Het vergelijken van de affiniteit van GTPase-bindende eiwitten met behulp competitiebepalingen

Het algemene doel van deze procedure is om de relatieve affiniteiten van eiwitbindingspartners voor Row Family GT P ACEs te vergelijken onder zorgvuldig gecontroleerde nucleotide-laadcondities. Dit wordt bereikt door eerst vermeende competitieve bindingspartners te zuiveren, elk gelabeld met dezelfde tag, bijvoorbeeld groen fluorescerend eiwit of GFP. De tweede stap is het zuiveren van de GTPA van belang.

Laad bijvoorbeeld RAC1 met het juiste nucleotide om de gewenste GTPA-signaleringstoestand te bereiken. Vervolgens wordt het nucleotide-geladen GTPA geïncubeerd met een vaste hoeveelheid van de ene bindingscompetitor en toenemende hoeveelheden van de andere bindingscompetitor om een titratie-bindingscurve te verkrijgen. De laatste stap is het scheiden van eiwitten die gebonden zijn aan geïmmobiliseerd GTpase via western blot en het sonderen van het membraan op de GFP-tag die door beide bindingspartners wordt gedeeld.

Uiteindelijk wordt de Western blot gebruikt om de relatieve concentraties te identificeren waarbij gelijke hoeveelheden van elke GFP-gelabelde bindingspartner worden vastgelegd door de GTPase. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals co-precipitatie, is dat de eiwitbindingseigenschappen van gtpa worden bepaald door het gebonden nucleotide in de cel. Het gebonden nucleotide is labiel, wat de interpretatie van eiwitbindingsgegevens bemoeilijkt.

Begin deze procedure met de zuivering van GST-getagde G tpa en de expressie van gtpa-bindende eiwitten, zoals gedetailleerd in het tekstprotocol. Spoel de kolven met getransfecteerde cellen met fosfaatgebufferde zoutoplossing of PBS en laat de kolven vijf minuten uitlekken. Aspireer de vrije vloeistof en schraap vervolgens de cellen af in 500 µL lysisbuffer in een microcentrifugebuisje; meng de cellen om ze te lyseren door inversie bij 4 °C gedurende 30 minuten.

Was tijdens de lysis twee porties van 40 µL GFP-trap beads drie keer met verse lysisbuffer. Sedimenteer de beads bij 2.700 ×g gedurende twee minuten tussen de wasbeurten door. Clarificeer na de lysis de lysaten door centrifugatie bij 21.000 ×g gedurende 10 minuten.

Overbreng het geklaarde lysaat van elk van de concurrerende eiwitten naar afzonderlijke gewassen GFP-trap-beads. Laat de GFP-fusie-eiwitten twee uur binden, waarbij gemengd wordt door inversie bij vier graden Celsius. Was de beladen GFP-trap-beads tweemaal in lysisbuffer en tweemaal in competitiebuffer.

Sedimenteer de kralen in bindingsbuffer bij 2.700 ×g gedurende twee minuten tussen de wasbeurten door. Elueer de GFP-fusie-eiwitten door 40 µL 0,2 M glycine toe te voegen en 30 seconden lang op en neer te pipetteren. Sedimenteer de kralen onmiddellijk bij 21.000 ×g gedurende 60 seconden en breng de vloeistof over naar een nieuwe centrifugebuis die 4 µL 1 M Tris-HCl bevat; voer deze stap snel uit om beschadiging van het gezuiverde eiwit te beperken. Analyseer 1 µL van elk gezuiverd eiwit via western blot en probeer met een anti-GFP-antilichaam om de relatieve opbrengst vast te stellen met een kwantitatief blotting-systeem volgens het protocol van de fabrikant.

Egaliseer de molaire proteïneconcentratie door toevoeging van competitie-bindingsbuffer. Neem 90 µL van de voorbereide GST rack one beads en was deze drie keer met nucleotide-laadbuffer, waarbij een magnetische partikel-scheider wordt gebruikt om de beads bij elke stap neer te slaan. Aspireer de buffer van de beads en voeg 100 µL nucleotide-laadbuffer toe, afhankelijk van of GDP, GTP of geen nucleotide-lading vereist is.

Voeg voor het competitie-experiment 12 µL 100 mM GDP, 12 µL 10 mM GTP gamma S of geen nucleotide toe aan 60 µL GST rack one beads voor de nucleotide-ladingscontroles. Verdeel de resterende beads over drie aliquots van 10 µL en voeg twee µL 100 mM GDP, twee µL 10 mM GTP gamma S of geen nucleotide toe aan elke buis. Incubeer de bead-mengsels gedurende 30 minuten bij 30 °C onder agitatie.

Stabiliseer het nucleotide-gebonden rack door toevoeging van één molaire magnesiumchloride aan de experimentele mix en de controlemixen om de competitieve binding uit te voeren. Bereid zes microcentrifugebuisjes voor, elk gevuld met 200 µL competitieve bindingsbuffer.

Elke buis moet ook 10 µL van het nucleotide-geladen rek, één kraal en vijf µL van het rek bevatten. Voeg aan elke buis 0, 1, 2, 0,55, 10 of 20 µL van bindend eiwit A toe als constant bindend eiwit, en bindend eiwit B als variabel bindend eiwit. Deze volumes gaan uit van ongeveer gelijke voorraadconcentraties van de constante en variabele bindende eiwitten en dienen mogelijk te worden aangepast.

Vul het totale volume van het bindingsmengsel aan tot 235 µL door toevoeging van de competitie-bindingsbuffer. Bereid vervolgens een microcentrifugebuis voor met 200 µL van de competitiebuffer. Voeg 10 µL van het experimentele nucleotide-geladen rack, één kraal en 10 µL van rack één bindingsproteïne A toe. Stel vervolgens de G-D-P-G-T-P gamma S en de controlebuizen zonder nucleotide op zoals beschreven in het tekstprotocol.

Incubeer de buisjes gedurende twee uur en meng na de incubatie door inversie bij 4 °C. Was de beads drie keer met de competition binding buffer. Elueer tot slot de gebonden eiwitten in 20 µL reducerende monsterbuffer.

Kwantitatieve western blotting van de GFP-tag van gezuiverde GFP RCC twee en GFP Corona in one C.Propeller-domein onthult dat het eiwit in de bovenste band, GFP RCC twee, 1,4 keer overvloediger is dan de onderste band en verdund moet worden om een molaire ratio van één-op-één te bereiken voor het competitie-experiment. Een controle-experiment demonstreert dat de nucleotide-laadstatus van rack één de bindingsspecificiteit dicteert door toenemende volumes van GFP RCC twee te titreren tegen een vast volume equimolair GFP Corona in one C propeller-domein en vervolgens te blotten. De eiwitten die binden aan rack één maken het mogelijk om een relatieve verandering in gebonden eiwit te visualiseren; door de GFP-bandintensiteiten voor beide concurrenten in dezelfde grafiek uit te zetten en het punt te identificeren waar de lijnen elkaar kruisen, kan het volume van het variabele bindende eiwit bij equilibrium worden bepaald.

Er moet echter zorgvuldig worden gewaakt voor zaken als interacties tussen concurrerende partners of een overschot aan lokaas gtpa, zodat het experiment niet in gevaar komt. Een toename van één concurrent zonder verlies van de andere, zoals hier getoond, wijst op een probleem bij het uitvoeren van deze procedure. Het is belangrijk om te controleren of er een wederkerige relatie bestaat tussen de abundantie van de concurrerende bindingspartners.

Er zijn een aantal problemen die de resultaten kunnen vervormen en of opgelost kunnen worden, mits ze worden geïdentificeerd door de gegevens te inspecteren.