Het vergelijken van de affiniteit van GTPase-bindende eiwitten met behulp competitiebepalingen
October 8th, 2015
Dit protocol vergelijkt de relatieve affiniteiten van bindingspartners voor Rho-familie GTPases, inclusief Rac1. In vivo, concurreren Rac1-bindende eiwitten voor een enkele bindingsinterface, waarvan de conformatie wordt bepaald door een gebonden nucleotide. Het nucleotide is zowel belangrijk als moeilijk experimenteel te beheersen, vanwege de hoge hydrolysesnelheid.
Het algemene doel van deze procedure is om de relatieve affiniteiten van eiwitbindende partners voor Row Family GT P ACEs te vergelijken onder zorgvuldig gecontroleerde nucleotide-ladingsomstandigheden. Dit wordt bereikt door eerst putatieve competitieve bindpartners te zuiveren, elk gelabeld met dezelfde tag, bijvoorbeeld groen fluorescent eiwit of GFP. De tweede stap is het zuiveren van de GTPA van belang.
Neem bijvoorbeeld RAC een en laad met het juiste nucleotide om de gewenste GTPA-signaleringstoestand te bereiken. Vervolgens wordt de nucleotide-geladen gtpa gedurende een vaste hoeveelheid van een bindconcurrent en toenemende hoeveelheden van de andere bindconcurrent geïncubeerd om een titratiebindingscurve te bereiken. De laatste stap is om eiwitten gebonden aan geïmmobiliseerde GT pase op te lossen door middel van western blot en de membraan te sonderen voor de GFP-tag die tussen de twee bindpartners wordt gedeeld.
Uiteindelijk wordt de Western blot gebruikt om de relatieve concentraties te identificeren waarbij vergelijkbare hoeveelheden van elke GFP-gelabelde bindpartner worden gevangen door de GTPase. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals coprecipitatie, is dat de eiwitbindende eigenschappen van gtpa worden bepaald door het gebonden nucleotide in de cel. Het gebonden nucleotide is labil, waardoor interpretatie van eiwitbindende gegevens moeilijk wordt.
Begin deze procedure met de zuivering van GST-gelabelde G tpa en expressie van gtpa-bindende eiwitten zoals beschreven in het tekstprotocol. Spoel de flessen van getransfecteerde cellen in fosfaatbufferzoutoplossing of PBS en laat de fles vijf minuten uitlekken. Aspireer de vrije vloeistof en schraap vervolgens de cellen in 500 microliter lysbufer in een micro fugebuis, meng cellen om te lyseren door inversie bij vier graden Celsius gedurende 30 minuten.
Tijdens de lyse wassen twee porties van 40 microliters GFP-trapkralen drie keer met verse lysebuffer sediment. De kralen bij 2.700 keer G gedurende twee minuten tussen wasbeurten. Na lyse, verduidelijk de lysaten door centrifugatie bij 21.000 keer G gedurende 10 minuten.
Breng het verduiverde lysate van elk van de concurrentie-eiwitten over naar afzonderlijke gewassen GFP-trapkralen. Laat GFP-fusie-eiwitten binden gedurende twee uur, mengen door inversie bij vier graden Celsius. Was de geladen GFP-trapkralen twee keer in lysebuffer en twee keer in concurrentie.
Bindende buffer sedimenterende kralen bij 2.700 keer G gedurende twee minuten tussen wasbeurten. Elueer GFP-fusie-eiwitten door 40 microliter 0,2 molair glycine toe te voegen en gedurende 30 seconden op en neer te pipetteren, sedimenteer de kralen onmiddellijk bij 21.000 keer G gedurende 60 seconden en breng de vloeistof over in een nieuwe fugebuis met vier microliter een molair tris HCL. Voer deze stap snel uit om schade aan het gezuiverde eiwit te beperken. Analyseer één microliter van elk gezuiverd eiwit door middel van western blot en sondeer met een anti-GFP-antilichaam om de relatieve opbrengst vast te stellen met behulp van een kwantitatief blotsysteem volgens het protocol van de fabrikant.
Breng de molaire eiwitconcentratie gelijk door toevoeging van concurrentiebindbuffer. Neem 90 microliter van de voorbereide GST-rek een kralen en was drie keer met nucleotide-ladingbuffer met behulp van een magnetische deeltjessorteerder om de kralen bij elke stap te sedimenteren. Aspireer de buffer van de kralen en voeg 100 microliter nucleotide-ladingbuffer toe, afhankelijk van of G-D-P-G-T-P of geen nucleotide-lading vereist is.
Voor het concurrentie-experiment, voeg 12 microliter 100 millimolair GDP toe aan 12 microliter 10 millimolair GTP gamma S of geen nucleotide aan 60 microliter GST-rek een kralen voor de nucleotide-ladingscontroles. Verdeel de resterende kralen in drie 10 microliter quats en voeg twee microliter 100 millimolair GDP toe aan twee microliter 10 millimolair GTP gamma S of geen nucleotide aan elke buis. Incubeer de kralenmixen gedurende 30 minuten bij 30 graden Celsius met agitatie.
Stabiliseer de nucleotidegebonden rek, één door toevoeging van een molair magnesiumchloride aan de experimentele mix en de controlemixen. Om de concurrentiebinding uit te voeren. Zet zes micro fugebuizen op. Elke bevat 200 microliter concurrentiebindbuffer.
Elke buis moet ook 10 microliter van de nucleotide-geladen rek, één kralen en vijf microliter van de rek. Eén bindeiwit A als een constant bindeiwit aan elke buis toevoegen 0 1 2 0,55, 10 of 20 microliter rek één bindeiwit B als het variabele bindeiwit. Deze volumes gaan uit van ongeveer gelijke voorraadconcentraties van het constante en variabele bindeiwitten en kunnen mogelijk moeten worden aangepast.
Breng het totale volume van het bindmengsel op 235 microliter door toevoeging van de concurrentiebindbuffer. Stel vervolgens een micro fugebuis in met 200 microliter van de concurrentiebuffer. 10 microliter experimentele nucleotide-geladen rek, één kralen en 10 microliter rek één bindeiwit A. Zet vervolgens de G-D-P-G-T-P gamma S en geen nucleotide controlebuisjes op zoals beschreven in het tekstprotocol.
Incubeer de buizen gedurende twee uur, mengen door inversie bij vier graden Celsius na incubatie. Was de kralen drie keer met de concurrentiebindbuffer. Eluteer tenslotte de gebonden eiwitten in 20 microliter reducerend monsterbuffer.
Kwantitatief western blotting van de GFP-tag van gezuiverd GFP RCC twee en GFP Corona in één C.Propeller domein laat zien dat het eiwit in de bovenste band, GFP RCC twee 1,4 keer meer abundant is dan de onderste band en moet worden verdund om een één-op-één molaire verhouding te bereiken voor het concurrentie-experiment. Een controle-experiment demonstreert dat de nucleotide-ladingstatus van rek een de bindingsspecificiteit bepaalt door titratie van toenemende volumes van GFP RCC twee tegen een vast volume van equimolair GFP Corona in één C.Propeller domein en blotting. De eiwitten die aan rek een binden, maken het mogelijk een relatieve verandering in gebonden eiwit te visualiseren door de GFP-bandintensiteiten voor
Overzicht
Dit protocol vergelijkt de relatieve affiniteiten van bindingspartners voor Rho-familie GTPases, specifiek Rac1, onder gecontroleerde nucleotidebelastingcondities. De methode omvat het zuiveren van competitieve bindingspartners en het analyseren van hun interacties door middel van Western blotting.
Belangrijkste onderdeel van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Biochemie
- Celbiologie
Achtergrond
- Rho-familie GTPases spelen cruciale rollen in cellulaire signalering.
- Bindingsaffiniteiten worden beïnvloed door de nucleotidetoestand van de GTPase.
- Experimentele controle van nucleotidebelasting is uitdagend vanwege hydrolysesnelheden.
- Het begrijpen van deze interacties is essentieel voor het ophelderen van cellulaire mechanismen.
Doel van het onderzoek
- Om de bindingsaffiniteiten van Rac1 en zijn concurrenten te vergelijken.
- Om een betrouwbare methode te vestigen voor het beoordelen van eiwitinteracties.
- Om de effecten van nucleotidebelasting op bindingsspecificiteit te onderzoeken.
Gebruikte methoden
- Zuivering van GFP-gelabelde bindingspartners.
- Rac1 laden met specifieke nucleotiden om gewenste signaleringstoestanden te bereiken.
- Incubatie van nucleotide-geladen Rac1 met verschillende concentraties concurrenten.
- Western blotting om bindingsinteracties te kwantificeren.
Belangrijkste resultaten
- Western blot-analyse onthulde relatieve concentraties van bindingspartners.
- Bindingsspecificiteit werd bepaald door de nucleotidetoestand van Rac1.
- Kwantitatieve gegevens maakten visualisatie van bindingsinteracties mogelijk.
- Evenwichtspunten geïdentificeerd voor variabele bindingseiwitten.
Conclusies
- Het protocol biedt een robuuste methode voor het bestuderen van GTPase-interacties.
- Het begrijpen van nucleotide-invloed op binding kan toekomstige studies informeren.
- Deze aanpak kan worden aangepast voor andere GTPases en bindingspartners.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Competitive binding assays for GTPase-binding proteins enable precise evaluation of protein-protein interaction affinities under controlled nucleotide states, directly informing target validation and mechanistic de-risking in early discovery. By quantifying how binding partners compete for the same GTPase interface, this method supports predictive confidence in pathway interrogation and portfolio triage. The approach addresses a critical inflection point where conventional immunoprecipitation fails due to nucleotide lability, ensuring robust data for R&D decision-making.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct comparison of binding affinities for GTPase effectors under defined signaling states.
- Clarifies competitive binding dynamics, supporting functional target validation and pathway mapping.
- Reduces mechanistic ambiguity by isolating nucleotide-dependent interactions.
- Supports predictive confidence for advancing or deprioritizing targets based on quantitative competition data.
Screening & Assay Development
- Establishes validated, quantitative assays for measuring protein-protein competition.
- Facilitates reproducible detection of binding events using standardized GFP tags and western blotting.
- Enables assay scalability and platform reuse for multiple GTPase-binding partners.
- Provides reliable quantitative outputs for downstream compound or modulator screening.
Translational & Preclinical Research
- Aligns biochemical binding data with disease-relevant signaling states by controlling nucleotide loading.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling mechanistic de-risking.
- Informs risk-adjusted advancement decisions based on competitive binding profiles.
Pipeline & Workflow Integration
This competition assay method integrates at the early discovery and target validation stage, bridging to assay development and preclinical mechanistic studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying competitive binding under controlled nucleotide states.
- Screening: Provides standardized, reproducible assay conditions for evaluating protein-protein interactions.
- Analytics: Delivers quantitative western blot readouts for direct comparison of competitor binding.
- Translational Research: Enables mechanistic alignment with disease-relevant GTPase signaling.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for evaluating diverse GTPase-binding protein interactions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic uncertainty in target validation.
- Operational Value: Standardizes protein purification, assay setup, and detection for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust competition data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on quantitative binding competition.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein purification, quantitative western blotting, and assay optimization.
- Needs access to instrumentation for protein expression, bead-based purification, and quantitative detection.
- Demands cross-team standardization of tags, detection antibodies, and assay conditions.
- Adaptation may be needed for different GTPases or binding partners with unique biochemical properties.
- Careful control of nucleotide loading and competitor concentrations is essential to avoid experimental artifacts.
