Name: Visualiseren van Surface T-Cell Receptor Dynamics vierdimensionaal met behulp van Rooster Light-Sheet Microscopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Leer hoe u rooster lichtveldmicroscopie gebruikt voor driedimensionale beeldvorming van T-celreceptordynamiek op CD4+ T-cellen. Deze methode biedt hoge ruimtelijke en temporele resolutie met minimaal fotobleken.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen graag het advies en de begeleiding van Dr Vytas Bindokas aan de Universiteit van Chicago erkennen. Wij danken de Integrated Light Microscopy Core Facility van de Universiteit van Chicago voor het ondersteunen en onderhouden van de rooster lichtplaatmicroscoop. Dit werk werd ondersteund door NIH New Innovator Award 1DP2AI144245 en NSF Career Award 1653782 (Aan J.H.). J.R. wordt ondersteund door het NSF Graduate Research Fellowships Program.

5C. C7 TCR-transgene RAG2 knock-out muizen in B10. Een achtergrond werden gebruikt in deze studie volgens een protocol goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de Universiteit van Chicago.
1. T-cellen oogsten en activeren
OPMERKING: Dit deel van het protocol is gebaseerd op eerdere protocollen. Zie citaten voor meer details20,21.
<ol><li>Euthanaseren een 10-12 week oude 5C. C7 transgene muis van beide geslachten (~20-25 g) volgens het goedgekeurde IACUC-protocol (d.w.z. CO2-kamer gevolgd door cervicale dislocatie).</li>
	<li>Spray muis karkas grondig met 70% ethanol te weken vaststelling van de vacht en te brengen in een BSL-2 veiligheidskast.</li>
	<li>Draai de muis aan de rechterkant en maak een kleine incisie in de lichaamsholte met een chirurgische schaar. Verwijder de milt met behulp van chirurgische tangen. Snijd bindweefsel weg als dat nodig is met een chirurgische schaar.</li>
	<li>Plaats de milt in een 70 μm-porie mesh cel zeef en pureer met de achterkant van een 1 mL spuitzuiger. Was door de zeef grondig met volledige RPMI (RPMI met 10% foetaal runderserum [FBS], 2 mM L-glutamine, 1% penicilline/streptomycine, 50 μM 2-mercaptoethanol).</li>
	<li>Centrifugeer de eencellige suspensie van splenocyten op 300 x g gedurende 5 min. Gooi de supernatant weg. LET OP: De pellet op dit punt zal rood zijn.</li>
	<li>Resuspend de splenocyten in 5 mL RBC lysis buffer. Incubeer gedurende 5 min en blus vervolgens met 5 mL complete RPMI.</li>
	<li>Centrifugeer de eencellige suspensie van splenocyten op 300 x g gedurende 5 min. Gooi de supernatant weg. LET OP: De pellet op dit punt moet wit zijn, niet rood.</li>
	<li>Resuspend de pellet in 5 mL van volledige RPMI.</li>
	<li>Breng over op een T-25-kolf en voeg 10 μM mottencytochroom-C (MCC, sequentie ANERADLIAYLKQATK) toe. Zet de cellen in een celkweekincubator op 37 °C, 5% CO2 's nachts.</li>
	<li>Voeg de volgende dag de recombinant muis IL-2 toe aan een uiteindelijke concentratie van 100 U/mL.</li>
	<li>Let op de volgende dagen, het toevoegen van verse media als de huidige media geel wordt. T-cellen zullen sterven als links in gele media onbeheerd voor meer dan 48 uur. Cellen zijn klaar om te gebruiken 6-10 dagen na de oogst.</li>
</ol>2. Cellen voorbereiden
<ol><li>Incubeer 5 mm ronde coverslips met 0,1% poly-L-lysine gedurende 10 min. Aanzuigen en op natuurlijke wijze laten drogen.</li>
	<li>Gebruik een kleuringsgradiëntreagenagen (zie de tabel met materialen)om dode cellen te scheiden en om 1 x 106 T-cellen en 1 x 106 APC's (CH27-cellen21,22 transduced met cytosolic mCherry) afzonderlijk te verkrijgen. OPMERKING: Cellen worden geteld met behulp van een hemocytometer.<ol>
<li>Voeg 3 mL gradiëntrea toe aan een conische buis van 15 mL en voeg cellen dropwise aan de rand van de buis voorzichtig toe. Niet mengen. Centrifugebij 930 x g gedurende 10 min bij 4 °C; versnelling/vertraging gebruiken: LANGZAAM/LANGZAAM. Verwijder de dunne middelste laag cellen tussen de volledige media en de dichtheid gradiënt reagens zorgvuldig, waardoor elk celtype in afzonderlijke conische buizen. OPMERKING: Het is noodzakelijk om meer cellen voor te bereiden dan nodig is voor beeldvorming, omdat we merken dat 50% gemiddeld verloren gaat tijdens het proces. Hoe meer cellen worden gebruikt voor het proces, hoe makkelijker het is om ze te oogsten uit de dichtheid gradiënt. We gebruiken 4-8 mL van beide celtypen om overtollige cellen te garanderen. Indien gewenst kunnen cellen vóór deze stap worden geteld om ervoor te zorgen dat het benodigde volume nodig is. Eventuele extra cellen worden terug gezet in hun respectieve kolven.</li>
		<li>Was beide buizen van T-cellen en CH27 cellen drie keer met 5 mL complete RPMI (300 x g voor 5 min). Gooi de supernatant elke keer tijdens de was. Bredig elke buis in 1 mL complete RPMI en tel cellen door een hemocytometer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bredig 1 x 106 APC's opnieuw op in 500 μL complete RPMI en voeg 10 μM MCC toe. Incubeer gedurende 3 uur bij 37 °C, 5% CO2. Was cellen drie keer met 500 μL complete RPMI (300 x g voor 5 min). Gooi de supernatants weg.</li>
	<li>Bredig 1 x 106 T cellen opnieuw in 500 μL complete RPMI. Voeg 2 μg anti-TCRβ Alexa488-gelabelde Fab (kloon H57) toe aan 500 μL cellen. Incubeer gedurende 30 min bij 37 °C, 5% CO2. Was cellen drie keer met 500 μL volledige RPMI (300 x g voor 5 min). Gooi supernatant na elke wasbeurt. OPMERKING: De divalent anti-TCR antilichaam werd gesneden in monovalent Fab met behulp van een Fab voorbereiding kit (zie de Tabel van Materialen)om te voorkomen dat crosslinking van de T-cel receptoren door de divalent antilichaam (deze stap is optioneel).</li>
	<li>Schorsbeide celtypen in 500 μL imaging media (fenol roodvrij Leibovitz's L-15 medium met 10% FBS, 1% penicilline/streptomycine, 2 mM L-glutamine).</li>
</ol>3. Het uitvoeren van LLSM Dagelijkse Uitlijning
OPMERKING: (Belangrijk) Dit uitlijningsprotocol is gebaseerd op het gebruikte LLSM-instrument (zie de tabel met materialen). Elke LLSM kan anders zijn en vereisen verschillende uitlijning strategieën, vooral die zijn home-built. De juiste routine-uitlijning uitvoeren en doorgaan naar punt 4.
<ol><li>Voeg 10 mL water plus 30 μL fluoresceine (1 mg/mL voorraad) toe aan het LLSM-bad (~10 mL volume), druk op Image (Home) om het doel naar de beeldpositie te verplaatsen en kijk naar een enkel Bessel-laserstraalpatroon. Lijn de laserstraal uit met behulp van de geleiders en vooraf ingestelde interessegebied (ROI) om de straal in alle richtingen in balans te maken.<ol>
<li>De balk moet ook verschijnen gericht in de finder camera. Gebruik twee spiegel kantelverstellingen, bovenste micrometer, focus, en emissie objectieve kraag aan te passen. Zie figuur 2A,B voor correct uitgelijnde straal.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Was het bad en de doelstellingen met ten minste 200 mL water om fluoresceine volledig te verwijderen.</li>
	<li>Beeldstandaard fluorescerende kralen in de beeldmedia (bereid door kralen vast te houden aan een 5 mm coverslip met poly-L-lysine, zie de Tabel met materialen; dit kan vooraf worden voorbereid en opnieuw worden gebruikt) voor fysieke point spread functie (PSF) in beeldmedia. OPMERKING: Er kan slechts één kraal in beeld zijn voor latere verwerking, dus probeer een kraal te vinden die op zichzelf in de kijker staat of gemakkelijk kan worden bijgesneden om een enkele kraal te verkrijgen.<ol>
<li>Zet dither aan door in te stellen op 3 in de vak 'X Galvo range'. Druk op Live om het huidige veld te bekijken. Beweeg langs de Z-richting om de cover slip en kralen te vinden. Zoek het midden van een kraal door langs Z te bewegen, druk op Stoppen om de laser te pauzeren. Controleer 3D,druk op Centrum en druk op Uitvoeren. Dit verzamelt de gegevens.</li>
		<li>Pas handmatig de kantelspiegel, objectieve kraag en focusmicrometer aan voor de hoogste grijze waarden en pas deze zo nodig aan om de juiste patronen te verkrijgen voor objectieve scan, z galvo, z+objective (totPSF) en samplescan (samplePSF) capture modes. Zie figuur 2C-F voor goed afgestelde maximale intensiteitsprojecties (MIP's). OPMERKING: De verschillende vangtmodi (objective scan, z galvo, z+objective en sample scan) veranderen hoe het lichtblad door het monster beweegt. Alle scanmodi moeten worden gebruikt voor uitlijning.</li>
		<li>De voorbeeldscan laat zien hoe gegevens tijdens het experiment worden verzameld. Verzamel het voorbeeld PSF door op Uitvoeren in de voorbeeldscanmodus voor deskewing en deconvolutie te drukken (zie punt 5). Wijzig lasers in drie kleurmodus (488, 560, 647) en druk nogmaals op Uitvoeren. OPMERKING: Aangezien de LLSM-beelden onder een hoek (57,2°) worden gemaakt, worden beelden die zijn vastgelegd in de "sample scan"-modus onder deze hoek verzameld en daarom "scheef". De-skewing is het proces van het corrigeren voor deze hoek en "opnieuw uitlijnen" van de afbeelding naar een echte z-stack. Deze gegevens moeten worden verzameld in beeldmedia en in alle kanalen die tijdens het experiment worden weergegeven. Als dit niet goed wordt verzameld, worden de gegevens niet goed ontsmet. Zorg er ook voor dat de media zijn opgewarmd tot 37 °C (of gewenste experimentele temperatuur).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Cellen instellen met LLSM
<ol><li>Voeg 100.000 APC's (50 μL) toe van stap 2,5 tot een cirkelvormige afdekslip met een diameter van 5 mm uit stap 2.1 en laat ze 10 min nemen.</li>
	<li>Vet de monsterhouder in en voeg de coverslipcel-side-up eraan toe. Voeg een druppel beeldmedia toe aan de achterkant van de coverslip om bellen te voorkomen voordat u in het bad wordt plaatst. Schroef de voorbeeldhouder op de piëzo en druk op Image (Home).</li>
	<li>Zoek een APC naar afbeelding om ervoor te zorgen dat de LLSM- en imagingsoftware (zie Tabel met materialen)naar behoren functioneren. OPMERKING: We image op 0,4 μm stap grootte met 60 z-stappen en 10 ms blootstelling voor twee kleuren met dither ingesteld op 3, wat resulteert in 1,54 s per frame van 3D-beeld met ~ 200 nm XY en 400 nm Z resolutie. Deze instellingen moeten mogelijk worden aangepast op basis van celgrootte, gewenste z-resolutie en sterkte van het signaal van de gebruikte fluorescerende etiketteringstechniek. Laser stroomverbruik zal ook variëren op basis van fluorescerende etikettering techniek gebruikt.<ol>
<li>Druk op Live om de huidige afbeelding weer te geven. Beweeg langs Z om de dekslip en cellen te vinden.</li>
		<li>Zoek het midden van een APC door in de Z-richting te bewegen en druk op Stoppen om de laser te pauzeren. Controleer 3D en voer de gewenste instellingen in (zie stap 4.3.1), druk op Centrum en druk vervolgens op Uitvoeren. Dit verzamelt de gegevens.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verlaag het werkstadium om de positie te laden en voeg 50 μL T-cellen toe in beeldmedia (100.000 cellen, vanaf stap 2.5) direct over de coverslip. Het is het beste om een druppelformulier op het einde van de pipettip te laten en vervolgens de punt aan te raken op de badvloeistof. Verhoog het podium terug door op "Afbeelding (Return)te klikken ".</li>
	<li>Begin met beeldvorming. Zorg ervoor dat u de gewenste stackgrootte en tijdsverlooplengte instelt. Afbeelding 60 z-stacks op een stapgrootte van 0,4 μm en invoer 500 termijnen. (Meestal) stoppen met opnemen voordat 500 frames worden bereikt om fotobleken te voorkomen. Gebruik de livemodus om te zoeken naar celparen en druk op Uitvoeren om gegevens te verzamelen wanneer er gereed en gewenste instellingen zijn ingevoerd. Zie voorbeeld Film 1 en figuur 1.</li>
</ol>5. Surface Dynamics volgen
<ol><li>Exporteer de gegevens uit de beeldverwerkingssoftware (zie de tabel met materialen). Dit maakt z-stack TIF-bestanden voor elk tijdpunt in elke kleur.</li>
	<li>Eerst deskew en deconvolve de gegevens. OPMERKING: We gebruiken de LLSpy-pijplijn onder licentie van HHMI's Janelia Research Campus18,maar deskewing en deconvolution zijn ook beschikbaar binnen meerdere imaging-software (zie Tabel met materialen).</li>
	<li>Debleach de gegevens. OPMERKING: We gebruiken Fiji's debleach functie met histogram matching (Fiji Pathway: Image | Aanpassen | Bleekmiddelcorrectie | Histogram Matching | OK).</li>
	<li>Importeren in de trackingsoftware (zie de tabel met materialen). Volg clusters volgens softwarespecificaties. Zie Voorbeeld Film 2. OPMERKING: Het bijhouden van resultaten zal afhangen van de gebruikte tracking software, gekozen algoritme, gewenste output parameters geselecteerd, enz. Bijvoorbeeld, in de tracking software die we gebruikten (zie de Tabel met materialen), hebben we ervoor gekozen om de software te laten onregelmatige vormen te volgen, in plaats van het toewijzen van elke functie een enkele plek, omdat TCR clusters zijn niet georganiseerd in perfecte bollen. Daarnaast hebben we ervoor gekozen om 35 parameters te verzamelen, waaronder snelheid, richting, volume, intensiteit, gebied, locatie en informatie over de duur van het spoor. Echter, verschillende methoden of parameters zullen gunstig zijn om verschillende vragen te beantwoorden.<ol>
<li>Als tracking niet gewenst is, gebruikt u de ClearVolume-plug-in voor Fiji voor het visualiseren en maken van films van hyperstack-gegevens.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Poulter, N. S., Pitkeathly, W. T. E., Smith, P. J., Rappoport, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Physical+Basis+of+Total+Internal+Reflection+Fluorescence+%28TIRF%29+Microscopy+and+Its+Cellular+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The Physical Basis of Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy and Its Cellular Applications.</a> Methods in Molecular Biology. 1251, Clifton, N.J. 1-23 (2015).</li>
<li>Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+for+the+cell+biologist%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist.</a> Journal of Cell Science. 123, Pt 21 3621-3628 (2010).</li>
<li>Axelrod, D. Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAxelrod%2C+D+%22Methods+in+Cell+Biology%22">Methods in Cell Biology</a>. 89, Chapter 7 169-221 (2008).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-796 (2006).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Intracellular+Fluorescent+Proteins+at+Nanometer+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li>
<li>Hell, S. W., Wichmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+the+diffraction+resolution+limit+by+stimulated+emission%3A+stimulated-emission-depletion+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Letters%22%5BJournal%5D)">Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy.</a> Optics Letters. 19 (11), 780(1994).</li>
<li>Shroff, H., White, H., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivated+Localization+Microscopy+%28PALM%29+of+Adhesion+Complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Photoactivated Localization Microscopy (PALM) of Adhesion Complexes.</a> Current Protocols in Cell Biology. 58 (1), 1-28 (2013).</li>
<li>Liu, Z., Lavis, L. D., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Live-Cell+Dynamics+and+Structure+at+the+Single-Molecule+Level%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Imaging Live-Cell Dynamics and Structure at the Single-Molecule Level.</a> Molecular Cell. 58 (4), 644-659 (2015).</li>
<li>Ji, N., Shroff, H., Zhong, H., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+speed+and+resolution+of+light+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Advances in the speed and resolution of light microscopy.</a> Current Opinion in Neurobiology. 18 (6), 605-616 (2008).</li>
<li>Erni, R., Rossell, M. D., Kisielowski, C., Dahmen, U. Atomic Resolution Imaging with a sub-50 pm Electron Probe. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://escholarship.org/uc/item/3cs0m4vr">https://escholarship.org/uc/item/3cs0m4vr</a> (2019).</li>
<li>Kizilyaprak, C., Daraspe, J., Humbel, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focused+ion+beam+scanning+electron+microscopy+in+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Focused ion beam scanning electron microscopy in biology.</a> Journal of Microscopy. 254 (3), 109-114 (2014).</li>
<li>Chen, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lattice+light-sheet+microscopy%3A+Imaging+molecules+to+embryos+at+high+spatiotemporal+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution.</a> Science. , (2014).</li>
<li>Ni, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptively+transferred+natural+killer+cells+maintain+long-term+antitumor+activity+by+epigenetic+imprinting+and+CD4%2B+T+cell+help%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Adoptively transferred natural killer cells maintain long-term antitumor activity by epigenetic imprinting and CD4+ T cell help.</a> Oncoimmunology. 5 (9), 1219009(2016).</li>
<li>Chaudhri, A., Xiao, Y., Klee, A. N., Wang, X., Zhu, B., Freeman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-L1+Binds+to+B7-1+Only+In+Cis+on+the+Same+Cell+Surface%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">PD-L1 Binds to B7-1 Only In Cis on the Same Cell Surface.</a> Cancer Immunology Research. 6 (8), 921-929 (2018).</li>
<li>Forbes, C. A., Scalzo, A. A., Degli-Esposti, M. A., Coudert, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ly49C-dependent+control+of+MCMV+Infection+by+NK+cells+is+cis-regulated+by+MHC+Class+I+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">Ly49C-dependent control of MCMV Infection by NK cells is cis-regulated by MHC Class I molecules.</a> PLoS pathogens. 10 (5), 1004161(2014).</li>
<li>Schöneberg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4D+cell+biology%3A+big+data+image+analytics+and+lattice+light-sheet+imaging+reveal+dynamics+of+clathrin-mediated+endocytosis+in+stem+cell-derived+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">4D cell biology: big data image analytics and lattice light-sheet imaging reveal dynamics of clathrin-mediated endocytosis in stem cell-derived intestinal organoids.</a> Molecular biology of the cell. 29 (24), 2959-2968 (2018).</li>
<li>Gao, R., et al. Cortical column and whole-brain imaging with molecular contrast and nanoscale resolution. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGao%2C+R+%22Science%22">Science</a>. 363 (6424), New York, N.Y. 8302(2019).</li>
<li>Cai, E., et al. Visualizing dynamic microvillar search and stabilization during ligand detection by T cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCai%2C+E+%22Science%22">Science</a>. 356 (6338), New York, N.Y. 3118(2017).</li>
<li>Ritter, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+Depletion+Initiates+Events+Leading+to+Granule+Secretion+at+the+Immunological+Synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Actin Depletion Initiates Events Leading to Granule Secretion at the Immunological Synapse.</a> Immunity. , (2015).</li>
<li>Lim, J. F., Berger, H., Su, I. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Activation+of+Murine+Lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation and Activation of Murine Lymphocytes.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (116), e54596(2016).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Single+Peptide-Major+Histocompatibility+Complex+Ligand+Triggers+Digital+Cytokine+Secretion+in+CD4%2B+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">A Single Peptide-Major Histocompatibility Complex Ligand Triggers Digital Cytokine Secretion in CD4+ T Cells.</a> Immunity. 39 (5), 846-857 (2013).</li>
<li>Irvine, D. J., Purbhoo, M. A., Krogsgaard, M., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+ligand+recognition+by+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct observation of ligand recognition by T cells.</a> Nature. 419 (6909), 845-849 (2002).</li>
<li>Jansson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mathematical+framework+for+analyzing+T+cell+receptor+scanning+of+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">A mathematical framework for analyzing T cell receptor scanning of peptides.</a> Biophysical journal. 99 (9), 2717-2725 (2010).</li>
<li>Mickoleit, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+reconstruction+of+the+beating+zebrafish+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">High-resolution reconstruction of the beating zebrafish heart.</a> Nature Methods. 11 (9), 919-922 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het gepresenteerde protocol is geoptimaliseerd voor het gebruik van CD4+ T-cellen geïsoleerd van 5C. C7 transgene muizen op het gebruikte LLSM-instrument, en daarom moeten andere celsystemen en LLSM's mogelijk anders worden geoptimaliseerd. Dit protocol toont echter de kracht van 4D-beeldvorming, omdat het kan worden gebruikt om de dynamiek van een oppervlaktereceptor op een hele cel te kwantificeren met de minste vervorming in fysiologische omstandigheden. Daarom zijn er veel mogelijke toekomstige toepassinge...

De precieze dynamiek van moleculen die in realtime op het driedimensionale celoppervlak worden verhandeld en verspreiden, is een raadsel om op te lossen. Microscopie is altijd een evenwicht geweest tussen snelheid, gevoeligheid en resolutie; als een of twee worden gemaximaliseerd, wordt de derde geminimaliseerd. Daarom, als gevolg van de kleine omvang en immense snelheid waarmee oppervlaktereceptoren bewegen, is het volgen van hun dynamiek een grote technologische uitdaging gebleven op het gebied van celbiologie. Bijvoorbeeld, veel studies zijn uitgevoerd met behulp van totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) microscopie1,2,3, die een hoge temporele resolutie heeft, maar kan alleen beeld een zeer dun deel van de T-cel membraan (~ 100 nm), en mist daarom gebeurtenissen gebeurt verder weg in de cel. Deze TIRF-beelden tonen ook alleen een tweedimensionaal gedeelte van de cel. Super-resolutie technieken, zoals stochastische optische reconstructie microscopie (STORM)4, fotoactivated lokalisatie microscopie (PALM)5, en gestimuleerd emissie-uitputting microscopie (STED)6, kan overwinnen van de Abbe diffractie limiet van het licht. Deze technieken hebben een hoge ruimtelijke resolutie (~ 20 nm resolutie)4,5,6,7, maar ze nemen vaak vele minuten om een volledige twee-dimensionale (2D) of driedimensionaal (3D) beeld te verwerven, en dus de temporele resolutie verloren gaat. Bovendien kunnen technieken zoals STORM en PALM die afhankelijk zijn van knipperende signalen onnauwkeurigheden hebben bij het tellen van8,9. Elektronenmicroscopie heeft veruit de hoogste resolutie (tot 50 uur resolutie)10; het kan zelfs driedimensionaal worden uitgevoerd met gerichte ionenbundelscanning elektronenmicroscopie (FIB-SEM), wat resulteert in maximaal 3 nm XY en 500 nm Z resolutie11. Echter, elke vorm van elektronenmicroscopie vereist harde monstervoorbereiding en kan alleen worden uitgevoerd met vaste cellen of weefsels, waardoor de mogelijkheid van beeldvorming van levende monsters na verloop van tijd.
Technieken om de hoge spatiotemporale resolutie te verkrijgen die nodig zijn om de dynamiek van oppervlakte- en intracellulaire moleculen in levende cellen in hun ware fysiologische 3D-natuur te identificeren, worden pas onlangs ontwikkeld. Een van deze technieken is Lattice Light-Sheet Microscopy (LLSM)12, die gebruik maakt van een gestructureerd lichtvel om het bleken van foto's drastisch te verlagen. Ontwikkeld in 2014 door Nobelprijswinnaar Eric Betzig, de hoge axiale resolutie, lage fotobleken en achtergrondgeluid, en het vermogen om tegelijkertijd beeld honderden vliegtuigen per gezichtsveld maken LLS microscopen superieur aan widefield, TIRF en confocale microscopen12,13,14,15,16,17,18,19. Deze vierdimensionale (x, y, z en tijd) imaging techniek, terwijl nog steeds diffractie beperkt (~ 200 nm XYZ resolutie), heeft een ongelooflijke temporele resolutie (we hebben een framerate van ongeveer 100 fps bereikt, wat resulteert in een 3D gereconstrueerdcelbeeld met 0,85 seconden per frame) voor 3D ruimtelijke acquisitie.
LLSM kan over het algemeen worden gebruikt om real-time dynamiek van elke moleculen in een cel op het eenmolecuul en eencellige niveau te volgen, met name die in zeer motile cellen zoals immuuncellen. We laten hier bijvoorbeeld zien hoe we LLSM kunnen gebruiken om t-cell receptor (TCR) dynamica te visualiseren. T-cellen zijn de effectorcellen van het adaptieve immuunsysteem. CDR's zijn verantwoordelijk voor de erkenning van peptide-MHC (pMHC) liganden weergegeven op het oppervlak van antigeen-presenterende cellen (APC), die de selectie, ontwikkeling, differentiatie, lot en functie van een T-cel bepaalt. Deze herkenning vindt plaats op de interface tussen T-cellen en APC's, wat resulteert in gelokaliseerde receptorclustering om de zogenaamde immunologische synaps te vormen. Hoewel het bekend is dat CVR's bij de immunologische synaps noodzakelijk zijn voor t-cel effector functie, nog onbekend zijn de onderliggende mechanismen van real-time TCR-handel naar de synaps. LLSM heeft ons in staat gesteld om in real time de dynamiek van CVR's voor en na de handel naar de synaps te visualiseren met de resulterende pMHC-TCR-interactie(figuur 1). LLSM kan daarom worden gebruikt om actuele vragen van de vormende dynamiek van CVR's op te lossen en inzichten te verschaffen om te begrijpen hoe een cel onderscheid maakt tussen zelf- en vreemde antigenen.

<table><tbody><tr><td>1 mL Syringe</td><td>BD</td><td>309659</td><td>Voor T-cel oogst</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148-25ML</td><td>Voor T-cel kweek</td></tr><tr><td>5 mm ronde dekglasjes</td><td>World Precision Instruments</td><td>502040</td><td>Voor beeldvorming</td></tr><tr><td>70um steriele celzeef</td><td>Corning</td><td>7201431</td><td>Voor T-cel oogst</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-muis TCR &bèta; keten Antilichaam</td><td>BioLegend</td><td>109215</td><td>Voor beeldvorming</td></tr><tr><td>Foetaal bovien serum (FBS)</td><td>X&amp;Y Cell Culture</td><td>FBS-500</td><td>Voor T-cel kweek</td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td>Dichtheidsgradiënt reagens voor T-cel oogst</td></tr><tr><td>Fluoresceïne natriumzout</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6377</td><td>Voor microscoop uitlijning</td></tr><tr><td>FluoSpheres Carboxylaat-gemodificeerde Microsferen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F8810</td><td>Voor microscoop uitlijning</td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td>N/A</td><td>Tracking Software; Andere opties voor tracking software zijn Amira of Trackmate (Fiji).</td></tr><tr><td>Lattice Light-Sheet Microscoop</td><td>3i</td><td>N/A</td><td>Gebruikte microscoop</td></tr><tr><td>Leibovitz's L-15 Medium, zonder fenol rood</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21083027</td><td>Voor beeldvorming</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030-081</td><td>Voor T-cel kweek</td></tr><tr><td>LLSpy</td><td>Janelia Research Campus</td><td>N/A</td><td>LLSpy werd gebruikt onder licentie van Howard Hughes Medical Institute, Janelia Research Campus. Neem contact op met innovation@janelia.hhmi.org voor toegang. Andere deconvolutie en deksewing methoden zijn beschikbaar in beeldverwerkingssoftware zoals Fiji, Slidebook, Amira en anderen. <a href="https://llspy.readthedocs.io/en/latest/" target="_blank">https://llspy.readthedocs.io/en/latest/</a></td></tr><tr><td>Moth Cytochroom C (MCC), sequentie ANERADLIAYLKQATK</td><td>Elimbio</td><td>Aangepaste synthese</td><td>Voor T-cel oogst</td></tr><tr><td>Penicilline/Streptomycine</td><td>Life Technologies</td><td>15140122_3683884612</td><td>Voor T-cel kweek</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine</td><td>Phenix Research Products</td><td>P8920-100ML</td><td>Voor beeldvorming</td></tr><tr><td>RBC Lysis Buffer</td><td>eBioscience</td><td>00-4300-54</td><td>Voor T-cel oogst</td></tr><tr><td>Recombinant muis IL-2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0523</td><td>Voor T-cel kweek</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>Corning</td><td>MT10040CV</td><td>Voor T-cel kweek</td></tr><tr><td>Slidebook</td><td>3i</td><td>N/A</td><td>LLSM beeldvormingssoftware</td></tr><tr><td>Chirurgische dissectie-instrumenten</td><td>Nova-Tech International</td><td>DSET10</td><td>Voor T-cel oogst</td></tr><tr><td>T-25 Flacons</td><td>Eppendorf</td><td>2231710126</td><td>Voor T-cel kweek</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Pierce Fab Micro Preparatie Kits</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>44685</td><td>Voor het bereiden van Fab</td></tr></tbody></table>

visualiseren van surface t-cell receptor dynamics vierdimensionaal met behulp van rooster light-sheet microscopie

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

De signalering en functie van een cel worden bepaald door de dynamische structuren en interacties van de oppervlaktereceptoren. Om de structuur-functie relatie van deze receptoren in situ echt te begrijpen, moeten we ze visualiseren en volgen op het levende celoppervlak met voldoende spatiotemporale resolutie. Hier laten we zien hoe we recent ontwikkelde Lattice Light-Sheet Microscopy (LLSM) kunnen gebruiken om T-celreceptoren (CDR's) vierdimensionaal (4D, ruimte en tijd) te beelden in het levende celmembraan. T-cellen zijn een van de belangrijkste effectorcellen van het adaptieve immuunsysteem, en hier gebruikten we T-cellen als voorbeeld om aan te tonen dat de signalering en functie van deze cellen worden aangedreven door de dynamiek en interacties van de CVR's. LLSM zorgt voor 4D-beeldvorming met een ongekende spatiotemporale resolutie. Deze microscopietechniek kan daarom over het algemeen worden toegepast op een breed scala aan oppervlakte- of intracellulaire moleculen van verschillende cellen in de biologie.

Hier beschrijven we de isolatie, voorbereiding en beeldvorming van primaire muis 5C. C7 T cellen met behulp van een rooster lichtplaat microscoop. Tijdens sectie 3 is het noodzakelijk om de microscoop correct uit te lijnen en dagelijks PSF te verzamelen om de gegevens na het verzamelen te deconvolveen. In figuur 2tonen we de juiste uitlijningsbeelden die te zien zijn bij het uitlijnen van de microscoop. Figuur 2A en figuur 2...

Het doel van dit protocol is om te laten zien hoe rooster Light-Sheet Microscopie te gebruiken om vierdimensionaal visualiseren oppervlakte receptor dynamiek in levende cellen. Hier worden T-celreceptoren op CD4+ primaire T-cellen weergegeven.

Visualiseren van Surface T-Cell Receptor Dynamics vierdimensionaal met behulp van Rooster Light-Sheet Microscopie

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

Rooster lichtplaat microscopie is een krachtige imaging technologie, maar weinig laboratoria in de wereld zijn in staat om het te gebruiken. Dit protocol geeft een gedetailleerd overzicht van het gebruik van de commercieel verkrijgbaar rooster lichtplaatmicroscoop. Het is een extreem krachtig systeem dat in staat is om vierdimensionale beeldvorming van individuele cellen of embryo's die het mogelijk maakt om real-time tracking van moleculen.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het driedimensionaal beeld enkele levende cellen of organen met een hoge spatiotemporale resolutie en minimale foto bleken. Het roosterpatroon van de lichtplaat stelt ons in staat om beelden met hoge snelheid te versnellen en real-time video's van driedimensionale levende cellen en organen te verkrijgen met moleculaire details die andere technieken niet kunnen bereiken. Dit eerste videoprotocol laat zien hoe we lichtplaatmicroscopie roosteren om eencellige vierdimensionale afbeelding.Dit is een zeer ingewikkelde techniek als gevolg van uitlijning en monster voorbereiding. En we geloven dat visuele demonstratie de toegankelijkheid zal verbeteren door meer wetenschappers in staat te stellen veel verschillende moleculen, cellen en organen in de biologie in beeld te brengen. Om deze procedure te beginnen, incubbateren vijf millimeter ronde coverslips met 0,1% poly-L-lysine bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.Aspirate uit de vloeistof en laat de coverslips lucht drogen natuurlijk. Voeg vervolgens drie milliliter dichtheidsgradiënt toe aan een conische buis van 15 milliliter. Voeg voorzichtig cellen drop-wise aan de rand van de buis.Centrifuge op 930 keer g en bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Verwijder hierna voorzichtig de dunne middelste laag cellen tussen de volledige media en het dichtheidsgradiëntreagereagereage om ervoor te zorgen dat elk celtype in een aparte conische buis wordt geplaatst. Centrifuge op 300 keer g gedurende vijf minuten om de cellen te wassen.Gooi de supernatant weg en voeg vijf milliliter RPMI toe aan de buizen van T-cellen en CH27-cellen. Herhaal de was met verse RPMI tot er drie totale wasbeurten zijn uitgevoerd. Vervolgens, resuspend de cellen in elke buis met een milliliter van volledige RPMI en tel de cellen met een hemocytometer.Een miljoen antigeen-presenterende cellen in 500 microliter van volledige RPMI en voeg 10 micromolar MCC toe. Incubeer bij 37 graden Celsius met 5%kooldioxide gedurende drie uur. Hierna worden een miljoen T-cellen opnieuw opgetrokken in 500 microliter van volledige RPMI.Voeg twee microgram anti-TCR beta Alexa 488 gelabeld FAB en incubeer bij 37 graden Celsius met 5% kooldioxide gedurende 30 minuten. Vervolgens centrifugeren beide cellen op 300 keer g gedurende vijf minuten en gooi de supernatant. Voeg 500 microliter van volledige RPMI toe en herhaal de centrifuge om de cellen te wassen.Herhaal de was met verse RPMI totdat drie totale wasbeurten zijn uitgevoerd weggooien van de supernatant na elke wasbeurt. Na deze, resuspend beide celtypes in 500 microliter van imaging media. Voeg eerst 10 milliliter water en 30 microliter fluoresceïne toe aan het LLSM-bad.Druk op Image Home om het object naar de beeldpositie te verplaatsen en naar één Bessel-laserstraalpatroon te kijken. Lijn de laserstraal uit met behulp van de geleide en het vooraf ingestelde interessegebied om van de straal een dun patroon te maken dat in alle richtingen in evenwicht is. De balk moet ook gericht verschijnen in de zoekcamera.Gebruik de twee spiegelkantelregelaars, de bovenste focusmicrometer en de objectieve kleur om de straal aan te passen. Was vervolgens het bad en de doelstellingen met ten minste 200 milliliter water om alle fluoresceïne volledig te verwijderen. Als u standaard tl-kralen wilt weergeven, schakelt u dither in door in het vak Xgalvo-bereik in te stellen op drie en drukt u op Live om het huidige veld weer te geven.Pas handmatig de kantelspiegel, objectieve kleur en focusmicrometer aan voor de hoogste grijze waarden. Pas vervolgens aan waar nodig om de juiste patronen te verkrijgen voor objectieve scan, Z galvo, Z plus doelstelling en voorbeeldscanopnamemodi. Druk hierna op Uitvoeren in de voorbeeldscanmodus om de voorbeeldpuntspreadfunctie voor de-scheeftrekken en de-convolutie te verzamelen.Wijzig de lasers in drie kleurenmodus en druk nogmaals op Uitvoeren. Om te beginnen, voeg 100,000 anti-presenterende cellen aan de voorbereide vijf millimeter diameter ronde coverslip en laat ze zich vestigen voor 10 minuten. Vet de monsterhouder in en voeg de coverslip toe aan de celzijde omhoog.Voeg vervolgens een druppel beeldvormingsmedia toe aan de achterkant van de coverslip. Schroef de monsterhouder op de Piëzo en druk op Image Home. Zoek een antigeen-presenterende cel naar beeld en zorg ervoor dat de LLSM- en imagingsoftware naar behoren functioneren.Druk op Live om de huidige afbeelding weer te geven. Beweeg langs Z om de coverslip en cellen te vinden. Zoek het midden van een antigeen-presenterende cel door in de Z-richting te bewegen en druk op Stop om de laser te pauzeren.Controleer 3D en voer de gewenste instellingen in. Druk op Center en druk vervolgens op Uitvoeren om de gegevens te verzamelen. Verlaag het podium naar de belastingspositie en voeg 50 microliters van T-cellen en imaging media drop-wise direct over de coverslip.Het is het beste om een druppelvorm aan het einde van de pipetpunt te laten en vervolgens de punt aan de badvloeistof aan te raken. Verhoog het podium terug door op Afbeeldingsrendement te klikken. Begin met beeldvorming.Zorg ervoor dat u de gewenste Z-stack en timelapselengte instelt. Bijvoorbeeld, afbeelding 60 Z stapels op een 0,4 micrometer stap grootte en input 500 tijdsbestek. Stop met opnemen voordat 500 frames worden bereikt om te voorkomen dat foto bleken.Gebruik de live-modus om te zoeken naar celparen en druk op Uitvoeren om gegevens te verzamelen als er klaar en gewenste instellingen zijn ingevoerd. In deze studie worden primaire muis 5CC7 T-cellen geïsoleerd en voorbereid en vervolgens afgebeeld met behulp van een rooster lichtbladmicroscoop. Hier worden de juiste bundel pad en bundel uitlijning wanneer afgebeeld met fluoresceïne.De objectieve scan moet een grote X-vorm in de XZ- en YZ-projecties weergeven die zo symmetrisch mogelijk zijn. Ze moeten ook worden aangepast om zo klein mogelijk van een X mogelijk te zijn. De Z galvo scan moet een ovaal in XZ en XY tonen met een enkele stip aan weerszijden.Ten slotte moeten zowel de Z plus objectieve scan als de monsterscan punten weergeven die er zo rond mogelijk uitzien. Met behulp van dit protocol kon de vierdimensionale dynamiek van de T-celreceptoren op een T-celoppervlak worden gezien. Het belangrijkste voordeel van deze microscoop ligt in de mogelijkheid om de gevisualiseerde oppervlakte-eenheden van de T-cel receptoren te volgen en om gekwantificeerde gegevens te verkrijgen van hun grootte, beweging, signaalintensiteit, en excreta.Het belangrijkste om te onthouden is de kwaliteit van uw uitlijning. Het rooster lichtplaat moet dagelijks worden uitgelijnd en niet goed te doen zal resulteren in vervormde beeldvorming. Ook de kwaliteit van de verzamelde PSF heeft direct invloed op de kwaliteit van de de-convolution die uiteindelijk resulteert in de kwaliteit van uw uiteindelijke beeld.Een van de redenen waarom deze methode is zo krachtig is omdat elke cel en label kan worden vervangen om veel celtypen en moleculen te visualiseren. Daarom kan deze methode worden gebruikt om elke vraag met betrekking tot vierdimensionale tracking van moleculen te beantwoorden. Wij denken dat deze techniek de weg zal effenen voor onderzoekers om nieuwe vragen op het gebied van moleculaire handel te verkennen.Het is nog niet op grote schaal gebruikt als gevolg van het ingewikkelde systeem, dus we hopen dat deze Jove video zal de toegankelijkheid van de techniek te verbeteren. De lasers die op het systeem worden gebruikt zijn klasse vier, dus absolute voorzichtigheid moet worden genomen om de laserveiligheid te garanderen. Neem de nodige laserveiligheidstrainingen voordat u deze methode gebruikt.

visualizing-surface-t-cell-receptor-dynamics-four-dimensionally-using

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Dit protocol beschrijft een methode om de afbeelding fluorescerende T-cellen geïntroduceerd in lymfeklier plakjes. De techniek maakt real-time analyses van T-cel migratie met traditionele groothoek fluorescentie of confocale microscopen.

Ex vivo beeldvorming van T-cellen in muizen lymfkliertest Plakjes met Widefield en confocale microscopen

De compartimentering van eiwitten, hetzij binnen het plasma membraan of in de intracellulaire locaties is een regulerend mechanisme die sterk kunnen beïnvloeden signalering resultaten, vandaar dat te begrijpen signalering is het van belang het bestuderen van de ruimtelijke en temporele gedrag van de betrokken eiwitten. We beschrijven hier een TIRF microscopie gebaseerde systeem om signaaltransductie in T-cellen te bestuderen, maar is breed toepasbaar.

Een TIRF Microscopie Techniek voor Real-time, gelijktijdige beeldvorming van de TCR en de bijbehorende signaaleiwitten

In this video, we describe the lattice light-sheet microscopy technique to visualize interactions between live T-cells and antigen-presenting cells. The method involves focusing an ultrathin lattice light sheet on an interacting cell pair to obtain a series of two-dimensional images, which are combined to obtain high-resolution four-dimensional images that reveal the spatiotemporal dynamics of the cell-cell interaction.

Lattice Light Sheet Microscopy to Visualize Receptor-Ligand Interactions in Live Cells

We beschrijven een live-cell imaging methode die inzicht geeft in eiwitdynamica tijdens de T-cel activatie proces. We tonen de totale gebruiksduur van de T-cel verspreiding assay, confocale microscopie en beeldanalyse te geven kwantitatieve resultaten volgen signalering complexvorming in T-cel activatie.

Real-time Live beeldvorming van T-cel signaleringscomplex Vorming

Hoge-resolutie intravitale beeldvorming met verbeterd contrast tot 120 urn diepte lymfklieren van volwassen muizen wordt bereikt door ruimtelijk moduleren van de excitatie patroon van een multi-focale twee-foton microscoop. In 100 micrometer diepte gemeten we resoluties van 487 nm (lateraal) en 551 nm (axiaal), waardoor verstrooiing en diffractie grenzen omzeilen.

Hoogst vastbesloten Intravitale Striped-verlichting Microscopie van Germinal Centers

Dit protocol beschrijft hoe totale interne reflectiefluorescentiemicroscopie te gebruiken om enkele receptoren op het oppervlak van levende cellen te visualiseren en te volgen en daarmee de laterale mobiliteit van receptoren, de grootte van receptorcomplexen te analyseren, evenals om voorbijgaande receptor-receptorinteracties te visualiseren. Dit protocol kan worden uitgebreid tot andere membraaneiwitten.

Hoge-resolutie Spatiotemporal Analyse van Receptor Dynamics door Single-molecule fluorescentie microscopie

Intercellulaire communicatie kritisch om diverse fysiologische activiteiten binnen en buiten de cel. Dit document beschrijft een protocol voor het meten van de ruimtelijke en temporele karakter van enkele cel afscheidingen. Om dit te bereiken, is een multidisciplinaire aanpak waarin label-free nanoplasmonic sensing met live-cell imaging integreert.

A-Label gratis Techniek voor de ruimte en tijd Imaging van Single Cell afscheiding

Adaptieve immuniteit wordt gecontroleerd door dynamische 'immunologische synapsen' gevormd tussen T-cellen en antigeen presenterende cellen. Dit protocol beschrijft methoden voor het onderzoeken van endotheelcellen, zowel als onderbelichte fysiologische APC's als ook als een nieuw type 'planair cellulair APC-model'.

Een endotheliale Planar Cell Model for Imaging Immunologische Synapse Dynamics

Om stromingssnelheden en directionaliteit van filamenteus-actine bij de T-cel immunologische synaps te onderzoeken, wordt live-cell superresolutie beeldvorming gecombineerd met totale interne reflectiefluorescentie en gekwantificeerd met behulp van ruimte-tijdelijke beeldcorrelatiespectroscopie.

Corticale actine Flow in T-cellen gekwantificeerd door ruimte en tijd Afbeelding Correlatie Spectroscopie van Structured Verlichting Microscopie Gegevens

Dit protocol beschrijft een imaging gebaseerde methode om te activeren met behulp van photoactivatable peptide-MHC, waardoor nauwkeurige Spatio controle van T cel activatie van T-lymfocyten.

Ruimtelijke en temporele controle van T cel activatie met behulp van een Photoactivatable-Agonist

Hier presenteren we een protocol om te visualiseren van immune cellen die zijn ingesloten in een matrix van de driedimensionale (3D) collageen met behulp van licht vel microscopie. Dit protocol wordt ook ingegaan hoe bijhouden van cel migratie in 3D. Dit protocol kan worden gebruikt voor andere soorten schorsing cellen in de 3D-matrix.

Licht vel microscopie voor driedimensionale visualisatie van menselijke Immune cellen

Leer hoe u rooster lichtveldmicroscopie gebruikt voor driedimensionale beeldvorming van T-celreceptordynamiek op CD4+ T-cellen. Deze methode biedt hoge ruimtelijke en temporele resolutie met minimaal fotobleken.

Visualiseren van Surface T-Cell Receptor Dynamics vierdimensionaal met behulp van Rooster Light-Sheet Microscopie

Meer video's verkennen