Open Source High Content Analysis Door gebruik te maken van de automaten Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy
18 januari 2017
We presenteren een open source hoog gehalte analyse (HCA) instrument gebruik te maken van geautomatiseerde fluorescentie lifetime imaging (FLIM) voor het testen van eiwit interacties met behulp van Förster resonance energy transfer (FRET) op basis van uitlezingen. Data-acquisitie voor deze openFLIM-HCA instrument wordt bestuurd door software geschreven in μManager en data-analyse wordt uitgevoerd in FLIMfit.
Het algemene doel van deze procedure is om aan te tonen hoe tijdsgestuurde fluorescentie levensduur beeldvorming microscopie, of FLIM, kan worden geïmplementeerd in een geautomatiseerde multi-well platen werkstroom met behulp van opensource software en basisinstrumentatie. Deze methodologie kan worden toegepast op FLIM-gebaseerde uitlezingen in een reeks vaste of levende cellen. En het is bijzonder nuttig voor het uitlezen van celsignaalverwerking of eiwitinteracties.
De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat FLIM robuuste kwantitatieve uitlezingen biedt en interactiepopulatiefracties kan leveren in een enkele meting. Het toepassen van globale analysetechnieken op duizenden cellen over honderden beeldvelden, stelt ons in staat om foster resin energieoverdracht, of FRET uitlezingen te gebruiken. En het benutten van bijvoorbeeld levensduurveranderingen tot ongeveer 20 picoseconden.
Het demonstreren van de procedure met Frederik Gorlitz zal worden gedaan door Sunil Kumar, onze onderzoeksmedewerker en Ian Munro, onze softwareontwikkelaar. Begin met het starten van de micromanager en open de openFLIM-HCA plugin. Onder het FLIM-controletabblad, selecteer delay box calibratiebestand, en open de calibratiebestanden.
Selecteer het calibratiebestand voor de specifieke combinatie van de delay generator eenheid en laser herhalingsfrequentie van belang. Onder het bestandsmenu, selecteer basismap instellen en selecteer de map waar de gegevens worden opgeslagen. Na het bevestigen dat alle juiste parameters zijn ingesteld, stelt u handmatig een poortbreedte van vier nanoseconden in op de gated optische intensifier control box voor het hele experiment.
Om instrumentresponsfunctie beeldgegevens te verkrijgen, plaatst u handmatig een straalblok in de filtercassette voor het objectief om het ontsnappen van eventueel laserlicht te voorkomen en stelt u de straalblok in een hoek om eventuele reflectie terug in het microscoopframe te minimaliseren. Onder het lichtbaanbesturingstabblad, stelt u de excitatie-, dichroische en emissiefilters in de spindisk eenheid in, zodat de fractie van excitatielicht die wordt verstrooid vanaf de draaiende Nipkow schijf kan worden afgebeeld zonder het systeem te verzadigen gedurende minimaal 200 milliseconden camera integratietijd. Onder het FLIM-controletabblad, gebruik de functie zoek max punt over het volledige bereik van de vertragingen die worden gedekt door de programmeerbare snelle vertragingsbox.
Controleer vervolgens de weergegeven uitvoertrace. En stel de grove vertragingstijden in, zodat de volledige instrumentresponsfunctie profiel binnen het scanbereik van de snelle vertragingsbox valt. Pas de neutrale dichtheid en belichtingstijd parameters aan.
Evenals de frame accumulatie, zodat de camera niet verzadigd is in de helderheidstijdpoort en de effectieve integratietijd niet minder is dan 200 milliseconden. Selecteer onder het FLIM-controlemenu de snelle vertragingsbox en stel 25 picoseconden vertragingsstappen in over het volledige vertragingsbereik. Selecteer vervolgens vertragingen vullen en klik op FLIM-afbeelding maken om een instrumentresponsfunctie afbeelding te verkrijgen.
En wacht tot de acquisitie is voltooid. Selecteer onder het lichtbaanbesturingsmenu neutrale dichtheid en klik op geblokkeerd om de laser te blokkeren. Open het FLIM-besturingsmenu en selecteer snelle vertragingsbox om het aantal vertragingsstappen te verminderen door de waarde in het incrementvakje te verhogen.
Klik vervolgens op FLIM-afbeelding maken om een achtergrondcamera afbeelding te verkrijgen. Om referentie die gegevens te verkrijgen, gaat u naar het XYZ-besturingstabblad en voert u de H4 well in in het dialoogvenster Ga naar well. Ga vervolgens naar het lichtbaanbesturingstabblad en selecteer de juiste excitatie-, dichroische en emissiefilters voor het afbeelden van de M turquoise fluorescente proteïne met behulp van de functie zoek max punt over het volledige bereik van de snelle vertragingsbox.
Stel vervolgens de juiste parameters in voor het verkrijgen van de referentie die gegevens en een overeenkomstig achtergrondbeeld zoals zojuist is gedemonstreerd. Om de FLIM gegevens van een multi-well plate monster te verkrijgen, gaat u naar het instellingen HCA gesequenste acquisitiemenu. Selecteer het XYZ-positiestabblad en stel welke wells moeten worden afgebeeld en het aantal beeldvelden dat per well moet worden verkregen.
Selecteer een representatief beeldveld met het monster dat moet worden afgebeeld en stel de optimale neutrale dichtheidsfilter in de integratietijd van de camera in om 75% van de dynamische bereik van de uitleescamera te bereiken. Selecteer onder het XYZ-besturingstabblad de terugkeer focus control in het autofocus dialoogvenster en focus de microscoop handmatig op de cellen of structuren van belang. Stel de autofocus zoekbereik in op 2000 micrometer en druk op enter.
Klik vervolgens op AF nu om de autofocus procedure te starten. Er verschijnt een offset waarde op het autofocus veld focus offset. Voer deze offset waarde in het AF offset venster in, en klik tweemaal op AF nu om de autofocus procedure te herhalen.
Offset waarden moeten nu op nul zijn ingesteld, wat duidt op een correct functioneren van het autofocus systeem. Selecteer vervolgens onder het FLIM-besturingstabblad de autogating functie om een logaritmische sampling van de vertragingspunten te garanderen. Stel de accumulatie frames in op een waarde die de gewenste totale gegevensverwervingstijd oplevert.
Klik vervolgens in het FLIM-acquisitie dialoogvenster op de start HCA-sequentie knop om de FLIM multi-well plate acquisitie te starten en een achtergrondcamera afbeelding te verkrijgen zoals zojuist is gedemonstreerd. Hier wordt een representatief FLIM fret-assay getoond met behulp van het modelfret systeem dat wordt uitgedrukt in cocellen en een multi-well plate, met voorbeelden van de automatisch verkregen fluorescentie levensduur beelden van typische beeldvelden die in elk wel zichtbaar zijn. In dit experiment vertoonden de negatieve controle wells de langste levensduur, en de donor levensduur vertoonde de laagste fret constructies met de kortste linkerlengtes.
Over het algemeen varieerde de gemiddelde levensduur gemiddeld over alle beeldvelden in elk wel over de multi-well platen. Het gemiddelde donorfluorescentie-intensiteitsvervalprofiel over alle cellen die in well A1 zijn afgebeeld samen met de pasvorm op een mono-exponentieel vervalmodel en de instrumentresponsfunctie, illustreert
Overzicht
Dit artikel presenteert een open-source high content analysis (HCA) instrument dat geautomatiseerde fluorescentie lifetime imaging (FLIM) gebruikt voor het meten van eiwitinteracties via Förster resonantie energie transfer (FRET) gebaseerde uitlezingen. De methodologie is toepasbaar op zowel gefixeerde als levende cellen, en biedt robuuste kwantitatieve gegevens over celsignaalverwerking en eiwitinteracties.
Belangrijke Studie Componenten
Wetenschapsgebied
- Fluorescentie lifetime imaging microscopy (FLIM)
- Eiwitinteracties
- High content analysis (HCA)
Achtergrond
- FLIM maakt kwantitatieve uitlezingen van eiwitinteracties mogelijk.
- FRET uitlezingen maken de analyse van interactie populatiefracties mogelijk.
- De techniek kan levenstijdveranderingen meten tot op 20 picoseconden.
- Geautomatiseerde workflows verbeteren de efficiëntie van gegevensverzameling.
Doel van de Studie
- Om de implementatie van FLIM in een geautomatiseerde multi-well plate workflow te demonstreren.
- Om een gedetailleerde procedure voor het verkrijgen van FLIM gegevens te verstrekken.
- Om de voordelen van het gebruik van open-source software voor gegevensverzameling en analyse te laten zien.
Gebruikte Methoden
- Gebruik van µManager software voor instrumentcontrole.
- Gegevensanalyse uitgevoerd met FLIMfit.
- Calibratie van delay box en instelling van optische parameters.
- Verkrijging van fluorescentie levenstijd beelden van multi-well plates.
Belangrijkste Resultaten
- Succesvolle verkrijging van FLIM gegevens uit verschillende wells werd aangetoond.
- Negatieve controle wells vertoonden de langste levenstijden.
- Gemiddelde levenstijden varieerden over multi-well plates, wat duidt op verschillen in FRET constructies.
- Validatie van fitting modellen door middel van mono-exponentieel verval analyse.
Conclusies
- Het openFLIM-HCA instrument meet effectief eiwitinteracties.
- Geautomatiseerde workflows verhogen de gegevensverzameling capaciteiten aanzienlijk.
- FLIM biedt waardevolle inzichten in cellulaire processen en interacties.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
Automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) in multiwell plate format enables robust, quantitative readouts of protein interactions via FRET, supporting target validation and mechanistic de-risking in early drug discovery. The open-source workflow reduces barriers to adoption, allowing R&D teams to generate reproducible interaction data across compound libraries or genetic perturbations. This positions the method as a scalable, cost-effective tool for lead identification and portfolio triage in mechanistic screening campaigns.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying FRET-based protein interaction dynamics in live or fixed cells.
- Operational Value: Supports biological de-risking through population fraction analysis of interaction states from single-exponential decay fitting.
- Predictive Value: Provides lifetime changes down to 20 picoseconds, allowing detection of subtle interaction shifts critical for lead optimization.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by establishing baseline FRET efficiency in multiwell plate format.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible quantitative outputs via automated acquisition of thousands of cells across hundreds of fields of view.
- Scalability: Facilitates platform reuse for screening oligomerization, heterodimerization, or intramolecular biosensor readouts in drug discovery campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease relevance through live-cell FRET biosensor time courses, enabling dynamic pathway monitoring.
- Translational Continuity: Bridges discovery to preclinical validation by providing consistent, quantitative interaction metrics across model systems.
- Risk-Adjusted Decisions: Supports go/no-go criteria via FLIM-derived interaction population fractions and lifetime shifts.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification, enabling quantitative assessment of protein interactions prior to preclinical commitment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification via FRET readouts of protein oligomerization or biosensor activation.
- Screening: Delivers assay readiness and reproducibility through automated multiwell plate acquisition and global analysis of FLIM data.
- Analytics: Generates quantitative lifetime measurements and population fractions using FLIMfit for condition comparison and hit selection.
- Translational Research: Connects to preclinical work through live-cell FRET biosensor dynamics, preserving mechanistic context.
- Enterprise Reuse: Positions the open-source FLIM-HCA platform as a reusable capability for repeated screening cycles across targets and modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target engagement, reduction of mechanistic ambiguity in protein interaction assays.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of FRET-based readouts across multiwell plate formats.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk through early interaction validation.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantitative interaction thresholds.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy, FLIM principles, and open-source software (µManager, FLIMfit).
- Needs instrumentation including laser source, delay generator, gated optical intensifier, and spinning disk confocal unit.
- Demands cross-team standardization for calibration, acquisition parameters, and analysis pipelines.
- Involves adaptation considerations for different fluorescent protein pairs, linker lengths, and cellular expression systems.
- Includes practical limitations such as laser safety protocols and the need for background and reference data acquisition.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:03
Open Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM)–High Content Analysis (HCA) Plugin Setup
1:51
Instrument Response Function (IRF) Image and Reference Dye Data Acquisition
4:32
Multiwell Plate Sample FLIM Data Acquisition
6:29
Results: Representative FLIM Analyses in Cos and HeLa Cells
8:05
Conclusion
