Open Source High Content Analysis Door gebruik te maken van de automaten Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Het algemene doel van deze procedure is om aan te tonen hoe time-gated fluorescentie-levensduur imaging microscopie, of FLIM, kan worden geïmplementeerd in een geautomatiseerde workflow met multi-well platen, gebruikmakend van opensourcesoftware en basisinstrumentatie. Deze methodologie kan worden toegepast op FLIM-gebaseerde uitlezingen in een reeks gefixeerde cellen of levende cellen. Bovendien is het bijzonder nuttig voor het uitlezen van cel-signaalverwerking of proteïne-interacties.

De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat FLIM robuuste kwantitatieve resultaten oplevert en in één enkele meting de fractie van de interactiepopulatie kan bepalen. Door globale analysetechnieken toe te passen op duizenden cellen over honderden beeldvelden, kunnen we gebruikmaken van Förster resonance energy transfer, of FRET-metingen, en profiteren van bijvoorbeeld levensduurveranderingen tot ongeveer 20 picoseconden.

De procedure zal worden gedemonstreerd door Frederik Gorlitz, samen met Sunil Kumar, onze onderzoeksmedewerker, en Ian Munro, onze softwareontwikkelaar. Begin met het opstarten van de micromanager en open de openFLIM-HCA-plugin. Selecteer onder het tabblad FLIM-besturing het bestand voor delay box-kalibratie en open de kalibratiebestanden.

Selecteer het kalibratiebestand voor de specifieke combinatie van de vertragingsgenerator en de laserherhalingssnelheid die van belang is. Selecteer onder het bestandsmenu 'set base folder' en kies de map waarin de gegevens worden opgeslagen. Nadat is bevestigd dat alle juiste parameters zijn ingesteld, stelt u handmatig een gate-breedte van vier nanoseconden in op de bedieningskast van de gated optische intensificator voor het gehele experiment.

Om beeldata van de instrumentresponsfunctie te verkrijgen, plaatst u handmatig een straalblok in de filterkubuskasette vóór het objectief om te voorkomen dat er laserlicht ontsnapt, en richt u het straalblok zodanig dat reflecties terug in het microscoopframe worden geminimaliseerd. Stel onder het tabblad voor de besturing van het lichtpad de excitatie-, dichroïsche en emissiefilters in de spinning disk-eenheid zodanig in, dat het deel van het excitatielicht dat door de roterende Nipkow-schijf wordt verstrooid, kan worden afgebeeld zonder het systeem te verzadigen bij een cameratijd van minimaal 200 milliseconden. Gebruik onder het FLIM-besturingstabblad de functie 'find max point' over het volledige bereik van de vertragingen die door de programmeerbare fast delay box worden gedekt.

Controleer vervolgens het weergegeven outputspoor. Stel de vertragingstijden van de loop zo in dat het volledige profiel van de instrumentresponsfunctie binnen het scanbereik van de fast delay-box valt. Pas de parameters voor de neutrale dichtheid en de belichtingstijd aan.

Pas daarna de frame-accumulatie aan, zodat de camera niet verzadigd raakt tijdens de helderheidstijdpoort en de effectieve integratietijd niet minder is dan 200 milliseconden. Selecteer in het FLIM-besturingsmenu het vakje fast delay en stel vertragingsstappen van 25 picoseconden in over het volledige vertragingsbereik. Selecteer vervolgens populate delays en klik op snap FLIM image om een afbeelding van de instrumentresponsfunctie te verkrijgen.

Wacht vervolgens tot de acquisitie is voltooid. Selecteer in het menu voor de besturing van het lichtpad 'neutral density' en klik op 'blocked' om de laser te blokkeren. Open het FLIM-besturingsmenu en selecteer 'fast delay box' om het aantal vertragingsstappen te verminderen door de waarde in het vak voor het increment te verhogen.

Klik vervolgens op snap FLIM image om een achtergrondbeeld van de camera vast te leggen. Om referentiedie-gegevens te verkrijgen, gaat u naar het tabblad XYZ-besturing en voert u H4 in bij het dialoogvenster 'ga naar put'. Ga daarna naar het tabblad besturing lichtpad en selecteer de juiste excitatie-, dichroïsche en emissiefilters voor het beelden van het M turquoise fluorescente eiwit met behulp van de functie 'find max point' over het volledige bereik van het vak voor de snelle vertraging.

Stel vervolgens, zoals zojuist gedemonstreerd, de juiste parameters in voor het verkrijgen van de referentiekleurstofgegevens en een bijbehorend achtergrondbeeld. Om FLIM-gegevens van een monster in een multi-well plaat te verkrijgen, gaat u naar het menu voor HCA sequenced acquisition in de setup. Selecteer het tabblad XYZ-posities en stel in welke wells gefotografeerd moeten worden en het aantal gezichtsvelden (fields of view) dat per well moet worden verkregen.

Selecteer een representatief gezichtsveld met het te beelden monster en stel het optimale neutraaldichtheidsfilter in de integratietijd van de camera in om 75% van het dynamische bereik van de uitleescamera te bereiken. Selecteer onder het XYZ-besturingstabblad de optie focus terugzetten in het autofocus-dialoogvenster en stel de microscoop handmatig scherp op de cellen of structuren van belang. Stel het zoekbereik van de autofocus in op 2000 micrometers en druk op enter.

Klik vervolgens op AF now om de autofocusprocedure te starten. Er verschijnt een offsetwaarde in het veld focus offset auto focus. Voer deze offsetwaarde in het venster AF offset in en klik tweemaal op AF now om de autofocusprocedure te herhalen.

De offsetwaarden moeten nu op nul staan, wat duidt op een correcte werking van het autofocus-systeem. Selecteer vervolgens onder het tabblad FLIM-besturing de autogating-functie om een logaritmische bemonstering van de vertragingspunten te waarborgen. Stel het aantal te accumuleren frames in op een waarde die de gewenste totale tijd voor gegevensverwerving oplevert.

Klik vervolgens in het dialoogvenster voor de FLIM-acquisitie op de knop voor het starten van de HCA-sequentie om de FLIM-acquisitie van de multi-wellplaat uit te voeren en een achtergrondcamera-afbeelding te verkrijgen, zoals zojuist gedemonstreerd. Hier wordt een representatieve FLIM-FRET-assay getoond met gebruik van het model-FRET-systeem tot expressie gebracht in cocellen en een multi-wellplaat, met voorbeelden van de automatisch verkregen fluorescentielevensduurbeelden van typische gezichtsvelden in elke well. In dit experiment vertoonden de negatieve controle-wells de langste levensduur, en de donorlevensduur was het laagst bij de FRET-constructen met de kortste linkerlengtes.

Over het algemeen varieerde de gemiddelde levensduur, berekend over alle gezichtsvelden in elke put, over de multi-well platen. Het middelen van het vervalprofiel van de donorfluorescentie-intensiteit over alle cellen die in put A1 zijn afgebeeld, samen met de fit aan een mono-exponentieel vervalmodel en de instrumentresponsfunctie, illustreert dat het fitmodel geldig is. Verdere analyse van de gemiddelde fluorescentielevensduur voor elke kolom van de multi-well plaat, verkregen uit een pixelgewijze mono-exponentiële fit, laat zien dat de levensduur afneemt bij de FRET-constructen met kortere linkerlengtes, wat een experiment met verschillende FRET-efficiënties simuleert.

In dit experiment werden de FLIM-gegevens van een FRET-assay over de werking van verschillende remmers op eiwitoligomerisatie gefit met een enkelvoudig exponentieel vervalmodel. De fluorescentie-levensduurplaatkaart illustreert de gemiddelde levensduur per well, gemiddeld over acht gezichtsvelden. Eén kleine set, waarbij vier gezichtsvelden per well werden afgebeeld, terwijl onze FLIM-assay in ongeveer twee en een halve uur kan worden voltooid, inclusief de tijd voor het verkrijgen van de instrumentresponsfunctie, de referentiekleurstofgegevens en het uitvoeren van de analyse in FLIM fit.

Bij het uitvoeren van een FLIM-assay is het belangrijk om te onthouden dat de instrumentresponsfunctie en de referentiekleurstofgegevens samen met hun achtergrondbeelden moeten worden verkregen, zodat u over alle informatie beschikt die nodig is om de FLIM-gegevens te analyseren. Met onze opensource software, FLIM fit, is het ook mogelijk om deze gegevens in complexere vervalmodellen te fitten. Dit maakt bijvoorbeeld de bepaling van de fractie van de FRET-populatie mogelijk.

Onze FLIM HCA-technologie helpt onderzoekers in de gemeenschap voor geneesmiddelenontwikkeling bij het maken van robuuste FRET-metingen. We hopen dat deze technologie in de toekomst het mogelijk zal maken om dissociatieconstanten te meten in celgebaseerde assays. We hopen dat dit videopaper en de informatie in onze Wiki andere onderzoekers zullen helpen bij het bouwen van hun eigen FLIM HCA-instrumentatie en het toepassen ervan op FRET en andere assays.

Vergeet niet dat werken met lasers gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen, zoals het afschermen van alle laserstralen, altijd moeten worden getroffen bij het gebruik van dergelijke instrumentatie.