Visualiseren van Surface T-Cell Receptor Dynamics vierdimensionaal met behulp van Rooster Light-Sheet Microscopie

Rooster lichtplaat microscopie is een krachtige imaging technologie, maar weinig laboratoria in de wereld zijn in staat om het te gebruiken. Dit protocol geeft een gedetailleerd overzicht van het gebruik van de commercieel verkrijgbaar rooster lichtplaatmicroscoop. Het is een extreem krachtig systeem dat in staat is om vierdimensionale beeldvorming van individuele cellen of embryo's die het mogelijk maakt om real-time tracking van moleculen.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het driedimensionaal beeld enkele levende cellen of organen met een hoge spatiotemporale resolutie en minimale foto bleken. Het roosterpatroon van de lichtplaat stelt ons in staat om beelden met hoge snelheid te versnellen en real-time video's van driedimensionale levende cellen en organen te verkrijgen met moleculaire details die andere technieken niet kunnen bereiken. Dit eerste videoprotocol laat zien hoe we lichtplaatmicroscopie roosteren om eencellige vierdimensionale afbeelding.

Dit is een zeer ingewikkelde techniek als gevolg van uitlijning en monster voorbereiding. En we geloven dat visuele demonstratie de toegankelijkheid zal verbeteren door meer wetenschappers in staat te stellen veel verschillende moleculen, cellen en organen in de biologie in beeld te brengen. Om deze procedure te beginnen, incubbateren vijf millimeter ronde coverslips met 0,1% poly-L-lysine bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.

Aspirate uit de vloeistof en laat de coverslips lucht drogen natuurlijk. Voeg vervolgens drie milliliter dichtheidsgradiënt toe aan een conische buis van 15 milliliter. Voeg voorzichtig cellen drop-wise aan de rand van de buis.

Centrifuge op 930 keer g en bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Verwijder hierna voorzichtig de dunne middelste laag cellen tussen de volledige media en het dichtheidsgradiëntreagereagereage om ervoor te zorgen dat elk celtype in een aparte conische buis wordt geplaatst. Centrifuge op 300 keer g gedurende vijf minuten om de cellen te wassen.

Gooi de supernatant weg en voeg vijf milliliter RPMI toe aan de buizen van T-cellen en CH27-cellen. Herhaal de was met verse RPMI tot er drie totale wasbeurten zijn uitgevoerd. Vervolgens, resuspend de cellen in elke buis met een milliliter van volledige RPMI en tel de cellen met een hemocytometer.

Een miljoen antigeen-presenterende cellen in 500 microliter van volledige RPMI en voeg 10 micromolar MCC toe. Incubeer bij 37 graden Celsius met 5%kooldioxide gedurende drie uur. Hierna worden een miljoen T-cellen opnieuw opgetrokken in 500 microliter van volledige RPMI.

Voeg twee microgram anti-TCR beta Alexa 488 gelabeld FAB en incubeer bij 37 graden Celsius met 5% kooldioxide gedurende 30 minuten. Vervolgens centrifugeren beide cellen op 300 keer g gedurende vijf minuten en gooi de supernatant. Voeg 500 microliter van volledige RPMI toe en herhaal de centrifuge om de cellen te wassen.

Herhaal de was met verse RPMI totdat drie totale wasbeurten zijn uitgevoerd weggooien van de supernatant na elke wasbeurt. Na deze, resuspend beide celtypes in 500 microliter van imaging media. Voeg eerst 10 milliliter water en 30 microliter fluoresceïne toe aan het LLSM-bad.

Druk op Image Home om het object naar de beeldpositie te verplaatsen en naar één Bessel-laserstraalpatroon te kijken. Lijn de laserstraal uit met behulp van de geleide en het vooraf ingestelde interessegebied om van de straal een dun patroon te maken dat in alle richtingen in evenwicht is. De balk moet ook gericht verschijnen in de zoekcamera.

Gebruik de twee spiegelkantelregelaars, de bovenste focusmicrometer en de objectieve kleur om de straal aan te passen. Was vervolgens het bad en de doelstellingen met ten minste 200 milliliter water om alle fluoresceïne volledig te verwijderen. Als u standaard tl-kralen wilt weergeven, schakelt u dither in door in het vak Xgalvo-bereik in te stellen op drie en drukt u op Live om het huidige veld weer te geven.

Pas handmatig de kantelspiegel, objectieve kleur en focusmicrometer aan voor de hoogste grijze waarden. Pas vervolgens aan waar nodig om de juiste patronen te verkrijgen voor objectieve scan, Z galvo, Z plus doelstelling en voorbeeldscanopnamemodi. Druk hierna op Uitvoeren in de voorbeeldscanmodus om de voorbeeldpuntspreadfunctie voor de-scheeftrekken en de-convolutie te verzamelen.

Wijzig de lasers in drie kleurenmodus en druk nogmaals op Uitvoeren. Om te beginnen, voeg 100,000 anti-presenterende cellen aan de voorbereide vijf millimeter diameter ronde coverslip en laat ze zich vestigen voor 10 minuten. Vet de monsterhouder in en voeg de coverslip toe aan de celzijde omhoog.

Voeg vervolgens een druppel beeldvormingsmedia toe aan de achterkant van de coverslip. Schroef de monsterhouder op de Piëzo en druk op Image Home. Zoek een antigeen-presenterende cel naar beeld en zorg ervoor dat de LLSM- en imagingsoftware naar behoren functioneren.

Druk op Live om de huidige afbeelding weer te geven. Beweeg langs Z om de coverslip en cellen te vinden. Zoek het midden van een antigeen-presenterende cel door in de Z-richting te bewegen en druk op Stop om de laser te pauzeren.

Controleer 3D en voer de gewenste instellingen in. Druk op Center en druk vervolgens op Uitvoeren om de gegevens te verzamelen. Verlaag het podium naar de belastingspositie en voeg 50 microliters van T-cellen en imaging media drop-wise direct over de coverslip.

Het is het beste om een druppelvorm aan het einde van de pipetpunt te laten en vervolgens de punt aan de badvloeistof aan te raken. Verhoog het podium terug door op Afbeeldingsrendement te klikken. Begin met beeldvorming.

Zorg ervoor dat u de gewenste Z-stack en timelapselengte instelt. Bijvoorbeeld, afbeelding 60 Z stapels op een 0,4 micrometer stap grootte en input 500 tijdsbestek. Stop met opnemen voordat 500 frames worden bereikt om te voorkomen dat foto bleken.

Gebruik de live-modus om te zoeken naar celparen en druk op Uitvoeren om gegevens te verzamelen als er klaar en gewenste instellingen zijn ingevoerd. In deze studie worden primaire muis 5CC7 T-cellen geïsoleerd en voorbereid en vervolgens afgebeeld met behulp van een rooster lichtbladmicroscoop. Hier worden de juiste bundel pad en bundel uitlijning wanneer afgebeeld met fluoresceïne.

De objectieve scan moet een grote X-vorm in de XZ- en YZ-projecties weergeven die zo symmetrisch mogelijk zijn. Ze moeten ook worden aangepast om zo klein mogelijk van een X mogelijk te zijn. De Z galvo scan moet een ovaal in XZ en XY tonen met een enkele stip aan weerszijden.

Ten slotte moeten zowel de Z plus objectieve scan als de monsterscan punten weergeven die er zo rond mogelijk uitzien. Met behulp van dit protocol kon de vierdimensionale dynamiek van de T-celreceptoren op een T-celoppervlak worden gezien. Het belangrijkste voordeel van deze microscoop ligt in de mogelijkheid om de gevisualiseerde oppervlakte-eenheden van de T-cel receptoren te volgen en om gekwantificeerde gegevens te verkrijgen van hun grootte, beweging, signaalintensiteit, en excreta.

Het belangrijkste om te onthouden is de kwaliteit van uw uitlijning. Het rooster lichtplaat moet dagelijks worden uitgelijnd en niet goed te doen zal resulteren in vervormde beeldvorming. Ook de kwaliteit van de verzamelde PSF heeft direct invloed op de kwaliteit van de de-convolution die uiteindelijk resulteert in de kwaliteit van uw uiteindelijke beeld.

Een van de redenen waarom deze methode is zo krachtig is omdat elke cel en label kan worden vervangen om veel celtypen en moleculen te visualiseren. Daarom kan deze methode worden gebruikt om elke vraag met betrekking tot vierdimensionale tracking van moleculen te beantwoorden. Wij denken dat deze techniek de weg zal effenen voor onderzoekers om nieuwe vragen op het gebied van moleculaire handel te verkennen.

Het is nog niet op grote schaal gebruikt als gevolg van het ingewikkelde systeem, dus we hopen dat deze Jove video zal de toegankelijkheid van de techniek te verbeteren. De lasers die op het systeem worden gebruikt zijn klasse vier, dus absolute voorzichtigheid moet worden genomen om de laserveiligheid te garanderen. Neem de nodige laserveiligheidstrainingen voordat u deze methode gebruikt.