Een grafische gebruikersinterface voor software-assisted tracking van eiwitconcentratie in dynamische cellulaire protrusies

Het algemene doel van deze beeldanalysesoftware is de parallelle analyse van de dynamica van uitsteeksels en de relatieve eiwitconcentratie over de hele lengte van de filopodium. Deze methode kan ons echt helpen om belangrijke vragen in de celbiologie te begrijpen, vooral de individuele eiwitten die betrokken zijn bij de uitbreiding en inklemming van filopodia. Het grote voordeel van de techniek is dat de aangepaste vormvolg-algoritme die wordt geleverd, een kwantitatieve beoordeling van de dynamica van uitsteeksels en ruimtelijk opgeloste eiwitlokalisatie mogelijk maakt.

Om te beginnen, kweek neuronen, HeLa of COS-cellen, in aangevuld medium zoals beschreven in het tekstprotocol. Zodra 40% confluency is bereikt, transvecteer de cellen met de constructen van keuze, met behulp van een transvectiereagens volgens de instructies van de fabrikant. Bewaar de transvecteerde cellen in een incubator bij 37 graden Celsius en 5% CO2 gedurende 15 tot 18 uur.

Na incubatie, vul de celcultuurkamers tot 90% met 37 graden Celsius voorverwarmd medium, dat 20 millimolair HEPES bevat, om veranderingen in pH en osmolariteit te verminderen als gevolg van verdamping tijdens beeldacquisitie. Om de deksel af te sluiten, breng een dunne laag vacuümvet aan op de binnenkant van het deksel en druk het voorzichtig op de kweekkamer met de transvecteerde cellen. Mogelijk is het belangrijkste onderdeel voor beeldaanalyse de beeldkwaliteit.

Een ding waar we op moeten letten, is de signaal-ruisverhouding, die meer dan vier moet zijn en we kunnen dat waarborgen door de belichtingstijd van de camera en de laserintensiteit aan te passen en de kracht zou het volgframe moeten zijn van meer dan één hertz. Verwerf de beelden met behulp van een microscoop met een 60x of 100x objectief en geen pixelvervorming. Gebruik verwervingssnelheden niet minder dan één hertz om de dynamica van filopodia te volgen.

Om uit-focus artefacten te minimaliseren, beeld filopodia dicht bij de basilaire membraan. Om een soepele volging te garanderen, pas de belichtingstijd van de camera en laserintensiteit aan zodat de signaal-ruisverhouding groter is dan vier. Zodra dit voltooid is, start de beeldacquisitie.

Na beeldvoorverwerking, zoals beschreven in het tekstprotocol, laad de beelden door de gecomprimeerde map met alle vereiste bestanden voor beeldaanalyse te downloaden. Pak uit en kopieer bestanden naar de werkmap. Zodra geïnstalleerd, start de grafische gebruikersinterface door het bestand genaamd filopodiaAnalysisM3.fig te openen.

Laad de opgeslagen stack TIFF-bestanden voor individuele eiwitten in de grafische gebruikersinterface of GUI. Gebruik de knoppen 1B voor eiwit A, 1C voor eiwit B en optioneel 1D voor eiwit C. Maak een overgelegd beeld van de cel uit de eiwitkanalen door op 1A te klikken. Klik vervolgens op 2A om het eerste frame toe te wijzen en klik op 2B om het laatste frame voor de analyse toe te wijzen.

Optioneel, knips de interessegebied of ROI, dat het filopodium van belang bevat, met de 2H-knop. Draai het beeld met de 2I-knop, of verwijder ongewenste gebieden met behulp van de vrijhandtekeningtool, 2J. Beweeg de schuifregelaar, 2C voor elk frame voor kwaliteitscontrole en om te controleren of het filopodium duidelijk zichtbaar blijft gedurende de hele film.

Om de trace te genereren, klik eerst op de 3A-knop in het GUI-venster één, om GUI-venster twee te openen. Klik op de vier-knop in GUI-venster twee, om de massa van het overgelegde cellichaam te genereren dat werd gegenereerd in GUI-venster één, na het klikken op 1A. We raden aan om wat tijd te besteden aan het optimaliseren van parameters zoals het aantal segmenten, de scanbreedte en de scanradius voor uw experimentele dataset.

Beweeg de schuifregelaar in venster nummer twee, om te controleren waar de filopodiale punt voor het eerst verschijnt. Klik vervolgens op knop vijf en de cursor verschijnt. Gebruik de cursor om de basis te selecteren van waar de afstand van het filopodiale punt wordt gemeten.

Volg het punt van de filopodia in het frame waar het voor het eerst verschijnt. Selecteer vervolgens de drempellengte boven welke de filopodia zal buigen, met behulp van 6C. Geef vervolgens het aantal segmenten op dat wordt gebruikt om de vorm van de filopodia te benaderen in vak 6A.

Specificeer de scanbreedte, die fungeert als een horizontale scanner, om de knooppunten in 6B te plaatsen. Geef de scanradius op in vak 6D, gebruik een waarde die ongeveer 50% groter is dan de waargenomen inter-frame tip-verplaatsing. Specificeer vervolgens de buighoek in vak 6E.

Controleer de geschiedenis van het vak in GUI-venster twee, om het hele volgprotocol voor toekomstig gebruik op te slaan en klik vervolgens op de track en analyseknop om te beginnen met volgen. Voor ruimtelijk-temporele analyse, selecteer het vak gerepresenteerd door 8B, gevolgd door het eiwitkanaal van belang. Klik op 8A om eiwittracking langs de filopodiale lengte te starten, met behulp van de eerder gegenereerde trace.

Voor ratiometrische eiwitanalyse, vink vak 9B of 9C aan en klik op de knop 9A om de ruimtelijk-temporele ratiometrische plot te krijgen. Om de filopodiale tipanalyse uit te voeren, vink vak 8F aan en specificeer de tiplengte en drempellengte vanaf de basis, met behulp van 8G en 8H. Klik op de drukknop om de gegevens op te slaan in een excel-bestand genaamd dynamics.xlsx.

Klik vervolgens op eiwitintensiteiten analyseren om de trace van eiwitintensiteiten van de filopodiale punt te genereren en op te slaan voor ratiometrische analyse. Klik op de gewenste verhouding die moet worden geanalyseerd, met behulp van 9D of 9E. Klik ten slotte op de vergelijk-knop 9A om de ratiometrische gegevens te genereren.

De analyse van COS-cellen die zijn transvecteerde met een marker voor filamenteus actine in rood, en een cytosolische referentie in groen, onthullen actinerijke filopodiale uitsteeksels. Een tijdsreeks toont dat actinerijke filopodiale uit