Kosteneffectieve methode voor Microbiële Source Tracking Met behulp van specifieke menselijke en dierlijke virussen

Kosteneffectieve methode voor microbiële brondering using specifieke menselijke en dierlijke virussen. De studie beschrijft een kosteneffectieve methode voor de identificatie van de bron van fecale urineverontreiniging of verontreiniging door nitraten in water met behulp van kwantitatieve PCR voor de specifieke kwantificering van menselijke, porcine en bovine DNA-virussen, adenovirussen en polyomavirussen, voorgesteld als instrumenten voor microbiële brondering. We hebben een protocol ontwikkeld voor de concentratie van virussen uit watermonsters van 10 liter door organische flocculatie met behulp van magere melkextractie van virale nucleïnezuren uit het sediment en kwantificering van menselijke, bovine of porcine DNA-virussen met behulp van kwantitatieve PCR.

Het is algemeen bekend dat microbiële contaminatie van de vitamine een significant gezondheidsrisico vormt en dat we de bronnen van deze contaminatie moeten kennen. Wij hebben het gebruik van zeer prevalente DNA-virussen voorgesteld als instrumenten voor het volgen van de microbiële bron. De geselecteerde virussen zijn adenovirussen en polyomavirussen.

Deze virussen worden het hele jaar door en in alle geografische gebieden persistent uitgescheiden, zoals beschreven in eerdere studies. We hebben robuuste, goedkope concentratiemethoden voor virussen in water ontwikkeld en we hebben gewerkt aan de ontwikkeling van qPCR-assays voor de kwantificering van purine-adenovirussen en runderpolyomavirussen.

Daarnaast gebruiken we menselijke adenovirussen en NGC-polyomavirussen, getest via QPCR, eveneens als markers voor menselijke contaminatie in water, bij het verzamelen van watermonsters. In deze studie worden vier replica's van 10 liter per watermonster verzameld in plastic containers met een platte bodem, samen met één extra monster als procescontrole. Dit laatste monster wordt geënt met een bekende hoeveelheid van de virale partikels die als controle dienen.

Een negatieve controle wordt in het laboratorium voorbereid door gebruik te maken van geconditioneerd kraanwater in een extra plastic container van 10 liter. Indien het monster een grote hoeveelheid gesuspendeerd materiaal, zand en andere stoffen bevat, laat dit dan 15 minuten bezinken en breng het water over naar een nieuwe container. Virale concentratie door organische flocculatie.

De detectie van virussen in licht tot matig verontreinigde watermonsters vereist de concentratie van de virussen uit ten minste enkele liters water naar een veel kleiner volume. De concentratieprocedure omvat de verzuring van watermonsters van 10 liter, flocculatie met gebruik van magere melk, gravitatiesedimentatie van de vlokken en het opvangen van het precipitaat in 10 milliliters fosfaatbuffer. Om het proces te starten, wordt een oplossing van magere melk in kunstmatig zeewater bereid door 10 gram magere melkpoeder op te lossen in één liter kunstmatig zeewater en de pH zorgvuldig bij te stellen naar 3.5 met zoutzuur; de vlokken moeten vervolgens zichtbaar worden.

Bereid de oplossing vlak voor gebruik of bewaar deze 24 uur lang bij vier graden Celsius. De watermonsters worden geroerd en de conductiviteit in de monsters wordt gemeten. Als deze lager is dan 1,5 millisiemens, worden er zeezouten toegevoegd.

Stel de pH van het watermonster in op 3,5 door toevoeging van zoutzuur. Registreer de pH van de monsters vóór en na de conditionering, alsook het gebruikte volume zoutzuur. De geleidbaarheid dient eveneens te worden geregistreerd.

Na het aanpassen van de pH voegen we 100 milliliters pref flod magere melk, 1% toe aan het watermonster van 10 liter en roeren we de monsters gedurende acht tot 10 uur om de virussen te laten adsorberen aan de vlokken. Voor het spike-monster dat als procescontrole dient, voegt u het standaardvolume van het controlevirus, bijvoorbeeld één milliliter, toe aan het monster. Stop het roeren en laat de vlokken gedurende acht tot 10 uur door zwaikraft bezinken.

Na 16 uur, meestal de volgende dag, kunnen we de sedimenten verzamelen. Verwijder hiervoor het supernatant met behulp van een peristaltische pomp. Verzamel het sediment samen met de vlokken, ongeveer 500 milliliters, in een centrifugefles.

Balanceer de potten door toevoeging van pref flod magere melk pH 3.5 en centrifugeer de potten met een hogesnelheidscentrifuge, 8 000 Gs gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius. Verwijder de centrifugepotten voorzichtig uit de centrifuge zodra de centrifuge stopt. Giet het supernatant zeer voorzichtig af en gooi dit weg.

Los het pellet in elke centrifugebuis op tot een eindvolume van 10 milliliter fosfaat, voor de extractie en kwantificering van virale nucleïnezuren. Het viraal concentraat wordt gebruikt voor de extractie van virale nucleïnezuren en de specifieke adenovirussen en polyomavirussen van belang zullen worden gekwantificeerd via A-Q-P-C-R. Voer een nucleïnezurextractie uit met de key amp viral RNA mini kit.

De lysis van de virussen aanwezig in 140 µL virale concentraten wordt handmatig uitgevoerd, waarna de totale nucleïnezuren worden geëxtraheerd tot 80 µL. Deze kit maakt het gebruik van een geautomatiseerd platform, zoals de Keycube, mogelijk.

De volgende stap is de kwantificering van het virale genoom. Kopieën in de monsters kunnen worden bepaald met behulp van een kwantitatieve PCR met TaqMan-probes; humane adenovirussen, JC-polyomavirussen en runderpolyomavirussen kunnen in dezelfde 96-wells plaat worden gekwantificeerd. Aangezien alle processen dezelfde amplificatiecycli gebruiken, moeten varkensadenovirussen afzonderlijk in een onafhankelijke plaat worden getest voor de kwantificering van het doelvirus.

Bereid het quantitative PCR-mengsel voor in een schoon, apart gebied. Zodra het mengsel is bereid, verdeelt u 15 µL over elke put, inclusief de controles. Voeg in een apart gebied 10 µL van de nucleïnezuurextracties van de monsters toe; voer voor elk monster een directe meting en een tienvoudige verdunning in gezuiverd water uit in dubbeltoer. Het totale volume per reactie na toevoeging van het doelwit zal 25 µL bedragen, bestaande uit 15 µL mengsel plus 10 µL monster of standaard. Dek de putten met de monsters af met een deel van een kleefstrip.

Bewaar het andere deel van de afdekplaat voor de volgende stap. AB verdunning van de DNA-standaardstuspensies. 10 µL van 10 tot 0 tot 10⁶ genoomkopieën, in triplikaat en met gebruik van een micropipet die uitsluitend wordt gebruikt voor de standaard-DNA-afdekplaat.

De wells met de standaarden waarbij de kleefstrip vooraf is doorgesneden. Deze figuur toont de verdeling van de standaard-suspensie monsters en controles in de 96-wellplaat.

Voer de QPCR uit in een geschikt systeem en selecteer de juiste parameters na activatie van de amplitude gold gedurende 10 minuten. Zodra de reacties voltooid zijn, worden er 40 amplificatiecycli uitgevoerd bij 95 °C. Sla de gegevens en resultaten op zoals beschreven in de gebruikershandleiding van de gebruikte apparatuur.

De hoeveelheid DNA wordt bepaald als de mediaan van de verkregen gegevens, waarbij indien nodig wordt gecorrigeerd voor de verdunningsfactor. De amplificatieplot en standaardcurve die zijn verkregen voor de kwantificering van porcine adenovirussen vertoonden een correlatiecoëfficiënt van 0,999. Aanvaardbare hellingswaarden variëren na deze procedure van min 3,1 tot min 3,6.

De beschreven menselijke en dierlijke virussen zijn getest in grondwatermonsters uit een gebied met hoge nitraatgehaltes om de bronnen van contaminatie te bepalen. De vier geanalyseerde replica's vertoonden positieve resultaten voor porcine adenovirussen met een gemiddelde waarde van 7,74 per 10² genoomkopieën per liter, wat gerelateerd zou zijn aan de aanwezigheid van varkensmest in het gebied rondom de bemonsteringslocatie en wat de aanwezigheid van fecale porcine contaminatie in het grondwater zou bewijzen. In geen van de geteste monsters was menselijke contaminatie aanwezig.

De virologische gegevens werden bevestigd door nested PCR en sequentieanalyse. Conclusie. In deze studie hebben wij resultaten gepresenteerd van de analyse van grondwatermonsters, waarbij contaminatie van porcine oorsprong werd aangetoond in afwezigheid van menselijke of bovine contaminatie. De procedure is daarnaast toegepast op de analyse van badwater, zeewater en rivierwater.

Wij presenteren hier de procedure voor het toepassen van deze instrumenten bij de identificatie van de bron van verontreiniging in grondwater, waarbij hoge concentraties nitraat dienen als voorbeeld van de toepasbaarheid van de ontwikkelde methoden voor het detecteren van de bron van verontreiniging in het milieu.