertemperatuur. Bij complexvorming Incubeer beide mengsels samen 15 minuten bij kamertemperatuur. </li></ol></li><li> Voeg het polyethyleenimine / DNA-oplossing druppelsgewijs aan de cellen en incubeer bij 37 ° C in 5% CO 2. </li></ol> 5. Inductie van apoptose <ol><li> 5 uur na transfectie, induceren de expressie van pro-apoptotische eiwitten door toevoeging van 1 ug / ml doxycycline aan het cultuurmedium. Incubeer cellen gedurende 18 uur bij 37 ° C in 5% CO 2. </li></ol> 6. Analyse van de als gastheer gebruikte cel apoptose door immunoblotanalyse <ol><li> Inspecteer cellen voorafgaand aan harvesting onder de lichtmicroscoop te controleren op celdood inductie. Apoptotische cellen zijn detecteerbaar door de aanwezigheid van apoptotische lichamen rondom de stervende cel. </li><li> Verwijder de supernatant en was de aangehechte cellen eenmaal met warm PBS. Resuspendeer de cellen in 100 gl 2 x Laemmli-monsterbuffer, verwarm gedurende 5 minuten bij 95 ° C en bewaar bij -20 ° C. </li><li> Laad ca. 4 x 10 4 cellen per monster op een 12% SDS-PAGE gel. Bovendien load 6 pi van een commercieel proteïneladder als molecuulgewichtsmerker. Run gels een gelelektroforese systeem onder een constante spanning van 180 V gedurende 45-60 min met 1 x Laemmli loopbuffer. </li><li> Blot eiwitten op PVDF-membranen (poriegrootte 0,45 um) bij een constante spanning van 16 V gedurende 60 min onder toepassing van een Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell. </li><li> Block membranen in 10 ml van 5% niet vette droge melk in PBS / 0,05% Tween 20 (MPT) gedurende 1 uur bij KT. </li><li> Verdunnen 4 μl anti-gesplitste poly ADP-ribose polymerase (PARP) antilichaam in 4 ml van MPT en geïncubeerd O / N bij 4 ° C. </li><li> Voer drie wasstappen 10 minuten met 10 ml PBS / 0,05% Tween 20. </li><li> Incubeer membranen met 0,8 ul horseradish peroxidase-geconjugeerde secundaire antilichamen verdund in 4 ml MPT. </li><li> Na 1 uur incubatie bij KT, membranen driemaal wassen met PBS / 0,05% Tween 20 (zoals beschreven in 6.7) en detecteren mierikswortel peroxidase activiteit met een commerciële kit volgens het protocol van de fabrikant. Solliciteer standaard apparatuur voor film ontwikkeling eiwitbanden te visualiseren. </li><li> Verwijder gebonden antilichamen door 30 minuten incubatie bij kamertemperatuur met 7 ml Western Blot Stripping Buffer. </li><li> Na drie wasbehandelingen met PBS / 0,05% Tween 20 (zoals beschreven in 6.7), probe de membranen met 4 pl anti-actine antilichaam in 4 ml MPT O / N bij 4 ° C. </li><li> Na drie wasstappen met MPT (zoals in 6,7), incubeer de membranen met 0,8 gl horseradish peroxidase-geconjugeerde secundaire antilichamen verdund in 4 ml van MPT. </li><li> Na 1 uur incubatie bij KT, membranen driemaal wassen met PBS / 0,05% Tween 20 (zoals is beschreven in 6,7 en detecteren mierikswortel peroxidase activiteit met een commerciële kit volgens het protocol van de fabrikant. Toepassen standaarduitrusting film ontwikkeling eiwitbanden zichtbaar. Opmerking: alle incubatiestappen werden uitgevoerd op een plaat schudder gedurende de aangegeven tijd en temperatuur. </li></ol>

<ol><li>Galán, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+themes+in+the+design+and+function+of+bacterial+effectors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Common themes in the design and function of bacterial effectors.</a> Cell Host Microbe. 5 (6), 571-579 (2009).</li>
<li>Banga, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Legionella+pneumophila+inhibits+macrophage+apoptosis+by+targeting+pro-death+members+of+the+Bcl2+protein+family%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Legionella pneumophila inhibits macrophage apoptosis by targeting pro-death members of the Bcl2 protein family.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104 (12), 5121-5126 (2007).</li>
<li>Laguna, R. K., Creasey, E. A., Li, Z., Valtz, N., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Legionella+pneumophila-translocated+substrate+that+is+required+for+growth+within+macrophages+and+protection+from+host+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">A Legionella pneumophila-translocated substrate that is required for growth within macrophages and protection from host cell death.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103 (49), 18745-18750 (2006).</li>
<li>Schmid, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+translocated+bacterial+protein+protects+vascular+endothelial+cells+from+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">A translocated bacterial protein protects vascular endothelial cells from apoptosis.</a> PLoS Pathog. 2 (11), e115(2006).</li>
<li>Nogueira, C. V., Carey, K. L., Roy, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+pathogen-induced+apoptosis+by+a+Coxiella+burnetiitype+IV+effector+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Inhibition of pathogen-induced apoptosis by a Coxiella burnetiitype IV effector protein.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 107 (44), 18997-19001 (2010).</li>
<li>Rudel, T., Kepp, O., Kozjak-Pavlovic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+bacterial+pathogens+and+mitochondrial+cell+death+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Interactions between bacterial pathogens and mitochondrial cell death pathways.</a> Nat Rev Microbiol. 8 (10), 693-705 (2010).</li>
<li>Klingenbeck, L., Eckart, R. A., Berens, C., Lührmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Coxiella+burnetii+type+IV+secretion+system+substrate+CaeB+inhibits+intrinsic+apoptosis+at+the+mitochondrial+level%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The Coxiella burnetii type IV secretion system substrate CaeB inhibits intrinsic apoptosis at the mitochondrial level.</a> Cell Microbiol. 15 (4), 675-687 (2012).</li>
<li>Raymond, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subversion+of+trafficking%2C+apoptosis%2C+and+innate+immunity+by+type+III+secretion+system+effectors%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Subversion of trafficking, apoptosis, and innate immunity by type III secretion system effectors.</a> Trends Microbiol. 21 (8), 430-441 (2013).</li>
<li>Eckart, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiapoptotic+activity+of+Coxiella+burnetii+effector+protein+AnkG+is+controlled+by+p32-dependent+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Antiapoptotic activity of Coxiella burnetii effector protein AnkG is controlled by p32-dependent trafficking.</a> Infect Immun. 82 (7), 2763-2771 (2014).</li>
<li>Byrne, G. I., Ojcius, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlamydia+and+apoptosis%3A+life+and+death+decisions+of+an+intracellular+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Chlamydia and apoptosis: life and death decisions of an intracellular pathogen.</a> Nat Rev Microbiol. 2 (10), 802-808 (2004).</li>
<li>Delft, M. F., Huang, D. C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+the+Bcl-2+family+of+proteins+interact+to+regulate+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">How the Bcl-2 family of proteins interact to regulate apoptosis.</a> Cell Res. 16 (2), 203-213 (2006).</li>
<li>Willis, S. N., Adams, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+in+the+balance%3A+how+BH3-only+proteins+induce+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Life in the balance: how BH3-only proteins induce apoptosis.</a> Curr Opin Cell Biol. 17 (6), 617-625 (2005).</li>
<li>Shamas-Din, A., Kale, J., Leber, B., Andrews, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+action+of+Bcl-2+family+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of action of Bcl-2 family proteins.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (4), a008714(2013).</li>
<li>Cory, S., Adams, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Bcl2+family%3A+regulators+of+the+cellular+life-or-death+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">The Bcl2 family: regulators of the cellular life-or-death switch.</a> Nat Rev Cancer. 2 (9), 647-656 (2002).</li>
<li>Adams, J. M., Cory, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosomes%3A+engines+for+caspase+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Apoptosomes: engines for caspase activation.</a> Curr Opin Cell Biol. 14 (6), 715-720 (2002).</li>
<li>Suzuki, J., Denning, D. P., Imanishi, E., Horvitz, H. R., Nagata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xk-related+protein+8+and+CED-8+promote+phosphatidylserine+exposure+in+apoptotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Xk-related protein 8 and CED-8 promote phosphatidylserine exposure in apoptotic cells.</a> Science. 341 (6144), 403-406 (2013).</li>
<li>Cory, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+throes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Cell death throes.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 95 (21), 12077-12079 (1998).</li>
<li>Enari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+caspase-activated+DNase+that+degrades+DNA+during+apoptosis%2C+and+its+inhibitor+ICAD%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A caspase-activated DNase that degrades DNA during apoptosis, and its inhibitor ICAD.</a> Nature. 391 (6662), 43-50 (1998).</li>
<li>Fussenegger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+mammalian+gene+regulation+concepts+on+functional+genomic+research%2C+metabolic+engineering%2C+and+advanced+gene+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Prog%22%5BJournal%5D)">The impact of mammalian gene regulation concepts on functional genomic research, metabolic engineering, and advanced gene therapies.</a> Biotechnol Prog. 17 (1), 1-51 (2001).</li>
<li>Felsher, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversibility+of+oncogene-induced+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Reversibility of oncogene-induced cancer.</a> Curr Opin Genet Dev. 14 (1), 37-42 (2004).</li>
<li>Maherali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-efficiency+system+for+the+generation+and+study+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A high-efficiency system for the generation and study of human induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3 (3), 340-345 (2008).</li>
<li>Kozlova, E. N., Berens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guiding+differentiation+of+stem+cells+in+vivo+by+tetracycline-controlled+expression+of+key+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Guiding differentiation of stem cells in vivo by tetracycline-controlled expression of key transcription factors.</a> Cell Transplant. 21 (12), 2537-2554 (2012).</li>
<li>Reijmers, L., Mayford, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+control+of+active+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetic control of active neural circuits.</a> Front Mol Neurosci. 2, 27(2009).</li>
<li>Gossen, M., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+control+of+gene+expression+in+mammalian+cells+by+tetracycline-responsive+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 89 (12), 5547-5551 (1992).</li>
<li>Hillen, W., Berens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+underlying+expression+of+Tn10+.encoded+tetracycline+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms underlying expression of Tn10 .encoded tetracycline resistance.</a> Annu Rev Microbiol. 48, 345-369 (1994).</li>
<li>Deuschle, U., Meyer, W. K., Thiesen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetracycline-reversible+silencing+of+eukaryotic+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tetracycline-reversible silencing of eukaryotic promoters.</a> Mol Cell Biol. 15 (4), 1907-1914 (1995).</li>
<li>Robertson, A., Perea, J., Tolmachova, T., Thomas, P. K., Huxley, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+mouse+strain%2C+position+of+integration+and+tetracycline+analogue+on+the+tetracycline+conditional+system+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Effects of mouse strain, position of integration and tetracycline analogue on the tetracycline conditional system in transgenic mice.</a> Gene. 282 (1-2), 65-74 (2002).</li>
<li>Gossen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+activation+by+tetracyclines+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells.</a> Science. 268 (5218), 1766-1769 (1995).</li>
<li>Rang, A., Will, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tetracycline-responsive+promoter+contains+functional+interferon-inducible+response+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The tetracycline-responsive promoter contains functional interferon-inducible response elements.</a> Nucleic Acids Res. 28 (5), 1120-1125 (2000).</li>
<li>Freundlieb, S., Schirra-Müller, C., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tetracycline+controlled+activation%2Frepression+system+with+increased+potential+for+gene+transfer+into+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gene+Med%22%5BJournal%5D)">A tetracycline controlled activation/repression system with increased potential for gene transfer into mammalian cells.</a> J Gene Med. 1 (1), 4-12 (1999).</li>
<li>Knott, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+conditional+suicide+switch+using+doxycycline-dependent+expression+of+human+tBid%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biol+Ther%22%5BJournal%5D)">An optimized conditional suicide switch using doxycycline-dependent expression of human tBid.</a> Cancer Biol Ther. 4 (5), 532-536 (2005).</li>
<li>Danilchanka, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+outer+membrane+channel+protein+of+Mycobacterium+tuberculosis+with+exotoxin+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">An outer membrane channel protein of Mycobacterium tuberculosis with exotoxin activity.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 111 (18), 6750-6755 (2014).</li>
<li>Danke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adjusting+transgene+expression+levels+in+lymphocytes+with+a+set+of+inducible+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gene+Med%22%5BJournal%5D)">Adjusting transgene expression levels in lymphocytes with a set of inducible promoters.</a> J Gene Med. 12 (6), 501-515 (2010).</li>
<li>Maueröder, C., Chaurio, R. A., Platzer, S., Munoz, L. E., Berens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+systems+for+rapid+and+slow+induction+of+apoptosis+obtained+by+inducible+expression+of+pro-apoptotic+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Autoimmunity%22%5BJournal%5D)">Model systems for rapid and slow induction of apoptosis obtained by inducible expression of pro-apoptotic proteins.</a> Autoimmunity. 46 (5), 329-335 (2013).</li>
<li>Srinivasula, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+constitutively+active+recombinant+caspases-3+and+-6+by+rearrangement+of+their+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Generation of constitutively active recombinant caspases-3 and -6 by rearrangement of their subunits.</a> J Biol Chem. 273 (17), 10107-10111 (1998).</li>
<li>Baron, U., Freundlieb, S., Gossen, M., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-regulation+of+two+gene+activities+by+tetracycline+via+a+bidirectional+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Co-regulation of two gene activities by tetracycline via a bidirectional promoter.</a> Nucleic Acids Res. 23 (17), 3605-3606 (1995).</li>
<li>Anastassiadis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+predictable+ligand+regulated+expression+strategy+for+stably+integrated+transgenes+in+mammalian+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">A predictable ligand regulated expression strategy for stably integrated transgenes in mammalian cells in culture.</a> Gene. 298 (2), 159-172 (2002).</li>
<li>Qu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homogeneity+and+long-term+stability+of+tetracycline-regulated+gene+expression+with+low+basal+activity+by+using+the+rtTA2S-M2+transactivator+and+insulator-flanked+reporter+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Homogeneity and long-term stability of tetracycline-regulated gene expression with low basal activity by using the rtTA2S-M2 transactivator and insulator-flanked reporter vectors.</a> Gene. 327 (1), 61-73 (2004).</li>
<li>Spencer, S. L., Gaudet, S., Albeck, J. G., Burke, J. M., Sorger, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-genetic+origins+of+cell-to-cell+variability+in+TRAIL-induced+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Non-genetic origins of cell-to-cell variability in TRAIL-induced apoptosis.</a> Nature. 459 (7245), 428-432 (2009).</li>
<li>Agha-Mohammadi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second-generation+tetracycline-regulatable+promoter%3A+repositioned+tet+operator+elements+optimize+transactivator+synergy+while+shorter+minimal+promoter+offers+tight+basal+leakiness%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gene+Med%22%5BJournal%5D)">Second-generation tetracycline-regulatable promoter: repositioned tet operator elements optimize transactivator synergy while shorter minimal promoter offers tight basal leakiness.</a> J Gene Med. 6 (7), 817-828 (2004).</li>
<li>Pluta, K., Luce, M. J., Bao, L., Agha-Mohammadi, S., Reiser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+control+of+transgene+expression+by+lentivirus+vectors+containing+second-generation+tetracycline-responsive+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gene+Med%22%5BJournal%5D)">Tight control of transgene expression by lentivirus vectors containing second-generation tetracycline-responsive promoters.</a> J Gene Med. 7 (6), 803-817 (2005).</li>
<li>Hoffmann, A., Villalba, M., Journot, L., Spengler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+tetracycline-dependent+expression+vector+with+low+basal+expression+and+potent+regulatory+properties+in+various+mammalian+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A novel tetracycline-dependent expression vector with low basal expression and potent regulatory properties in various mammalian cell lines.</a> Nucleic Acids Res. 25 (5), 1078-1079 (1997).</li>
<li>Loew, R., Heinz, N., Hampf, M., Bujard, H., Gossen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+Tet-responsive+promoters+with+minimized+background+expression%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Improved Tet-responsive promoters with minimized background expression.</a> BMC Biotechnol. 10, 81(2010).</li>
<li>Heinz, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+and+transposon-based+tet-regulated+all-in-one+vectors+with+reduced+background+expression+and+improved+dynamic+range%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Retroviral and transposon-based tet-regulated all-in-one vectors with reduced background expression and improved dynamic range.</a> Hum Gene Ther. 22 (2), 166-176 (2011).</li>
<li>Toniatti, C., Bujard, H., Cortese, R., Ciliberto, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+progress+and+prospects%3A+transcription+regulatory+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Gene therapy progress and prospects: transcription regulatory systems.</a> Gene Ther. 11 (8), 649-657 (2004).</li>
<li>Ye, H., Fussenegger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+therapeutic+gene+circuits+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Synthetic therapeutic gene circuits in mammalian cells.</a> FEBS Lett. 588 (15), 2537-2544 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Vele pathogene bacteriën herbergen secretiesystemen afscheiden of translocatie van bacteriële effector eiwitten in de gastheercel. Deze effector eiwitten hebben het vermogen om processen en cascades in de gastheercel, waardoor de bacteriën om te overleven en repliceren hun intracellulaire niche. Inzicht in de biochemische activiteiten en de moleculaire mechanismen van de effector eiwitten zal helpen naar een beter begrip van de pathogeniteit en kunnen helpen om nieuwe therapeutische instrumenten voor de bestrijding van ...

De virulentie van vele Gram-negatieve bacteriële pathogenen is afhankelijk van gespecialiseerde secretie systemen om eukaryotische gastheercellen kapen. Bacteriën gebruiken dit secretiesystemen bacteriële virulentie eiwitten (effectoren) in de gastheercel injecteren van verschillende cellulaire en biochemische activiteiten te moduleren. De studie van effector eiwitten heeft niet alleen verstrekt opmerkelijk inzicht in de fundamentele aspecten van gastheer / pathogeen interacties, maar ook in de fundamentele biologie van eukaryote cellen 1. Modulatie van gastheercel apoptose is aangetoond dat een belangrijke virulentie mechanisme voor vele intracellulaire pathogenen en een aantal effector eiwitten moduleren van apoptose geïdentificeerd 2-9. Echter, de precieze moleculaire mechanisme ter blijven ongrijpbaar in veel gevallen. Apoptose is een vorm van geprogrammeerde celdood, speelt een belangrijke rol bij de immuunrespons op infectie 10. Twee belangrijke routes die leiden tot apoptosegeïdentificeerd: gericht op de mitochondria (intrinsieke apoptose) of directe transductie van het signaal via celdood receptoren in het plasmamembraan (extrinsieke apoptose). De intrinsieke of mitochondriën gemedieerde celdood wordt veroorzaakt door intracellulaire signalen en omvat de activering van Bax en Bak, twee pro-apoptotische leden van de Bcl-2 familie. Deze familie is samengesteld uit pro- en anti-apoptotische regulator eiwitten die celdood 11-14 regelen. Activering van apoptose leidt tot oligomerisatie van Bax en Bak gevolgd door achtereenvolgende permeabilisatie van het mitochondriale buitenste membraan, waardoor cytochroom C introductie in het cytoplasma. Cytochroom C afgifte initieert activering van de effector caspasen 3 en 7 tot activatie van caspase 9 in de apoptosoom 15. Dit leidt tot proteolyse van geselecteerde substraten die onder andere resulteert in de blootstelling van fosfatidylserine aan het celoppervlak 16 en maakt een speciaal DNase die ch fragmentenromatin 17,18. Om te bepalen waar in de apoptotische cascade individuele effector eiwit interfereert, een induceerbaar expressiesysteem werd toegepast 19. Regulerende systemen voor voorwaardelijke expressie van transgenen hebben een waardevol hulpmiddel bij het ​​analyseren van de functie van een eiwit in de cel of het belang ervan voor weefsel, orgaan en organisme ontwikkeling, evenals tijdens initiatie, progressie en het onderhoud van de ziekte 20-23 geweest. Gewoonlijk induceerbare systemen, zoals het Tet-systeem 24 hier toegepast, vormen een kunstmatige transcriptie-eenheid (zie figuur 1). Eén component is een kunstmatig ontwikkelde transcriptiefactor genaamd tTA (tetracycline-afhankelijke transcriptie activator), gevormd door fusie van de bacteriële transcriptie-repressor TetR 25 aan een zoogdierpatiënt eiwitdomein die transcriptionele activatie of silencing 24,26 bemiddelt. De tweede component is een hybridepromoter, aangeduid als TRE (tetracycline-responsief element), bestaande uit een eukaryotische minimale promoter, die ten minste een TATA-box en een transcriptie-initiatieplaats, verbonden met meerdere herhalingen van de cognate-DNA bindingsplaats voor TetR, tetO 24,25. De derde component is het natuurlijke ligand van TetR, tetracycline of een van zijn derivaten, zoals anhydrotetracycline en doxycycline 25. Na ligand toevoeging aan het kweekmedium, TetR verliest zijn affiniteit voor tetO en dissocieert van het TRE. Daardoor wordt transcriptie van het doelgen opgeheven. Transgene expressie kan derhalve worden strak gecontroleerd in een tijds- en dosisafhankelijke manier in zowel celkweek als bij dieren 20,23,24. Met tTA, transgenexpressie treedt constitutief, behalve bij aanwezigheid van een tetracycline. Dit kan een nadeel in de studie van cytotoxische of oncogene eiwitten omdat tetracycline moet eerst uit het systeem worden verwijderd, voordat transgene expression optreedt en het doeleiwit effecten op de cel kan worden gecontroleerd. Dit kan tijdrovend en niet altijd volledig, vooral in transgene dieren 27. Om deze beperking te pakken, een TetR mutant met een inverse reactie op de aanwezigheid van doxycycline werd gebruikt om een nieuwe transcriptiefactor genereren rtTA (reverse tTA) 28. Het bindt alleen aan de TRE en, tegelijkertijd, transcriptie activeert in aanwezigheid van doxycycline. Residuele lekkages van het systeem, dwz., Transgene expressie in de afwezigheid van TRE-gebonden transcriptiefactor, van hetzij (i) van positie-effecten op genomische integratieplaats, (ii) vanaf het TRE 29 zelf, of (iii) uit niet -specifieke binding van tTA / rtTA 28, werd door de opneming van een extra transcriptiesilencerdomein, genaamd TTS (tetracycline-afhankelijke transcriptionele geluiddemper) 30 aan het systeem. Het vormt een dubbele regulator vergeaeld rtTA (zie figuur 1).Bij afwezigheid van doxycycline, tts bindt aan TRE en actief wordt uitgeschakeld resterende transcriptie. In de aanwezigheid van doxycycline, tts dissocieert van TRE en rtTA bindt gelijktijdig induceren van expressie van het doelwitgen. Deze extra laag stringentie moet vaak zeer actieve cytotoxische eiwitten 31-34 expressie. Met deze strak dual-regulator systeem kan de apoptotische cascade bij een bepaalde stap waarbij wordt onderzocht of de gegeven effector eiwit kunnen interfereren met apoptose-inductie worden gestart. Deze werkwijze kan niet alleen worden gebruikt om de anti-apoptotische activiteit van bacteriële effector eiwitten te bestuderen, maar ook voor de induceerbare expressie van pro-apoptotische of toxische eiwitten of ontleden interferentie met andere signaalwegen.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>life technologies</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Biochrom</td><td>S0115</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>life technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>life technologies</td><td>51985</td><td></td></tr><tr><td>X-tremeGENE 9</td><td>Roche</td><td>6365752001</td><td></td></tr><tr><td>Geneticin</td><td>Roth</td><td>CP11.3</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenimine</td><td>Polyscienes</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td>Doxycycline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9891</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Cell</td><td>Bio-Rad</td><td>165-8000EDU</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell</td><td>Bio-Rad</td><td>170-3940</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler Prestained Protein Ladder</td><td>Thermo Scientific</td><td>26616</td><td></td></tr><tr><td>PVDF membrane</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>anti-GFP&nbsp;</td><td>life technologies</td><td>A6455</td><td></td></tr><tr><td>anti-cleaved PARP</td><td>BD Bioscience</td><td>611038</td><td></td></tr><tr><td>anti-actin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2066</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IgG (H+L)-HRPO</td><td>Dianova</td><td>111-035-062</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit IgG (H+L)-HRPO</td><td>Dianova</td><td>111-035-045</td><td></td></tr><tr><td>ECL Western Blotting Substrate</td><td>Thermo Scientific</td><td>32106</td><td></td></tr><tr><td>Restore Plus Western Blot Stripping Buffer</td><td>Thermo Scientific</td><td>46428</td><td></td></tr></tbody></table>

het toepassen van een induceerbare expression systeem om interferentie van bacteriële virulentiefactoren met intracellulaire signalering studie

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

De hier gepresenteerde techniek maakt het mogelijk om te analyseren welke stap een doeleiwit, of als alternatief een klein molecuul, een interactie aangaat met de componenten van een signaleringsroute. De werkwijze berust enerzijds op de induceerbare expressie van een specifiek eiwit aan een signalering gebeurtenis op een bepaalde en vooraf bepaalde stap in het geselecteerde signaalcascade te initiëren. Gelijktijdige expressie, anderzijds, van het gen van belang dan kan de onderzoeker om te beoordelen of de activiteit van het doeleiwit tot expressie stroomopwaarts of stroomafwaarts ligt van de signalering geïnitieerde gebeurtenis, afhankelijk van het uitlezen van de signaalroute die wordt verkregen. Hier werd de apoptotische cascade geselecteerd als een gedefinieerde signaleringsroute protocol functionaliteit te demonstreren. Pathogenen, zoals Coxiella burnetii, transloceren effector eiwitten die interfereren met menselijke celdood inductie in de gastheercel om bacteriële overleven in de cel en het bevorderen van hunverspreiding in het organisme. De C. burnetii effector eiwit CAEB effectief remt gastheercel dood na inductie van apoptose met UV-licht of met staurosporine. Om een ​​beperking van op welke stap CAEB interfereert met de verspreiding van het apoptotische signaal, werden geselecteerd eiwitten met een goed gekarakteriseerde pro-apoptotische activiteit tijdelijk in een doxycycline-induceerbare manier uitgedrukt. Als CAEB handelingen stroomopwaarts van deze eiwitten apoptose hinder ondervinden. Als CAEB handelt downstream, zal celdood worden geremd. De testeiwitten geselecteerd waren Bax, die optreedt ter hoogte van de mitochondria en caspase 3, dat het belangrijkste uitvoerder protease. CAEB verstoort celdood geïnduceerd door Bax expressie, maar niet caspase 3 expressie. CAEB dus samenwerkt met de apoptotische cascade tussen deze twee eiwitten.

Ten eerste, HEK293-cellijnen die stabiel het eiwit van belang (CAEB) als GFP-fusie-eiwit werden vastgesteld. Als controle werden HEK293-cellijnen die stabiel GFP ook gegenereerd. Expressie van GFP en GFP-CAEB werd gecontroleerd door immunoblot analyse. De representatieve immunoblot (Figuur 4A) toont stabiele en duidelijk detecteerbare expressie van GFP en GFP-CAEB. Echter, deze test niet bepalen of alle cellen tot expressie GFP of GFP-CAEB. Daarom werden de stabiel getransfecteerde HEK293 cellijnen gean...

De hier beschreven methode wordt gebruikt om de apoptotische signaleringskaskade te induceren in gedefinieerde stappen om de activiteit van een anti-apoptotisch bacterieel effector-eiwit te onderzoeken. Deze methode kan ook worden gebruikt voor inductieve expressie van pro-apoptotische of toxische eiwitten, of voor het onderzoeken van interferentie met andere signaalwegen.

Het toepassen van een induceerbare Expression Systeem om interferentie van bacteriële virulentiefactoren met intracellulaire signalering Studie

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de interferentie van bacteriële virulentiefactoren met intracellulaire signalering te bestuderen. Dit wordt bereikt door stabiele cellijnen te vestigen die het eiwit van belang tot expressie brengen. Om de activiteit op bulkcelniveau te bestuderen, wordt in een tweede stap een induceerbaar expressievectorsysteem gemaakt, waarmee een signaleringscascade van de gastheercel in een gedefinieerde stap kan worden geactiveerd. Vervolgens wordt geanalyseerd of het eiwit van belang kan interfereren met de activatie van de signaleringscascade van de gastheercel om het punt van activiteit van het betreffende eiwit te preciseren; de resultaten tonen op basis van western blotting-analyse aan dat de virulentiefactor KA B van cozy yellow Burnett interfereert met de apoptotische cascade stroomafwaarts van backs en stroomopwaarts van de activatie van cascade drie.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van de infectiebiologie, zoals het identificeren van de cruciale stap in een signaaltransductiecascade waarbij een specifiek bacterieel effectorproteïne interfereert. Dit zal ons niet alleen helpen om beter te begrijpen hoe pathogene micro-organismen hun gastheren manipuleren, maar ook hoe deze fundamentele cellulaire processen functioneren. Hoewel deze methode inzicht kan bieden in bacteriële strategieën om apoptotische celdood te voorkomen, kan zij ook worden toegepast op andere signaaltransductiesystemen binnen het veld van de celdood, zoals oncose of pyroptose, of op signaleringsnetwerken die betrokken zijn bij celproliferatie, genregulatie of reacties van het immuunsysteem.Deze procedure zal worden gedemonstreerd door Stephanie Besler, een promovendus uit het laboratorium van Mann. Begin deze procedure door HEK 2 93-cellen die GFP of GFP, say B stabiel tot expressie brengen, uit te platen in een 12-wells plaat met een dichtheid van 100 000 cellen per well.Bereid vervolgens DNA en polyethyleen-transfectiereagens afzonderlijk voor in 75 µL opt-medium en laat dit vijf minuten bij kamertemperatuur incuberen voor complexvorming. Incubeer beide mengsels vervolgens samen gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Voeg daarna de polyethyleen-DNA-oplossing druppelgewijs toe aan de cellen en incubeer bij 37 °C in 5% CO2.Induceer vijf uur na transfectie de expressie van de pro-apoptotische eiwitten door één microgram per milliliter doxycycline aan het kweekmedium toe te voegen. Incubeer de cellen vervolgens gedurende 18 uur bij 37 °C in 5% CO₂ onder de lichtmicroscoop. Inspecteer de cellen op de inductie van celdood voordat u ze oogst.Onderzoek de geïnduceerde apoptotische cellen, die detecteerbaar zijn door de aanwezigheid van apoptotische lichamen. Verwijder vervolgens het supernatant en was de gehechte cellen. Was één keer met warm PBS en resuspendeer de cellen in 100 µL van twee x Laemmli-monsterbuffer.Verwarm vervolgens gedurende vijf minuten bij 95 °C en bewaar het daarna bij -20 °C voor later gebruik. Laad daarna zes µL van een commerciële eiwitladder als molecuulgewichtsmarker. Laad vervolgens ongeveer 40.000 cellen per monster op een 12% SDS-PAGE-gel.Run de gels in een gelelektroforesesysteem bij een constante spanning van 180 volt gedurende 45 tot 60 minuten met een eenvoudige laly-loopbuffer. Breng de eiwitten vervolgens over op PVDF-membranen bij een constante spanning van 16 volt gedurende 60 minuten. Gebruik hiervoor een trans blot SD semi-droge transfercel en blok vervolgens de membranen in 10 milliliter MPT gedurende één uur bij kamertemperatuur.Verdun zeven µL anti-cleaved PARP-antilichaam in zeven mL MPT. Incubeer het PVDF-membraan gedurende de nacht bij vier °C met de antilichaamoplossing. Verwijder de antilichaamoplossing en voer drie wasbeurten van 10 minuten uit met PBS 0,05% Tween 20. Incubeer de membranen na de incubatie gedurende één uur bij kamertemperatuur met 1,4 µL mierikrootperoxidase-geconjugeerde secundaire antilichamen, verdund in zeven mL MPT.Was de membranen drie keer met PBS 0,05% Tween 20 en detecteer de mierikwortelperoxidase-activiteit met een commerciële kit volgens het protocol van de fabrikant. Gebruik vervolgens standaardapparatuur voor filmontwikkeling om de eiwitbanden te visualiseren. Verwijder daarna de gebonden antilichamen door de membranen na drie wasbeurten met PBS 0,05% Tween 20 gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur te incuberen met zeven milliliter western blot stripping buffer; probeer de membranen vervolgens overnacht bij vier graden Celsius met vier microliter anti-actine-antilichaam in vier milliliter MPT.Voer de volgende dag drie wasstappen van 10 minuten uit op de membranen met ongeveer 10 milliliter PBS 0,05% Tween 20, en incubeer de membranen vervolgens met 1,4 microliter peroxidase-geconjugeerde secundaire antilichamen uit mierikruid, verdund in zeven milliliter MPT. Na een incubatietijd van één uur bij kamertemperatuur worden de membranen drie keer gewassen met PBS 0,05% Tween 20. Detecteer de mierikruidperoxidase-activiteit met een commerciële kit en gebruik standaardapparatuur voor filmontwikkeling om de eiwitbanden te visualiseren. In dit experiment werden whole cell lysates van HEK 2 93 GFP- en HEK 2 93 GFP sabe-cellen ge-immunoblot voor GFP om stabiele expressie aan te tonen.De representatieve flowcytometrie-analyse van HEK 2 93 GFP- en HEK 2 93 GFP sabe-cellen toont de intensiteit van de GFP-expressie. HEK 2 93 GFP- en HEK 2 93 GFP sabe-cellen werden gedurende zes uur behandeld met vier micromolair sporin om intrinsieke apoptose te induceren. Apoptose werd geanalyseerd via een cleaved PARP immuno-blot-analyse, waarbij werd vastgesteld dat de PARP-splitsing in HK 2 9 3 GFP SA B-cellen afnam in vergelijking met HK 2 93 GFP-cellen.CB beschermt tegen bax-geïnduceerde apoptose, maar niet tegen caspase-3-geïnduceerde apoptose. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om zoveel mogelijk componenten van de signaleringsroute te onderzoeken om te helpen de interactiestap te identificeren. Het is daarnaast raadzaam om eiwitten te testen die geactiveerd worden in zowel hun rusttoestand als hun geactiveerde toestand, om te bepalen of het gekozen effector-eiwit interfereert met de route zelf, of juist met de activatiestap na deze procedure.Andere methoden, zoals knockdown, knockout, yeast two-hybrid pull-down, analyses van posttranslationele modificaties of proteolytische stabiliteitsassays, kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals: wat zijn de exacte moleculaire mechanismen die deze microbiële effectoren gebruiken om de normale fysiologie van de gastheercel te manipuleren? En hoe draagt dit bij aan het overleven en de verspreiding van het pathogeen?

applying-an-inducible-expression-system-to-study-interference

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Source: Berens, C. et al. Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates the use of an inducible expression system to identify where the bacterial effector protein CaeB disrupts the host apoptotic cascade. It outlines the steps for transfecting CaeB-expressing cells with a tetracycline-responsive system to induce pro-apoptotic gene expression in order to identify the point of...

Transfection of an Inducible Gene Expression System into Cells Expressing a Bacterial Effector Protein

Source: Berens, C. et al. Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates the use of immunoblotting to assess apoptosis inhibition by the bacterial effector protein CaeB in human cells. It outlines the steps for detecting apoptotic markers following doxycycline-induced expression of pro-apoptotic proteins in host cells expressing the effector.

Immunoblot Analysis of Apoptosis Inhibition in Host Cells Expressing an Antiapoptotic Bacterial Protein

This video describes the method of regulating gene expression in cultured cells by transfection with a plasmid containing a gene of interest and a regulatory plasmid. The expression of this plasmid can be controlled by tetracycline or its synthetic analogs, making this system a useful model to study regulatable gene expression.

Inducible Tet-Off Regulatable System: An In Vitro Method to Modulate Gene Expression in Cultured Cells Using Tetracycline-Off System

Deze techniek verschaft een werkwijze te oogsten, normaliseren en kwantificeren intracellulaire groei van bacteriële pathogenen die vooraf gekweekt in natuurlijke protozoa gastheercellen voor infecties van zoogdiercellen. Deze methode kan worden aangepast aan een grote verscheidenheid van gastheercellen voor de priming podium en doelcel types tegemoet.

Handelbaar Mammalian Cell Infecties met Protozoan-geprimed Bacteriën

Dit artikel illustreert het gebruik van puls-chase radio-labeling in combinatie met plaatsspecifiek fotocrosslinking om interacties te monitoren tussen een eiwit van belang en andere factoren in E. coli. In tegenstelling tot traditionele chemische cross-linking methoden, genereert deze aanpak hoge resolutie “momentopnamen” van een geordende assemblageroute in een levende cel.

Monitoring van de Assemblee van een afgescheiden virulentiewerd Factor behulp van Site-specifieke Crosslinking

Electroporatie werd gebruikt om gezuiverde bacteriële virulentie-effectoreiwitten direct in levende eukaryote cellen te insereeren. De lokalisatie van eiwitten werd bewaakt door confocale immunofluorescentiemicroscopie. Deze methode maakt studies mogelijk over transport, functie en eiwit-eiwit-interacties met behulp van actieve exogene eiwitten, waardoor de noodzaak voor heterologe expressie in eukaryote cellen wordt vermeden.

Elektroporatie van functionele bacteriële effectoren in zoogdiercellen

Onderzoek naar de interactie tussen bacteriële pathogenen en hun gastheren is een belangrijk gebied van biologisch onderzoek. Hier beschrijven we de noodzakelijke technieken om effector translocatie door Coxiella burnetii tijdens siRNA gene silencing behulp blam substraat te meten.

Aanbrengen Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) naar Effector Translocatie Efficiency Onderzoek door<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Tijdens siRNA Silencing

Het beschreven hydroponische cocultivatiesysteem ondersteunt intacte planten met metalen maasschermen en cocultivateert ze met bacteriën. Plantweefsel, bacteriën en gescheiden moleculen kunnen vervolgens afzonderlijk worden geoogst voor stroomafwaartse analyses, waarbij tegelijkertijd wordt toegelaten dat de moleculaire reacties van zowel plantaardige hosts als interactieve microben of microbiomen worden onderzocht.

Een hydroponisch co-cultuursysteem voor gelijktijdige en systematische analyse van plant- / microbe moleculaire interacties en signalering

Inzicht in de functie van essentiële processen bij bacteriën is uitdagend. Fluorescentie microscopie met doelgroepen gerichte kleurstoffen kan belangrijke inzicht verwerven in de cel van de microbiële groei en celcyclus progressie. Hier, wordt Agrobacterium tumefaciens gebruikt als een model bacterie Markeer methoden voor levende cellen imaging voor karakterisering van essentiële processen.

Cel fluorescentie microscopie als waarnemer van essentiële processen tijdens microbiële celgroei bij te wonen

Fluorescerende eiwit gebaseerde benaderingen te controleren effectoren uitgescheiden door bacteriën in de cellen van de gastheer zijn uitdagend. Dit is te wijten aan de incompatibiliteit tussen fluorescente proteïnen en het type III secretie systeem. Hier, wordt een geoptimaliseerde split superfolder GFP-systeem gebruikt voor visualisatie van effectoren uitgescheiden door bacteriën in de fabriek van de gastheercel.

Split groen Fluorescent proteïne systeem te visualiseren effectoren verlost van bacteriën tijdens de infectie

Hier wordt beschreven, is een methode voor het analyseren van bacteriële genexpressie in dierlijke weefsels op een cellulair niveau. Deze methode biedt een bron voor de studie van de fenotypische verscheidenheid die zich voordoen binnen een bacteriële bevolking in antwoord op het milieu weefsel tijdens een infectie.

Een fluorescentie gebaseerde methode om te studeren van bacteriële genregulatie in geïnfecteerde weefsels

Leer hoe bacteriële virulentiefactoren interfereren met intracellulaire signaaltransductie via een induceerbaar expressiesysteem. Deze methode onthult mechanismen van pathogene manipulatie van gastheercellen.

Het toepassen van een induceerbare Expression Systeem om interferentie van bacteriële virulentiefactoren met intracellulaire signalering Studie (Video) | JoVE Journal

Het toepassen van een induceerbare Expression Systeem om interferentie van bacteriële virulentiefactoren met intracellulaire signalering Studie

Meer video's verkennen