Kosteneffectieve methode voor Microbiële Source Tracking Met behulp van specifieke menselijke en dierlijke virussen
December 3rd, 2011
De studie beschrijft een kosteneffectieve methode voor de identificatie van de bron van fecale / urine besmetting of verontreiniging door nitraten in het water met behulp van qPCR voor de specifieke kwantificering van de mens / varkens / rund DNA-virussen, adenovirussen en polyomavirussen, voorgesteld als MST tools.
Een kosteneffectieve methode voor microbiologisch brontracking met behulp van specifieke menselijke en dierlijke virussen. De studie beschrijft een kosteneffectieve methode voor de identificatie van de bron van fecale urineverontreiniging of verontreiniging door nitraten in water door gebruik van kwantitatieve PCR voor de specifieke kwantificering van humane varkens-, rund-, DNA-virussen, adenovirussen en polyomavirussen die zijn voorgesteld als microbiologische brontrackingtools. We hebben een protocol ontwikkeld voor de concentratie van virussen uit 10 liter watermonsters door organische flocculatie met behulp van mageremelkextractie van virale nucleïnezuren uit het sediment en kwantificering van humane runder- of varkens- DNI-virussen met behulp van kwantitatieve PCR.
Het is algemeen bekend dat microbiologische verontreiniging van de vitamine een aanzienlijk gezondheidsrisico vormt en we moeten de bronnen van de verontreiniging kennen. We hebben het gebruik voorgesteld van veel voorkomende DNA-virussen als microbiologische brontrackingtools. De geselecteerde virussen zijn adenovirussen en polyomavirussen.
Deze virussen worden het hele jaar door en in alle geografische gebieden afgescheiden. Bestudeerd in eerdere onderzoeken. We hebben robuuste, goedkope concentratiemethoden ontwikkeld voor virussen in water, en we zijn bezig met het ontwikkelen van QPCR-assays voor de kwantificering van purine-adenovirussen en runder-polyomavirussen.
Daarnaast gebruiken we humane adenovirussen, NGC-Polyomavirussen, getest door QPCR, ook als markers van menselijke besmetting in water. Verzameling van watermonsters. In deze studie worden vier replica's van 10 liter per watermonster verzameld in plastic containers met platte bodem en één extra monster als procescontrole. Dit laatste monster zal worden gezaaid met een bekende hoeveelheid van de virale deeltjes die als controle worden gebruikt.
Een negatieve controle wordt bereid in het laboratorium door gebruik te maken van conditiekraanwater in één extra plastic 10 liter container. Als het monster een hoge hoeveelheid gesuspendeerd materiaal, zand en andere materialen bevat, laat het 15 minuten sedimenteren, breng het water over in een nieuwe container. Virale concentratie door organische flocculatie.
Detectie van virussen in laag of matig vervuilde watermonsters vereist de concentratie van de virussen uit minstens enkele liters water in een veel kleiner volume. De concentratieprocedure omvat acidificatie van 10 liter watermonsters door flocculatie met behulp van mageremelkzwaartekracht, sedimentatie van de vlokken en verzameling van het precipitaat in 10 milliliter fosfaatbuffer om het proces te starten, een oplossing van lokaal mageremelk in kunstzeewater wordt bereid door 10 gram mageremelkpoeder op te lossen in één liter kunstzeewater en zorgvuldig het pH aan te passen tot 3,5. Met zoutzuur moet de vlok zichtbaar zijn.
Bereid de oplossing net voor gebruik of bewaar deze 24 uur op vier graden Celsius. De watermonsters worden geroerd en de geleidbaarheid in de monsters wordt gemeten. Als deze lager is dan 1,5 millisiemens, worden zeezouten toegevoegd.
Pas de pH van het watermonster aan tot 3,5 door toevoeging van zoutzuur. Noteer de pH van de monsters voor en na conditionering, evenals het volume zoutzuur dat is gebruikt. Ook de geleidbaarheid moet worden geregistreerd.
Na aanpassing van de pH voegen we 100 milliliter pref flod mageremelk, 1%, toe aan het 10 liter watermonster en roeren de monsters acht tot tien uur om de virussen te laten absorberen aan de vlokken. Voor het spike-monster dat als procescontrole wordt gebruikt, voegt u het standaardvolume van het controlevirus, bijvoorbeeld één milliliter, toe aan het monster. Stop met roeren en laat de vlok door zwaartekracht gedurende acht tot tien uur sedimenteren.
Na 16 uur, meestal de volgende dag, kunnen we de sedimenten verzamelen. Om dit te doen, verwijdert u het supernatant met behulp van een peristaltiekpomp. Verzamel het sediment met de vlokken, ongeveer 500 milliliter in een centrifugeerbuis.
Balanseer de potten door toevoeging van pref flod mageremelk pH 3,5, centrifugeer de potten met hogesnelheidscentrifuge, 8.000 Gs 30 minuten bij vier graden Celsius. Zodra de centrifuge stopt, verwijdert u de centrifugepotten voorzichtig uit de centrifuge. Giet voorzichtig het supernatant af en gooi het weg.
Los het pellet op in elke centrifugeerbuis tot een eindvolume van 10 milliliter fosfaat, nucleïnezuurextractie en kwantificering van virussen. Het virale concentraat wordt gebruikt voor de extractie van virale nucleïnezuren en de specifieke adenovirussen en polyoma-virussen van belang worden gekwantificeerd door A-Q-P-C-R. Voer een nucleïnezuurextractie uit met de Key amp viral RNA mini kit.
De lysis van de virussen die aanwezig zijn in 140. Microliters van virale concentraten wordt handmatig uitgevoerd en totale nucleïnezuren worden geëxtraheerd tot 80 microliters. Deze kit maakt het gebruik mogelijk van een geautomatiseerd platform zoals Key cube.
De volgende stap is de kwantificering van het virale genoom. Kopieën in de monsters door gebruik van een kwantitatieve PCR met tac man-sondes, humane adenovirussen, JC Polyoma-virussen en runder-polyomavirussen kunnen in dezelfde 96-well plate worden gekwantificeerd. Aangezien ze allemaal dezelfde amplificatiecycli gebruiken, moeten varkens-adenovirussen afzonderlijk worden getest in een onafhankelijke plate voor de kwantificering van het doelvirus.
Bereid de kwantitatieve PCR-mix voor in een schone aparte ruimte. Zodra de mix is bereid, verdeel 15 microliter in elk putje, inclusief de controles. Voeg de nucleïnezuurextracties uit de monsters 10 microliter toe in een aparte ruimte, voer direct en een tienvoudige verdunning uit in gezuiverd water van elk monster in duplicaat. Het totale volume voor één reactie na toevoeging van doelwit zal 25 microliter zijn, 15 van mix plus 10 van monster of standaard. Bedek de putjes met de monsters met een deel van een zelfklevende afdekking.
Bewaar het andere deel van de afdekking voor de volgende stap. AB-verdunning van de DNA-standaardophangingen. 10 microliter van 10 tot nul tot 10 tot zes genoomkopieën, pretenderen microliters door drievoud en met behulp van een micropbit dat uitsluitend voor de standaard-DNA-afdekking wordt gebruikt.
De putjes met de standaarden met de zelfklevende afdekking
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie presenteert een kosteneffectieve methode voor het identificeren van bronnen van fecale en urineverontreiniging in water. Door gebruik te maken van kwantitatieve PCR, kwantificeert de methode specifieke humane, varkens- en runder-DNA-virussen, inclusief adenovirussen en polyomavirussen, als hulpmiddelen voor microbiële brontracking.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Microbiële Brontracking
- Omgevingsmicrobiologie
- Beoordeling van Waterkwaliteit
Achtergrond
- Microbiële verontreiniging vormt significante gezondheidsrisico's.
- Het identificeren van verontreinigingsbronnen is cruciaal voor de volksgezondheid.
- DNA-virussen zijn wijdverbreid en kunnen dienen als effectieve traceringsmiddelen.
- Adenovirusessen en polyomavirussen worden geselecteerd vanwege hun relevantie.
Doel van de studie
- Om een methode te ontwikkelen voor het traceren van fecale verontreiniging in water.
- Om specifieke DNA-virussen uit watermonsters te kwantificeren.
- Om het begrip van verontreinigingsbronnen te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Concentratie van virussen uit 10-liter watermonsters.
- Organische flocculatie met gebruik van magere melk voor extractie van viraal nucleïnezuur.
- Kwantificering van humane, varkens- en runder-DNA-virussen via kwantitatieve PCR.
- Beoordeling van verontreinigingsbronnen door middel van geselecteerde virale indicatoren.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle concentratie en kwantificering van de doelvirussen.
- Aangetoonde effectiviteit van de methode voor microbiële brontracking.
- Identificatie van adenovirussen en polyomavirussen als betrouwbare indicatoren.
- Een kosteneffectieve oplossing voor beoordeling van waterverontreiniging geboden.
Conclusies
- De ontwikkelde methode is effectief voor het identificeren van verontreinigingsbronnen.
- Het gebruik van DNA-virussen kan microbiële brontracking-inspanningen verbeteren.
- Deze aanpak kan de monitoring van waterkwaliteit aanzienlijk verbeteren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Identifying contamination sources in water is critical for public health risk assessment and environmental monitoring. This method provides a cost-effective, high-throughput approach to microbial source tracking using species-specific DNA viruses as reliable indicators. It supports predictive confidence in contamination source attribution and enables scalable screening across diverse water matrices.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of fecal contamination hypotheses through quantification of human adenoviruses, JC polyomaviruses, porcine adenoviruses, and bovine polyomaviruses as specific biomarkers.
- Operational Value: Provides a standardized, reproducible protocol for viral concentration from 10-liter water samples using skimmed milk flocculation and gravity sedimentation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative viral genome copy data via qPCR with TaqMan probes, enabling sensitive detection down to 1-10 genome copies per test tube for porcine and bovine markers.
- Operational Value: Facilitates high-throughput processing of multiple samples in parallel using 96-well plate formats and automated nucleic acid extraction platforms.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant system modeling by linking viral markers to contamination sources such as porcine slurries in groundwater, as demonstrated in nitrate-impacted samples.
- Operational Value: Ensures translational continuity from environmental sampling to molecular quantification, with nested PCR and sequencing used for virological data confirmation.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into environmental microbiology workflows from sample concentration through nucleic acid extraction to quantitative viral measurement, enabling source attribution in water quality assessment pipelines.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing regarding contamination origins by quantifying virus-specific biomarkers associated with human, porcine, or bovine fecal sources.
- Screening: Delivers assay readiness through a one-step concentration protocol that eliminates bottlenecks of traditional two-step methods, allowing simultaneous processing of large sample sets.
- Analytics: Provides quantitative outputs via qPCR standard curves and amplification plots, with acceptable slope values between -3.1 and -3.6 and correlation coefficients of 0.999 for porcine adenovirus quantification.
- Translational Research: Connects environmental detection to source identification through correlation of viral markers with known contamination sources, such as porcine slurry in high-nitrate groundwater.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, low-cost capability for viral concentration and quantification applicable to bathing waters, seawater, river water, and groundwater across diverse geographical areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence in source tracking by using persistent, geographically widespread DNA viruses excreted in feces and/or urine.
- Operational Value: Delivers standardization and reproducibility through a one-step protocol involving acidification, skimmed milk flocculation, gravity sedimentation, and centrifugation at 8,000 × g for 30 minutes at 4°C.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions in environmental monitoring by providing cost-effective, high-sensitivity detection of contamination sources without requiring expensive infrastructure.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of remediation efforts by distinguishing between human, porcine, and bovine contamination sources in water samples.
Implementation Considerations
- Requires expertise in environmental virology, nucleic acid extraction, and quantitative PCR assay design and execution.
- Needs access to centrifugation equipment capable of 8,000 × g, nucleic acid extraction kits (e.g., Key Amp Viral RNA Mini Kit), and qPCR systems with TaqMan probe compatibility.
- Demands standardization of pH adjustment to 3.5 using hydrochloric acid, skimmed milk flocculation (1% v/v), and gravity sedimentation timing (8–10 hours) across teams and sites.
- Involves adaptation considerations for varying water matrices, including pre-sedimentation for high-turbidity samples and conductivity adjustment with sea salts when below 1.5 mS/cm.
- Includes practical limitations such as the need for separate qPCR plates for porcine adenoviruses due to potential probe compatibility issues, even when using similar amplification cycles.
