Een High-throughput Cell Microarray Platform voor Correlatieve Analyse van de Cel Differentiatie en trekkrachten
March 1st, 2017
Celdifferentiatie wordt gereguleerd door een groot aantal micro-omgeving factoren, met inbegrip van zowel matrix samenstelling en de ondergrond eigenschappen. We beschrijven hier een techniek gebruikmaking cel microarrays in samenhang met trekkracht microscopie zowel celdifferentiatie en biomechanische cel- substraatinteracties als functie van de micro-omgeving context evalueren.
Het algemene doel van dit cel-microarrayplatform is om metingen van zowel celdifferentiatie als tractiekrachten te correleren als functie van micro-omgevingscontext. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen op het gebied van weefselengineering en maakt zowel fundamenteel onderzoek naar stamcelbiologie als optimalisatie van differentiatieprotocollen mogelijk. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn de doorvoer, de mogelijkheid om biochemische en biofysische signalen te variëren en eindmetingen door zowel immunofluorescentie als tractiekrachtmicroscopie, of TFM.
Hoewel deze methode is gebruikt, kan diegene die de differentiatie van levervoorlopercellen begrijpt, deze gemakkelijk toepassen op andere arteriële celtypen en weefselcontexten. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien experimenteel succes afhankelijk is van de integratie van het arrayingprotocol met zowel hoogwaardige hydrogelsubstraten als tractiekrachtmicroscopie. Om fluorescente kralen bevattende polyacrylamide hydrogels op een silanised 35 mm glazen bodem petrischaal te fabriceren voor live evaluatie van cel-substraatinteracties met behulp van TFM, bereid eerst glazen substraten in oplossingen zoals beschreven in het tekstprotocol.
Plaats silanised 35 mm glazen bodem petrischalen in een glazen drooglade en pipet 20 microliters van 9-tot-1 pre-polymeerkralen naar foto-initiatoroplossing op het centrum van elke schaal. Bedek elke schaal voorzichtig met een 12 mm rond dekglas terwijl u de vorming van bubbels vermijdt. Om de fluorescente kralen over het oppervlak van de hydrogel te verdelen, draai de schalen om en laat ze 20 minuten op kamertemperatuur staan.
Laat de schalen nog steeds omgekeerd staan en stel ze bloot aan 365 nanometer UVA gedurende 10 minuten. Optimaliseer de polymerisatietijd indien nodig. Dompel vervolgens de hydrogels in 1 molair HEPES-buffer en laat ze overnacht in het donker op kamertemperatuur staan.
Verwijder de dekglazen voorzichtig met een scheermes, zorg ervoor dat u de gepolymeriseerde hydrogels niet beschadigt. Dehydrateer de hydrogels op 50 graden Celsius op een hotplate tot ze droog zijn. Hydrogels kunnen drie maanden op kamertemperatuur in het donker worden bewaard.
Bereid buffers voor om de biomoleculen en voor de bronplaat te printen zoals beschreven in het tekstprotocol. Na het laden van de schone pinnen zoals beschreven in het tekstprotocol, bereid de microarrayer voor en programmeer deze met de software van de fabrikant. Zet vervolgens de bevochtigingseenheid aan.
Stel het ingestelde punt in op 65% relatieve vochtigheid en wacht tot de reometer overeenkomt met het ingestelde punt. Plaats de bronplaat in de juiste adapter. Plaats vervolgens de gedehydrateerde hydrogelsubstraten in de juiste adapter.
Pas de parameters van het programma aan om nauwkeurig de lay-out van de bronplaat, het arrayontwerp en het gewenste formaat weer te geven. Start de arrayfabricage. Controleer niet minder dan eenmaal per uur of de vochtigheid niet onder 65% relatieve vochtigheid is gedaald en of de pinnen niet verstopt zijn.
Als de vochtigheid onverwacht is gedaald, pauzeer het arraying om de bevochtigingseenheid te vullen en de bijbehorende buizen van condensatie te ontdoen. Als de pinnen verstopt zijn, pauzeer het arraying om de pinnen schoon te maken of vervang ze anders door vooraf gereinigde pinnen. Nadat het programma voltooid is, plaatst u de gefabriceerde arrays in een diadoos of microplaat bedekt met aluminiumfolie.
Laat de arrays overnacht op kamertemperatuur bij 65% relatieve vochtigheid. Volgens onze ervaring zijn de meest voorkomende moeilijkheden gerelateerd aan arrayfabricage. We raden aan om de technische kwaliteit en robuustheid van gefabriceerde arrays te bevestigen met behulp van fluorescerend gelabelde moleculen, algemene eiwitkleuringen en immunofluorescentie.
De dag na de fabricage, dompelt u de array 35 mm petrischalen in 3 ml van 1% volume per volume penicilline-streptomycine in PVS. Blootstel de array-substraten gedurende 30 minuten aan UVC. Vervolgens vervangt u de penicilline-streptomycineoplossing door celkweekmedium.
Na het verzamelen en tellen van de cellen, zaait u de cellen op arrays met 3 ml per 35 mm petrischaal. Incubeer de arrayculturen bij 37 graden Celsius en 5%CO2 gedurende twee tot 24 uur, of tot de vorming van goed bevolkte cel-eilanden. De zaaidichtheid en tijd kunnen worden aangepast afhankelijk van cellen en specifieke toepassing.
Na het toestaan van de vorming van cel-eilanden, was de arrayculturen twee keer met 3 ml voorverwarmd celkweekmedium. Op dit punt kunnen de geschikte controles en behandelingen van belang worden toegevoegd aan het biologische systeem. Ververs het medium van de arrays om de één tot twee dagen om de concentratie van eventuele behandelingen te behouden.
Binnen één tot vijf dagen na het starten van de arrayculturen, voer live evaluatie uit van cel-substraatinteracties met behulp van TFM. Verplaats de 35 mm petrischalen met arrayculturen naar een geïncubeerde omgekeerde fluorescente microscoop met een robotisch stap voor TFM-metingen. Markeer in een schaal de posities en focusvlakken van individuele cel-eilanden met behulp van fasecontrastmicroscopie.
Schakel over naar verre rood fluorescente microscopie om de kralen te visualiseren. Keer dan terug naar elk van de posities die in de vorige stap zijn opgeslagen en corrigeer de z-coördinaat van het focusvlak, zodat alleen de eerste laag kralen onder het cel-eiland in focus is. Sla de nieuwe coördinaten op en ga verder met geautomatiseerde beeldvorming van alle cel-eilanden om de pre-dissociatie fasecontrast en verre rood fluorescente beelden vast te leggen.
Voeg vervolgens voorzichtig 150 microliter BSA/SDS-oplossing toe aan de schaal en wacht vijf minuten om volledige celdissociatie van het substraat mogelijk te maken. Controleer de celdissociatie met behulp van fasecontrastmicroscopie. Nadat de cel-eilanden van het substraat zijn gedissocieerd, keer terug naar de gemarkeerde posities en controleer of de eerste laag kralen nog steeds in focus is.
Als deze kralen uit het vlak zijn vanwege vervorming veroorzaakt door door cel gegenereerde tractiekracht, corrigeer dan de z-coördinaat van he
Overzicht
Deze studie presenteert een microarrayplatform voor cellen dat is ontworpen om celdifferentiatie en tractiekrachten in verschillende micro-omgevingscontexten te correleren. De methode verbetert het begrip van stamcelbiologie en toepassingen in weefselengineering.
Belangrijkste Studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Celbiologie
- Weefselengineering
- Biomechaniek
Achtergrond
- Celdifferentiatie wordt beïnvloed door micro-omgevingsfactoren.
- Tractiekrachtenmicroscopie (TFM) wordt gebruikt om cel-substraatinteracties te evalueren.
- High-throughputtechnieken zijn essentieel voor het bevorderen van stamcelonderzoek.
- Integratie van biochemische en biofysische signalen is cruciaal voor experimenteel succes.
Doel van Studie
- Om celdifferentiatie en biomechanische interacties te evalueren.
- Om differentiatieprotocollen voor verschillende celtypen te optimaliseren.
- Om een visuele demonstratie van de microarraytechniek te geven.
Gebruikte Methoden
- Fabricage van polyacrylamidehydrogels met fluorescente kralen.
- Microarray-printen van biomoleculen.
- Celcultuur en zaaien op gefabriceerde arrays.
- Live evaluatie van cel-substraatinteracties met behulp van TFM.
Belangrijkste Resultaten
- De methode maakt real-time monitoring van celgedrag mogelijk.
- Succesvolle differentiatie van levervoorlopercellen aangetoond.
- Hoge kwaliteit arrays kunnen worden gefabriceerd met consistente resultaten.
- TFM biedt inzichten in de mechanische eigenschappen van celinteracties.
Conclusies
- Het celmicroarrayplatform is een waardevol hulpmiddel voor stamcelonderzoek.
- Het maakt de studie van verschillende celtypen en hun differentiatie mogelijk.
- Toekomstige toepassingen kunnen zich uitstrekken naar andere weefselcontexten.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
This platform enables high-throughput correlation of biochemical and biophysical cues in stem cell differentiation, addressing a key challenge in tissue engineering and regenerative medicine. By integrating immunofluorescence and traction force microscopy, it provides quantitative, multiparametric readouts that enhance predictive confidence in early target validation and mechanistic de-risking. The system supports scalable screening of microenvironmental factors, informing go/no-go decisions in preclinical pipeline advancement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by correlating differentiation outcomes with subcellular traction forces under defined microenvironmental conditions.
- Operational Value: Supports functional target validation through high-throughput screening of ECM proteins and ligand combinations in a controlled, reproducible format.
- Predictive Value: Facilitates mechanistic de-risking by identifying how substrate stiffness and biochemical cues jointly influence cell fate decisions, reducing ambiguity in target mechanism.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, quantitative datasets on cell differentiation and traction forces, enabling reliable compound or ligand evaluation across arrayed conditions.
- Operational Value: Ensures assay reproducibility through standardized hydrogel fabrication, controlled humidity during printing, and validated bead-based TFM readouts.
- Scalability Value: Compatible with microarray printing workflows, allowing parallel testing of dozens of microenvironmental combinations per slide for efficient lead identification.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Demonstrates disease-relevant applicability in liver progenitor differentiation, with direct readouts of bile duct cell fate via immunofluorescence and biomechanical metrics.
- Preclinical Continuity: Bridges discovery-scale mechanistic insights with preclinical validation by providing multiparametric data on differentiation efficacy and mechanobiological responses.
- Risk-Adjusted Decision-Making: Enables prioritization of conditions that show sustained traction stress and differentiation on permissive matrices, supporting data-driven advancement.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification, particularly for targets where mechanotransduction influences efficacy or toxicity.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating the effects of arrayed biochemical and biophysical variables on cell differentiation and force generation.
- Screening: Delivers assay-ready, standardized outputs via immunofluorescence and TFM, enabling quantitative comparison of microenvironmental conditions.
- Analytics: Provides multiparametric readouts (fluorescence intensity, traction stress RMS) that allow teams to rank conditions by differentiation efficacy and mechanical phenotype.
- Translational Research: Connects to preclinical work through validated, disease-relevant cell models and measurable biomechanical endpoints predictive of tissue-level behavior.
- Enterprise Reuse: Fabricated hydrogel substrates are storable and reusable across projects, positioning the platform as a scalable, cross-disciplinary capability.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target mechanisms by reducing mechanistic ambiguity through correlated biochemical and biomechanical profiling.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization via controlled hydrogel fabrication, environmental monitoring during arraying, and validated dissociation/re-imaging workflows for TFM.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling rapid triage of microenvironmental conditions, reducing reliance on low-throughput, sequential validation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying conditions with concordant differentiation and biomechanical responses, informing advancement decisions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in hydrogel chemistry, microarray printing, and traction force microscopy setup and calibration.
- Dependent on access to UVA/UVC exposure systems, humidified arraying platforms, and inverted fluorescent microscopes with robotic stages.
- Necessitates cross-team standardization of array fabrication protocols, including humidity control, pin maintenance, and substrate storage conditions.
- Adaptation to alternative cell types may require optimization of seeding density, culture duration, and dissociation conditions.
- Practical limitations include the need for careful bubble avoidance during hydrogel polymerization and validation of array quality via fluorescent labeling prior to cell culture.
