Oprichting van een High-throughput Setup voor het screenen van kleine moleculen die Moduleer c-di-GMP Signalering in

Het algemene doel van deze procedure is om kleine moleculen te identificeren die de intracellulaire niveaus van de second messenger cyclisch-di-GMP moduleren in de opportunistische pathogeen Pseudomonas aeruginosa aan de hand van een high-throughput bio-reporter screen. Deze methode kan helpen bij het ontdekken van kleine moleculen die de bio-informatie van Pseudomonas aeruginosa en andere deeltjes beïnvloeden via modulatie van cyclisch-di-GMP. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze zeer robuust en veelzijdig is, waardoor het screenen van meer dan 3.500 verbindingen binnen 48 uur mogelijk is.

De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de ontwikkeling van nieuwe therapieën die Pseudomonas aeruginosa potentieel gevoeliger maken voor het immuunsysteem of bestaande antibiotica, terwijl er een geringere, selectieve druk op de bacteriën wordt uitgeoefend. Inoculeer 5 mL lysogeniebouillon, of LB-medium, met een enkele kolonie P. aeruginosa bij 37 °C, onder schudden op 200 rpm. Draag vervolgens 2 mL van de overnight-cultuur over naar 200 mL vers LB-medium in een kolf van 1 L en incubeer dit bij 37 °C onder schudden op 200 rpm.

Monitor de optische dichtheid bij 600 nanometer of OD 600 elke 30 minuten door een monster van 1 milliliter uit de kolf te nemen en dit met een spectrofotometer te analyseren. Wanneer de OD 600 een waarde tussen 0,3 en 0,5 bereikt, breng dan 40 milliliter van de cultuur over in een conische centrifugebuis van 50 milliliter. Pelleteer de cellen door te centrifugeren bij 8000 rpm gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius.

Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 40 milliliters ijskoude steriele 300 millimolar sucrose-oplossing. Centrifugeer de cellen voor een tweede maal en resuspendeer ze in 20 milliliters ijskoude steriele 300 millimolar sucrose-oplossing. Centrifugeer de cellen opnieuw en resuspendeer ze in 400 microliters van de 300 millimolar sucrose-oplossing. Koel de cellen 30 minuten op ijs, waarna ze klaar zijn voor electroporatie.

Voeg vervolgens één µL van een 0,2 µg/µL oplossing van het plasmide dat de CdrA-promotor codeert voor het gen dat het groen fluorescent eiwit codeert toe aan 40 µL van de voorbereide electro-competente P.Aeruginosa cellen in een 1,5 mL microcentrifugebuisje dat vooraf op ijs is gekoeld. Meng de suspensie en breng deze over in een vooraf gekoelde electroporatiecuvet met een elektrodeafstand van 2 mm. Verwijder vocht aan de buitenkant van de cuvet met vloeipapier en plaats de cuvet in de monsterkamer van de electroporator.

Zet de oplossing bloot aan een puls met een spanning van 2,5 kilovolt, een capaciteit van 25 microfarad en een weerstand van 200 ohm. Verwijder de cuvette en voeg één milliliter LB-medium toe. Breng de cellen vervolgens over naar een steriele 1,5 milliliter microcentrifugebuis en incubeer deze gedurende twee uur bij 37 graden Celsius onder schudden bij 200 rpm.

Verspreid na incubatie aliquots van 10 µL, 50 µL en 100 µL van de cultuur op steriele LB-agarplaten aangevuld met ampicilline en incubeer de platen gedurende de nacht bij 37 °C. Bevestig de GFP-expressie door de plaat te onderzoeken onder een fluorescentiemicroscoop met een standaard GFP-kanaal. Selecteer een enkele kolonie en inoculeer deze in 5 mL LB. Meng na incubatie gedurende de nacht 0,5 mL van de overnachtcultuur met 0,5 mL 50% glycerol in een buisje van 2 mL met schroefdop en bewaar dit bij -80 °C.

Twee dagen voor de screening wordt de voorbereide P.aeruginosa-stam vanuit de voorraad bij -80 °C op een LB-agarplaat geplaatst door de bacteriën voorzichtig over de plaat te verspreiden met een steriele inoculatielus. Incubeer de plaat gedurende de nacht bij 37 °C. De avond voor de screening wordt een enkele kolonie P.aeruginosa van de plaat geïnoculeerd in 10 ml LB-medium in een buis.

Incubeer de precultuur overnacht bij 37 graden Celsius met schudden op 200 rpm. Bereid op de dag van de screening een subcultuur uit de overnacht precultuur door deze eerst te verdunnen met vers LB-medium tot een OD 600 van 1,0, en vervolgens verder te verdunnen met 5% LB tot een OD 600 van 0,4. Voeg een steriele magnetische roervis in de container en roer de cultuur 30 minuten op minimale snelheid met een magnetische roerder bij kamertemperatuur.

Dit stelt de bacteriën in staat om te acclimatiseren aan het medium voordat ze in 384-wells platen worden gedispergeerd. Om de positieve controle voor te bereiden, worden 20 µL Tobramycin Sulfate toegevoegd aan 10 mL van de voorbereide subcultuur en voorzichtig gemengd. Pipetteer 40 µL van de positieve controlecultuur in de wells A23 tot en met P23.

Voeg voor het bereiden van de negatieve controle 30 µL Dimethylsulfoxide toe aan 10 mL van de voorbereide subcultuur en meng voorzichtig. Pipetteer 40 µL van de negatieve controlecultuur in de wells A24 tot en met P24. Inoculeer voor elke plaat die met de kleine moleculen is behandeld een volume van 40 µL van de verdunde overnight-culturen in de wells A1 tot en met P22.

Verzegel de platen met een luchtdoorlatende afdekfolie en incubeer ze gedurende zes uur bij 37 °C. Warm de platenlezer ongeveer 30 minuten voor de spectrofotometrische meting voor tot 37 °C om condensatie te voorkomen. Verwijder de luchtdoorlatende afdekfolie voorzichtig van de plaat voordat u de metingen uitvoert.

Meet vervolgens de optische dichtheid bij een golflengte van 600 nanometer met een instelling van 10 flitsen per well en een stabilisatietijd van 0,2 seconden. Voer vóór het meten van de fluorescentie een automatische gain- en focusaanpassing uit op basis van de negatieve controlewell A24 en stel de doelwaarde voor de gain in op 75%. Selecteer focusaanpassing en kanaal A aan de rechterkant van het venster. Meet de fluorescentie van de GFP-reporter bij een excitatiemaximum van 485 nanometer en een emissiemaximum van 520 nanometer met een instelling van 10 flitsen per well en een stabilisatietijd van 0,2 seconden.

Verzamel gegevens van alle onderzochte plaatjes. Gegevensmetingen worden standaard automatisch opgeslagen door de aansturingssoftware van de platenlezer. Om de gegevens te analyseren, bekijk je de metingen door op het Mars-icoon in de aansturingssoftware te klikken om het pakket voor statistische analyse te openen.

Krijg toegang tot de gegevens door dubbel te klikken op het gewenste plaatnummer om de data voor analyse op te roepen. Evalueer de uniformiteit en reproduceerbaarheid van de assay met behulp van een robuuste Z-prime analyse. Bereken vervolgens het groei-inhibitiepercentage en beoordeel het inhibitiepercentage van het intracellulaire niveau van c-di-GMP, zoals gedetailleerd beschreven in het tekstprotocol.

Deze figuur beschrijft representatieve ruwe gegevens voor OD 600 en GFP uit de high-throughput screening. Er is een kleurovergangs-heatmap toegepast op de waarden van de putjes, waarbij warme naar koele kleuren lage naar hoge waarden aangeven. De gegenereerde gegevens zijn geanalyseerd op het percentage inhibitie en worden hier weergegeven voor zowel de OD 600 als de GFP-uitlezingen.

Kleine moleculen die mogelijk de groei en intracellulaire c-di-GMP remmen, zullen over het algemeen in het groen worden weergegeven, terwijl kleine moleculen die mogelijk de groei en intracellulaire c-di-GMP-niveaus bevorderen, over het algemeen in het rood worden weergegeven. Stippendiagrammen worden gebruikt om het percentage remming te vergelijken dat is verkregen van elk getest klein molecuul. Elk klein molecuul wordt weergegeven door een klein stipje en de distributie van het percentage remming voor zowel de OD 600 als de GFP-uitlezingen wordt getoond.

Een afkapwaarde van plusminus 50% is geselecteerd voor de identificatie van hits. Potentiële hits zijn rood gemarkeerd. Voor elke interessante verbinding worden dosis-responsmetingen uitgevoerd.

Hier worden twee geïdentificeerde verbindingen getest in een dose-responsassay met 10 punten, een maximale concentratie van 2 mM en een tweevoudige verdunningsreeks. Het fitten van een vierparameter logistische functie op de gegevens leverde halfmaximale remmende concentratiewaarden op van 158 µM en 193 µM voor elke verbinding. Zodra deze techniek beheerst is, kan deze worden gebruikt om meer dan 3.500 verbindingen binnen 48 uur te screenen.

Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe u Pseudomonas aeruginosa robuust kunt screenen op verbindingen die interfereren met c-di-GMP-signalering. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de screeningscondities vergelijkbaar moeten blijven wanneer er over meerdere dagen wordt gescreend. Na een single-point screen kan het uitvoeren van een dosis-respons-screen met hetzelfde protocol de hits valideren.

Deze techniek baant de weg voor onderzoekers om potentiële kleine moleculen te identificeren die interfereren met de biofilmvorming en antibioticaresistentie van Pseudomonas aeruginosa. Belangrijk is dat deze techniek kan worden aangepast voor gebruik bij elke relevante bacterie en kan worden gemodificeerd om andere outputs of inputs te onderzoeken, zoals een effect op de bacteriële levensvatbaarheid. Vergeet tot slot niet dat het werken met Pseudomonas aeruginosa gevaarlijk kan zijn.

En er moeten altijd voorzorgsmaatregelen worden genomen, zoals het dragen van persoonlijke beschermingsmiddelen, bij het uitvoeren van deze procedure.