Een fluorescentie gebaseerde methode om te studeren van bacteriële genregulatie in geïnfecteerde weefsels

Deze methode kan ruimtelijke patronen van bacteriële genexpressie en strategieën voor fysiologische aanpassing aan gastheer weefsel micro-omgevingen die verloren gaan wanneer gemiddeld over de gehele bevolking in weefsels onthullen. Met deze techniek kunnen potentiële heterogeniteiten worden gedetecteerd die moeten worden overwogen bij het identificeren van nieuwe bacteriële paden en eiwitten die het doelwit zijn van antivirulentie of antibacteriële verbindingen. Begin met het strepen van S.aureus stammen van belang op bloed agar platen uit een bevroren glycerol voorraad en het uitbroeden van de platen op 37 graden Celsius voor 16 tot 24 uur om hun hemolytische fenotypes te bevestigen op basis van hun vermogen om rode bloedcellen lyse en duidelijke transparante zones te vormen.

Inoculeren enkele kolonie isolaten van elke stam in vier milliliter van tryptische sojabouillon, of TSB, in steriele glazen buizen en draai de buizen op 37 graden Celsius gedurende 16 tot 24 uur in een buis roller in een hoek van ongeveer 70 graden en 70 rotaties per minuut. De volgende ochtend meet de optische dichtheid op 600 nanometer, of OD 600, van de culturen op een spectrofotometer en verdun de cellen tot een OD 600 van 0,05 in 25 milliliter steriele TSB bij een verhouding van vijf tot één kolf tot volume in 125 milliliter Delong kolven. Broed de culturen in een 37 graden Celsius waterbad bij 280 rotaties per minuut en oogst de cellen tijdens de exponentiële fase.

Pellet de cellen door centrifugatie en was de cellen twee keer in een gelijk volume van steriele PBS. Dan resuspend de cellen in verse PBS aan één keer 10 aan de achtste kolonievormende eenheden per milliliterconcentratie voor hun verdere injectie in een ontvangend dier. Op het juiste experimentele eindpunt, oogst de nier, hart, lever, longen, en milt in 15 milliliter polypropyleen buizen met 10% gebufferd formaline voor een 24 tot 48 uur incubatie in het donker bij kamertemperatuur met zachte schudden of rotatie.

Aan het einde van de fixatie, insluiten van de organen in helder weefsel bevriezing medium voor opslag bij min 80 graden Celsius. Gebruik een cryostat om 10 micrometer dikke weefselsecties te verwerven en droog de secties op individuele voorgezuiverde geladen glasplaten gedurende 20 minuten in het donker voordat u hard montagemedium toepast, aangevuld met DAPI. Breng vervolgens afdekbonen aan en genees de glijbanen 's nachts bij kamertemperatuur voordat u de monsters overbrengt naar langdurige opslag bij vier graden Celsius.

Om laesies in de monsters te identificeren, plaatst u een dia op het podium van een confocale microscoop voor laserscannen en gebruikt u een geschikt doel voor het visualiseren van individuele cellen om beelden van de laesies te verkrijgen. Als u de fluorescentieintensiteiten in de confocale beelden wilt meten, opent u een afbeelding in ImageJ en past u de helderheid en het contrast aan om het fluorescentiesignaal van de laesie goed te visualiseren. Definieer het interessegebied met behulp van het gereedschap veelhoekselecties en voeg de ROI toe aan de ROI-manager onder het tabblad Bewerken in ImageJ.

Selecteer Bewerken, vervolgens Selecteren en ten slotte Toevoegen aan Beheer. Wijzig vervolgens de naam van de ROI en label de desbetreffende afbeelding. Als u de centroid wilt definiëren, opent u het tabblad Analyseren en selecteert u Gebied, Gemiddelde grijze waarde, Centroid en Limiet tot drempelwaarde.

Haal de centroid fluorescentieintensiteit of meet de gemiddelde fluorescentieintensiteit in een bepaald laesiegebied per eenheid. Dit kan worden bereikt door de drempelfunctie te gebruiken om de lagere en bovenste fluorescentielimieten zo nodig in te stellen. Exporteer de gegevens naar een Excel-bestand en bereid een kolom voor met de gemiddelde fluorescentieintensiteit per eenheidsgebied voor de periferie en kern.

Om de gemiddelde fluorescentieintensiteiten per eenheidsgebied in de periferie en kern te berekenen, definieert u handmatig de boven- en ondergrenzen van drempels. Staphylococcus aureus thermonuclease GFP fusiefluorescentie is gemiddeld bijna negenvoudig hoger in cellen die het fusiegen dragen dan in cellen die de reporterfusie niet dragen. Op dezelfde manier, tandem dimeric Tomato fusie fluorescentie is ongeveer zes keer hoger dan de null reporter controle.

Het patroon van de activiteiten van de verslaggever kan worden bevestigd door stroomcytometrie met weefselhomogenates. Hoewel de vouwverschillen in fluorescentie meestal lager zijn. Variaties in de fluorescentie metingen kunnen te wijten zijn aan heterogene expressie van de verslaggevers.

In deze representatieve monsters werd bijvoorbeeld geconstateerd dat sommige letsels één of beide verslaggevers binnen ongeveer 100 micrometer afstand in hetzelfde weefselmonster uitdrukten. Het onderzoeken van de reporter activiteit om een enkele cel resolutie in staphylococcal abces gemeenschappen onthult een ruimtelijke regulering van staphylococcus aureus thermonuclease expressie in abcessen begrensd met sterke DAPI vlekken, waarschijnlijk geassocieerd met de vorming en het vrijkomen van neutrofiele extracellulaire vallen. Bijvoorbeeld, significant hogere staphylococcus aureus thermonuclease GFP fusie fluorescentie wordt waargenomen in de binnenkern van de staphylococcal abcess gemeenschap in vergelijking met gelokaliseerd naar de periferie.

In dezelfde abcess, het patroon voor de tandem dimeric Tomato fusie fluorescentie lijkt te zijn omgekeerd. Het patroon in dit experiment was echter statistisch niet significant. Het verkrijgen van intacte cryo-embedded dissecties is van vitaal belang voor de fluorescentie beeldanalyse en moet zorgvuldig worden gedaan.

Het sorteren van de bacteriële cellen om subpopulaties vast te leggen die de fusie in verschillende mate uitdrukken, in combinatie met RNA-Seq-analyse, kunnen genoombrede veranderingen in het transcriptoom verlichten. Let op bij het werken met formaline omdat het een kankerverwekkende stof is en huidirritatie, allergische reacties of oogschade kan veroorzaken bij directe blootstelling. Het genereren van gemuteerde derivaten van stammen die fluorescerende reporters van belang dragen, kan helpen de genetische basis voor de waargenomen ruimtelijke regelgevingspatronen te onthullen.