Oprichting van een High-throughput Setup voor het screenen van kleine moleculen die Moduleer c-di-GMP Signalering in Pseudomonas aeruginosa

Het algemene doel van deze procedure is om kleine moleculen te identificeren die de intracellulaire niveaus van de tweede boodschapper cyclisch-di-GMP in de opportunistische ziekteverwekker, Pseudomonas aeruginosa, moduleren door middel van een high-throughput bio-reporter screen. Deze methode kan helpen bij het ontdekken van kleine moleculen die interfereren met Pseudomonas aeruginosa bio-informatie en andere deeltjes door middel van cyclisch-di-GMP modulatie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze zeer robuust en veelzijdig is, waardoor het screenen van meer dan 3.500 verbindingen binnen 48 uur mogelijk is.

De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot het ontwikkelen van nieuwe therapieën die mogelijk gevoelig zijn voor Pseudomonas aeruginosa, het immuunsysteem of bestaande antibiotica, terwijl ze een kleinere, selectieve druk op de bacteriën uitoefenen. Inoculateer vijf milliliter lysogeny-bouillon of LB-medium met een enkele kolonie van P.aeruginosa, zeven graden Celsius, met schudden op 200 rpm. Breng vervolgens twee milliliter van de overnachtelijke cultuur over in 200 milliliter vers LB-medium in een literkolf en incubeer bij 37 graden Celsius met schudden op 200 rpm.

Bewaak de optische dichtheid bij 600 nanometer of OD 600, elke 30 minuten door een monster van 1 milliliter uit de kolf te nemen en te onderzoeken met behulp van een spectrofotometer. Wanneer de OD 600 tussen 0,3 en 0,5 bereikt, plaatst u 40 milliliter van de cultuur in een 50 milliliter conische centrifugeerbuis. Pellet de cellen door 10 minuten bij 8000 rpm bij vier graden Celsius te centrifugeren.

Gooi het supernatant weg en suspendeer de cellen in 40 milliliter ijskoud steriel 300 millimolair sucrose-oplossing. Na een tweede keer centrifugeren, suspendeer in 20 milliliter ijskoud steriel 300 millimolair sucrose-oplossing. Centrifugeer de cellen opnieuw en suspendeer in 400 microliter van de 300 millimolair sucrose-oplossing. Koel de cellen gedurende 30 minuten op ijs, waarna ze klaar zijn voor elektroporatie.

Voeg vervolgens een microliter van een 0,2 microgram per microliter oplossing van plasmide dat de CdrA-promotor codeert voor het gen dat codeert voor het groene fluorescerende eiwit toe aan 40 microliter van de voorbereide P.Aeruginosa elektro-competente cellen in een 1,5 milliliter microcentrifugebuis die vooraf op ijs is gekoeld. Meng de suspensie en breng deze over in een voorgekoelde elektroporatiecuvet met een elektrodenopening van 2 millimeter. Verwijder vocht aan de buitenkant van de cuvet met tissuepapier en plaats de cuvet in de monsterkamer van de elektroporator.

Pulseer de oplossing met een spanning van 2,5 kilovolt, capacitieve reactanten van 25 microfarad en een weerstand van 200 ohm. Verwijder de cuvet en voeg een milliliter LB-medium toe. Breng vervolgens de cellen over in een steriele 1,5 milliliter microcentrifugebuis en incubeer gedurende twee uur bij 37 graden Celsius met schudden op 200 rpm.

Na incubatie, verdeel 10 microliter, 50 microliter en 100 microliter aliquoten van de cultuur op steriele LB-agarplaten aangevuld met Ampicilline en incubeer de platen bij 37 graden Celsius overnacht. Bevestig de GFP-expressie door de plaat onder een fluorescentiemicroscoop met een standaard GFP-kanaal te onderzoeken. Kies een enkele kolonie en inoculeer in vijf milliliter LB. Na overnachtelijke incubatie, meng 0,5 milliliter van de overnachtelijke cultuur met 0,5 milliliter van 50% glycerol in een 2 milliliter schroefdopbuis en bewaar bij min 80 graden Celsius.

Twee dagen voor de screening, plateer de voorbereide P.aeruginosa-stam van de min 80 graden Celsius-voorraad op een LB-agarplaat door de bacteriën voorzichtig over de plaat te verspreiden met behulp van een steriele inoculatiesluis. Incubeer de plaat overnacht bij 37 graden Celsius. De avond voor de screening, inoculeer een enkele kolonie van P.aeruginosa van de plaat in 10 milliliter LB-medium in een buis.

Incubeer de voorcultuur overnacht bij 37 graden Celsius met schudden op 200 rpm. Op de dag van de screening, bereid een subcultuur voor vanuit de overnachtelijke voorcultuur door deze eerst te verdunnen met vers LB-medium tot een OD 600 van 1,0 en vervolgens verder te verdunnen met 5%LB tot een OD 600 van 0,4. Voeg een steriele magnetische roerstaaf toe aan de container en roer de cultuur gedurende 30 minuten op kamertemperatuur op minimale snelheid op een magnetische roerder.

Dit stelt de bacteriën in staat zich aan te passen aan het medium voordat ze worden verdeeld in 384-well platen. Om de positieve controle voor te bereiden, voeg 20 microliter Tobramycin Sulfaat toe aan 10 milliliter van de bereide subcultuur en meng voorzichtig. Pipet 40 microliter van de positieve controlecultuur in de putten A23 tot P23.

Om de negatieve controle voor te bereiden, voeg 30 microliter Dimethyl Sulfoxide toe aan 10 milliliter van de bereide subcultuur en meng voorzichtig. Pipet 40 microliter van de negatieve controlecultuur in de putten A24 tot P24. Voor elk van de platen die zijn bevochtigd met de kleine moleculen, inoculeer een volume van 40 microliter van de verdunde overnachtelijke culturen in de putten A1 tot P22.

Versluit de platen met een luchtdoorlatende dekselafdichting en incubeer gedurende zes uur bij 37 graden Celsius. Ongeveer 30 minuten voor spectrofotometrische meting, verwarm de platenlezer vooraf tot 37 graden Celsius om condensatie te voorkomen. Verwijder voorzichtig de luchtdoorlatende dekselafdichting van de plaat voor het lezen.

Meet vervolgens de optische dichtheid bij een golflengte van 600 nanometer met een instelling van 10 flitsen per put en een settling tijd van 0,2 seconden. Voorafgaand aan het meten van fluorescentie, maak een automatische gain en focale aanpassing op basis van de negatieve controleput A24 en stel de gain doelwaarde in op 75%. Selecteer focusaanpassing en kanaal A aan de rechterkant van het venster. Meet de fluorescentie van de GFP-reporter bij een excitatiemaximum van 485 nanometer en een emissiemaximum van 520 nanometer met een instelling van 10 flitsen per put en een