Name: Een High-throughput Cell Microarray Platform voor Correlatieve Analyse van de Cel Differentiatie en trekkrachten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-01T11:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: Leer een high-throughput cel microarray methode voor het correleren van cel differentiatie en trekkrachten met behulp van fluorescerende polyacrylamide hydrogels. Deze techniek ondersteunt stamcelonderzoek en weefselengineering toepassingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij erkennen Austin Cyphersmith en Mayandi Sivaguru (Carl R. Woese Institute for Genomic Biologie, Universiteit van Illinois in Urbana-Champaign) voor hulp bij microscopie en voor royaal opvang scherm en video-opname op de microscopie kern.

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.

In onze experimenten hebben we gevonden dat de meest voorkomende fouten zijn gerelateerd aan de kwaliteit van de gefabriceerde arrays en slecht kenmerk reactie in het biologische systeem plaats. Wij verwijzen de lezer naar tabel 1 voor de gemeenschappelijke storingsmodi in cel microarray experimenten en bijbehorende stappen voor probleemoplossing. Ten aanzien van de kwaliteit van arrays in het bijzonder, raden wij u het volgende. Bevestigen de technische kwaliteit en de robuustheid van arraying&#39;s, parameters en buffers gebruikt fluorescerend gemerkte moleculen zoals rhodamine geconjugeerd dextran. Grondig reinigen pennen voor of na het rangschikken van de instructies van de fabrikant en verder visueel te controleren of de pin-kanalen zijn vrij van afval met behulp van een lichtmicroscoop. Bevestig gekleed biomolecuul retentie met behulp van algemeen eiwit vlekken of immunokleuring. Merk op dat biomoleculen met een molecuulgewicht lager dan 70 kDa vaak niet vastgehouden in de hydrogel 23, </<html> sup&gt; 31. Valideren gekleed biomolecuul cell-functionaliteit met behulp van meerdere celtypen. Merk op dat alleen hechtende cellen geschikt arrays; bovendien, hechting aan matrices afhankelijk van zowel cel-specifieke eigenschappen (bijvoorbeeld integrine expressieprofiel) en de geselecteerde ECM eiwitten. Vanwege de beperkte ruimte, hebben we niet voorzien van een uitgebreide behandeling van de array ontwerp, de indeling en fabricage hier en verwijzen de lezer naar de vorige werkt 23, 25. Wij gebruiken over het algemeen 100 spot subarrays (150 micrometer spot diameter van 450 micrometer hart-op-hart afstand), bestaande uit 10-20 unieke biomolecuul zijn uitgevoerd (5-10 vlekken / conditie). Het aantal subarrays in een matrix is ​​afhankelijk van het aantal biologische molecule voorwaarden plaats, die comfortabel tot 1280 worden geschaald op een 25 x 75 mm objectglaasje (~ 6400 spots in 64 subarrays)xref &quot;&gt; 25, 31 de parameters hierboven verder afhankelijk van de patroongrootte plaats;. pinnen kunnen genereren patronen 75-450 urn zijn beschikbaar. Array experimenten worden best aangevuld met validatie van hoog scorende gekleed omstandigheden van belang het gebruik van andere cultuur formats, assay uitlezingen, en biologische modelsystemen. In het bijzonder, raden we verder valideren effecten van geselecteerde gekleed omstandigheden met behulp van bulk culturen in combinatie met standaard moleculair biologische technieken (bijvoorbeeld qRT-PCR, immunoblotting) of standaard TFM. Genetische manipulatie (bijv knock-down of overexpressie) van de factor van belang in een geschikte biologische modelsysteem kan ook dienen om effecten waargenomen in arrays te bevestigen. In vivo diermodellen vertegenwoordigen een ander middel voor validatie en werden onlangs gebruikt, bijvoorbeeld, de centrale rol van galectine-3 en galectine-8 bevestigtde longkanker metastatische niche, zoals aanvankelijk geïdentificeerd via de mobiele microarray 31, 49. Een aantal andere methoden zijn gebruikt om micro-omgeving regulatie van cellulaire functies, waaronder een verscheidenheid aan tweedimensionale microvervaardigde systemen 18, 50, 51, 52, 53, 54, 55 en driedimensionale engineered biomateriaal systemen 56, 57, 58 probe , 59, 60, 61. In vergelijking met andere werkwijzen, de bijzondere voordelen van de cel microarrayplatform beschreven omvatten: (1) tot doorvoerhonderden of duizenden verschillende combinaties van factoren, waardoor analyse van de interactie-effecten; (2) toegankelijk, geautomatiseerde beeldvorming en analyse; (3) integratie van beide biochemische en biofysische uitlezingen met gecontroleerde presentatie van gekleed factoren; (4) het vermogen om substraat materiaaleigenschappen variëren; en (5) met hoge gehalte single-cell analyse van het lot van de cel en functie. Samengevat, de combinatie van cel microarrays met TFM op substraten afstembare substraat stijfheid maakt grondige karakterisatie van zowel biochemische en biofysische cues. Zoals hier gepresenteerde dit platform generaliseerbaar en kan gemakkelijk worden toegepast op een verscheidenheid van hechtende celtypen en weefsels context naar een beter begrip van combinatorische micro-omgeving regulering van celdifferentiatie en mechanotransductie.

Interacties tussen cellen en micro-omgeving rondom factoren mediëren een grote verscheidenheid van biologische processen in ontwikkeling, homeostase en ziekte pathogenese 1, 2, 3, 4. Deze micro-omgeving interacties omvatten afgifte van oplosbare factoren aan cellen, cel-matrix binding en cel-cel interacties via ligand-receptorbinding. Naast bovengenoemde biochemische overwegingen biofysische parameters, zoals substraat mechanische eigenschappen (bijvoorbeeld modulus, porositeit) en celvorm en bijbehorende downstream mechanotransductie steeds erkenning gekregen als belangrijke mediatoren van celdifferentiatie 5, 6, 7, 8, 9 <sup&gt;, 10. Signalen als gevolg van deze micro-omgeving interacties dienen als input voor gen-netwerken en signaalwegen. Bovendien zijn deze cel-intrinsieke componenten ook feedback aan de micro-omgeving door factoren en matrix-afbrekende enzymen, het invullen van een complex mederegulerende loop tussen cel-intrinsieke genetische programma en cel-extrinsieke factoren micromilieu 5, 11, 12. Het gebruik van technische systemen voor gecontroleerde weergave van micro-omgeving factoren is nuttig gebleken in een aantal verschillende contexten 13, 14, 15. Microfabricated systemen hebben vooral nauwkeurige ruimtelijke patronen van eiwitten en cellen evenals zeer parallel verlopende analyse vergemakkelijkt via miniaturisatie 13, <supclass = &quot;xref&quot;&gt; 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22. Cel microarrays vertegenwoordigen zo&#39;n microfabricated systeem waarin combinaties van biomoleculen contact gedrukt op een elastische polyacrylamide hydrogel substraat 23, 24, 25. De opname van cel-hechtende componenten (namelijk matrixeiwitten) maakt aanhoudende celadhesie en cultuur microarrays, die vaak gevolgd wordt door stroomafwaartse analyses via immunocytochemie en fluorescerende reporters. Cel microarrays zijn productief gericht op het bereiken van een beter begrip van de levercel fenotype 23, 26, neurale voorloper differentiatie 27, Mammary progenitor lot besluiten 28, embryonale stamcel onderhoud / differentiatie 23, 29, 30, 31 longkanker metastase en therapeutische respons in 32 melanoom. We hebben onlangs aangetoond dat het gebruik van mobiele microarrays voor de rol van extracellulaire matrix (ECM) eiwitsamenstelling in endoderm specificatie 33, leverprogenitor- differentiatie 34, 35 en longtumorcellijnen geneesmiddelrespons 36. In deze werken, hebben we ons gericht op de uitbreiding van de combinatorische mogelijkheden van de array-platform en het verkennen van de snijpunten van de cel-intrinsieke signalering met extracellulaire matrix compositie en biomechanica. Daarnaast hebben we biofysische uitlezingen uitgevoerd in deze array platform de mogelijkheid bieden om kwantitatief karakterize de rol van de cel contractiliteit in differentiatie verwerkt 35. Om dit te doen, geïntegreerd we trekkracht microscopie (TFM) met een mobiele microarrays om high-throughput evaluatie van de cel gegenereerd tractie mogelijk te maken. TFM is een algemeen gebruikte methode om cellen gegenereerde aandrijfkrachten meten en heeft belangrijke inzichten over de coördinatie van eencellige en weefsel functie op de samenstelling en biomechanica van de lokale micro-omgeving 37, 38, 39, 40 voorzien. Zo, een combinatie van TFM met mobiele microarrays zorgt voor een high-throughput-systeem voor het meten van de belangrijkste, fysiologisch relevante biofysische parameters. De cel microarrayplatform hier beschreven bestaat uit vier delen: vervaardiging van polyacrylamide substraten fabricage van arrays, celkweek en assay uitlezen en analyseren van gegevens. ZienFiguur 1 een schematische samenvatting van de eerste drie experimentele punten; zie figuur 2 voor een schematisch overzicht van het laatste deel met een focus op de analyse van immunofluorescentie gegevens. Om de cel microarrayplatform studies van biomechanische cel- substraatinteracties passen, gebruikten we polyacrylamide substraten afstembare Young&#39;s modulus maar vergelijkbaar porositeit, per Wen et al. 41. Om TFM metingen van krachten uitgeoefend door cellen op hun substraat mogelijk voerden we een glazen bodem petrischaal format naast de dikke objectglaasjes vaak gebruikt door andere groepen. Zo, deze cel microarray platform is in staat om parallelle metingen van celdifferentiatie via immunofluorescentie op microscoopglaasjes en cel gegenereerde krachten via TFM op aparte glazen bodem gerechten. We hebben ook verschillende verbeteringen aangebracht op de analytische courante methode met een mobiele microarrays. specifically, in plaats van parametrische Z-scoring van de totale eiland intensiteit, meten we eencellige intensiteit en toe te passen kwantiel normalisatie om rekening te houden met niet-normale verdelingen en meer nauwkeurig te beschrijven cellulaire gedrag. Wij geloven dat deze verbeteringen te verstrekken bijzonder nut in de richting van onderzoek naar biologische processen waarin zowel biochemische en biofysische signalen spelen significant, snijdende rollen. Verder onze analytische verbeteringen maken de toepassing van cel microarrays studies van diverse cellulaire functies waarvoor eencellige en populatie niveau gedrag verschillen.

```html
<table><tbody><tr><td>0,2 &micro;m spuitfilter</td><td>Pall Corporation</td><td>4433</td><td>Match with appropriately-sized Luer lock plastic syringes.</td></tr><tr><td>100 × penicillin&ndash;streptomycinoplossing</td><td>Fisher Scientific</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>22 × 60 mm dekglazen</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>63765</td><td></td></tr><tr><td>3-(trimethoxysilyl)propylmethacrylaat (3-TPM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440159</td><td>Bewaar onder inert gas volgens de instructies van de fabrikant. Blootstelling van 3-TPM aan lucht kan de silanisering van glazen substraten compromitteren. LET OP: 3-TPM is een ontvlambare vloeistof. Uit de buurt van hitte, vonken, open vuur en hete oppervlakken houden en alleen in een chemische afzuigkap gebruiken.</td></tr><tr><td>3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propaansulfonaathydraat (CHAPS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3023</td><td></td></tr><tr><td>35 mm glazen bodem Petri-schaal</td><td>Cell E&amp;G</td><td>GBD00002-200</td><td>13 mm putje bestaande uit #1,5 dekglaasje. Maakt TFM en live-cell beeldvorming mogelijk.</td></tr><tr><td>384-wel polypropylene V-bodem microplaat, niet-sterieel</td><td>USA Scientific</td><td>1823-8400</td><td></td></tr><tr><td>6-wel polystyreen microplaat</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1B</td><td>35 mm glazen bodem Petri-schalen passen in de putjes van de microplaat, waardoor de array fabricage gemakkelijker wordt.</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179973</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3553</td><td>LET OP: Blootstelling aan acrylamid kan leiden tot acute toxiciteit en irritatie. Draag beschermende handschoenen, kleding en oogbescherming.</td></tr><tr><td>Collageen I, rattenstaart</td><td>EMD Millipore</td><td>08-115MI</td><td></td></tr><tr><td>Collageen III, humaan</td><td>EMD Millipore</td><td>CC054</td><td></td></tr><tr><td>Collageen IV, humaan</td><td>EMD Millipore</td><td>CC076</td><td></td></tr><tr><td>Crosslinker, 365 nm</td><td>UVP</td><td>CL-1000</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, geconjugeerd met rodamine B, 70 kDa</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D1841</td><td>Gebaat als marker voor arraylocatie.</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP231</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS)</td><td>Fisher Scientific (HyClone)</td><td>SH3001302</td><td></td></tr><tr><td>Ethylalcohol</td><td>Decon Labs</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ED</td><td></td></tr><tr><td>Fc-recombinant DLL1, muis</td><td>R&amp;D Systems</td><td>5026-DL-050</td><td></td></tr><tr><td>Fc-recombinant DLL4, muis</td><td>AdipoGen</td><td>AG-40A-0145-C050</td><td></td></tr><tr><td>Fc-recombinant JAG1, rat</td><td>R&amp;D Systems</td><td>599-JG-100</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectine, humaan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2006</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescente microscoop, omgekeerd</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 200M</td><td>Zorg ervoor dat de microscoop is uitgerust met een robotische stage voor zowel geautomatiseerde fluorescente beeldvorming als TFM. Milieucontrole (d.w.z., 37 °C en 5% CO2) is zeer aan te raden voor TFM.</td></tr><tr><td>Fluoromount G met DAPI</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-20</td><td></td></tr><tr><td>Glaziale azijnzuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>695092</td><td>LET OP: Azijnzuur is ontvlambaar en corrosief. Draag beschermende handschoenen, kleding en oogbescherming.</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6145</td><td></td></tr><tr><td>Irgacure 2959</td><td>BASF Corporation</td><td>55047962</td><td></td></tr><tr><td>Laminine, muis</td><td>EMD Millipore</td><td>CC095</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179957</td><td></td></tr><tr><td>Microarrayscanner</td><td>GenePix</td><td>4000B</td><td>Fluoroforen moeten Cy3- of Cy5-compatibel zijn.</td></tr><tr><td>Microarrayer</td><td>Digilab</td><td>OmniGrid Micro</td><td>Andere microarrayers met vergelijkbare of grotere capaciteit kunnen gemakkelijk worden vervangen.</td></tr><tr><td>Microscoopglaasjes, 25 × 75 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS294775X25</td><td>~0,9 &ndash; 1,1 mm dikte.</td></tr><tr><td>N,N'-Methyleenbisacrylamide (bisacrylamide)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7279</td><td>LET OP: Blootstelling aan acrylamid kan leiden tot acute toxiciteit en irritatie. Draag beschermende handschoenen, kleding en oogbescherming.</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA), 16% v/v</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>RT15710</td><td>Bereid PFA vers (niet bewaren) voor optimale fixatie. LET OP: Blootstelling aan PFA kan leiden tot acute toxiciteit en kan ook irritatie of corrosie van de huid bij contact veroorzaken. Draag beschermende handschoenen, kleding en oogbescherming en gebruik alleen in een chemische afzuigkap.</td></tr><tr><td>Proteïne A/G, recombinant</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21186</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex droogbak, 2.000 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-242B</td><td></td></tr><tr><td>Rechthoekige 4-kamerige kweekschaal</td><td>Fisher Scientific (Nunc)</td><td>12-565-495</td><td>Voor celkweek op gearrayde microscoopglaasjes.</td></tr><tr><td>Natriumacetaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>415413</td><td>LET OP: NaOH is zeer corrosief en kan ernstige huidverbrandingen en oogbeschadiging veroorzaken. Draag beschermende handschoenen, kleding en oogbescherming.</td></tr><tr><td>Stealth-pin voor arraying</td><td>ArrayIt</td><td>SMP3</td><td>Reinig de pinnen na elke arrayrun volgens de instructies van de fabrikant. Produceert domeinen van 150 micron; koop andere penmaten (75&ndash;450 microns) naargelang uw specifieke toepassing.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr></tbody></table>
```

een high-throughput cell microarray platform voor correlatieve analyse van de cel differentiatie en trekkrachten

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

Microfabricated cellulaire microarrays, die bestaan ​​uit contact gedrukt combinaties van biomoleculen op een elastisch hydrogel oppervlak te strak, high-throughput systeem ontworpen om het effect van array biochemische signalen op celdifferentiatie. Recente inspanningen met behulp van mobiele microarrays hebben hun nut voor combinatorische studies waarin veel micro-omgeving factoren worden gepresenteerd in parallel aangetoond. Echter, deze pogingen voornamelijk gericht op het onderzoeken van de effecten van biochemische signalen op cel reacties. Hier presenteren we een cel microarray platform met instelbare materiaaleigenschappen gaan zowel celdifferentiatie door immunofluorescentie en biomechanische cel substraatinteracties door trekkracht microscopie. Hiervoor hebben we twee verschillende formaten gebruikmaking polyacrylamide hydrogels variërende elasticiteitsmodulus vervaardigd aan beide microscoopglaasjes of glazen bodem petrischalen ontwikkeld. Wij bieden best praktijken en het oplossen van problemen voor de fabricage van microarrays op deze hydrogel substraten, de daaropvolgende celcultuur op microarrays, en de overname van gegevens. Dit platform is zeer geschikt voor toepassing bij onderzoek naar biologische processen die zowel biochemische (bijvoorbeeld extracellulaire matrix compositie) en biofysische (bijvoorbeeld substraat stijfheid) signalen kunnen aanzienlijke spelen, snijdende rollen.

Gebruik dit platform, hebben we de rol van zowel de biochemische en biofysische signalen in het lot specificatie van Leverprogenitoren 34, 35. Proteïne A / G-geconjugeerd Notch ligands liet verbeterd tegenhouden en clustering in de polyacrylamide hydrogel (figuur 3A) en zijn bovendien het aansturen van differentiatie van Leverprogenitoren naar een galgang lot van de cel (figuur 3B). Gebruik eencellige analyse hebben we gekwantificeerd de reactie op de Notch liganden voor de ECM eiwitten collageen I, collageen III, collageen IV, fibronectine en laminine (figuur 3C), vastgesteld dat de reactie van Leverprogenitoren het ligand hangt ook af van de ECM context. Last, benut we shRNA knock-down te Leverprogenitoren genereren zonder dat de liganden Dll1 en Jag1. De respons op de array Notch ligand varieerde afhankelijk van de presence van ofwel ligand bevestigt de respons van de cel-extrinsieke ligand is ook een functie van de cel-intrinsieke ligand expressie (Figuur 3D). Verder zagen we een duidelijke subpopulatie van dubbel-positieve (ALB + / OPN +) cellen in de Dll1 knock-down (Figuur 3D). Samen vormen deze representatieve resultaten tonen: (1) de combinatoriële mogelijkheden van de array format, zoals blijkt uit de koppeling van meerdere ECM-eiwitten opgesteld en Notch ligands de knockdown van afzonderlijke liganden; (2) de functie van niet alleen bekleed ECM eiwitten ook gerangschikt cel- ligand via proteïne A / G-gemedieerde conjugatie; en (3) de uitvoering van onze single-cell analyse en de mogelijkheid om unieke subpopulaties onderscheiden. We hebben ook waargenomen dat de differentiatie van progenitors lever is afhankelijk van zowel het substraat stijfheid en de ECM samenstelling (figuur 4A </str<html> ong&gt;), in het bijzonder het vinden van dat collageen IV is voorstander van differentiatie op zowel zacht en stijve substraten terwijl fibronectine alleen ondersteuning voor differentiatie op harde ondergronden (Figuur 4B). Representatieve warmtekaarten van TFM metingen voorgesteld aanhoudende trek wordt belast bij lage substraat stijfheid op collageen IV bevorderde differentiatie in bile duct cellen (Figuur 4C), een bevinding bevestigd gemiddelde wortel van het gemiddelde kwadraat waarden (Figuur 4D). Samen vormen deze representatieve resultaten tonen: (1) de succesvolle integratie van TFM met mobiele microarrays op substraten met een instelbare stijfheid zowel de cel fenotype en trek wordt belast, te beoordelen; (2) de coördinatie van de lever voorlopercellen lot van de cel met zowel de matrix samenstelling en het substraat stijfheid; en (3) de implementatie van onze TFM analyse en typische tractie stress-profielen in cel microarrays. e 1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 55362 / 55362fig1.jpg &quot;/&gt; Figuur 1: Overzicht schematische weergave van de eerste drie Experimental secties. In paragraaf 1, worden glassubstraten schoongemaakt en gesilaniseerd om de fabricage van polyacrylamide hydrogels te vergemakkelijken. In hoofdstuk 2, worden de biomolecuul combinaties van belang bereid in een 384-wells microplaat bron. Een array-robot wordt dan geladen met schone pennen, de bron microplaat en de polyacrylamide hydrogels en geïnitialiseerd, vervaardigen arrays op de hydrogelen. In paragraaf 3 worden cellen gezaaid op de gekleed domeinen en liet zich te houden, waarna de cultuur protocol van belang is uitgevoerd. Op het eindpunt worden de cellen ofwel gefixeerd voor immunocytochemie / of immunofluorescentie geanalyseerd met TFM. Schaal bars zijn 75 urn. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55362/55362fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> binnen-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/55362/55362fig2.jpg" /> Figuur 2: Verwerking en analyse van immunofluorescentie gegevens van arrays. (A) Tegels, samengestelde 32-bits RGB-afbeeldingen worden eerst weggegooid en vervolgens te splitsen in afzonderlijke 8-bit kanalen. Een combinatie van fluorescente markers bekleed en mobiele eilanden worden drie hoeken van de array gemerkt zijn dat voor automatische oriëntatie en netten in de arrays. (B) Eencellige data wordt gegenereerd voor elk kanaal van de input arrays. Om rekening te houden experimentele drift, wordt quantile normalisatie toegepast door biologische repliceren, waardoor een enkele gedeelde verdeling over alle replicaten. Kwantiel genormaliseerde data wordt vervolgens uitgezet en geïnterpreteerd via de berekening van ensemble metingen (bijvoorbeeld cellen / eiland, gemiddelde intensiteit, het percentage cellen positief voor een label) of een directe analyse van single-cell distributies.m / files / ftp_upload / 55362 / 55362fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken. <img alt="figuur 3" src="/files/ftp_upload/55362/55362fig3.jpg" /> Figuur 3: Notch Ligand Presentatie Bemiddelt Lever Progenitor Differentiatie. (A) Fc-recombinant Notch liganden Jagged-1 (JAG1) en Delta-like 1 (DLL1) tentoongesteld verbeterde retentie en clustering wanneer bekleed met proteïne A / G. Schaal bar is 50 micrometer. (B) Leverprogenitoren gedifferentieerd in galweg cellen na presentatie met Notch ligand. 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) is een nucleaire label, albumine (ALB) is een lever cel marker, en osteopontine (OPN) is een galwegen cel marker. Schaal bar is 150 pm. (C) Kwantificering van het percentage cellen positief voor OPN voor de Notch liganden JAG1, DLL1, en Delta-achtige 4 (DLL4) op de ECM eiwitten collageen I, collagen III, collageen IV, fibronectine en laminine. Student&#39;s t -testen werden uitgevoerd tegen controle IgG voor elk getooid Notch ligand binnen elke ECM-eiwit met P-waarden geïndiceerd voor P &lt;0,05 (*). (D) Imaging cytometrie van ALB en OPN voor cellen op collageen III aangeboden met de Notch liganden JAG1, DLL1 en DLL4. Leverprogenitoren zonder Notch liganden Dll1 en Jag1 (dwz shDll1 en shJag1) werden gegenereerd met behulp van shRNA knock-down. Gegevens in (C) gepresenteerd als gemiddelde ± SEM Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van Kaylan et al. 34. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55362/55362fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 4" src="/files/ftp_upload/55362/55362fig4.jpg" /> Figuur 4: Matrix Samenstelling en Substrate stijfheid Coordinate Lever Progenitor Differentiatie. (A) Lever voorlopercellen differentiatie ductale cellen gal afhankelijk van zowel ECM samenstelling en substraat stijfheid. DAPI is een nucleaire label, ALB is een lever cel marker, en OPN is een galweg cel marker. (B) Kwantificering van percentage cellen positief voor OPN op substraten van Young&#39;s modulus 30 kPa, 13 kPa, en 4 kPa voor collageen I (C1), collageen IV (C4), fibronectine (FN) en alle wederzijdse combinaties de ECM eiwitten. (C) Cell trek wordt belast, afhankelijk van zowel substraat stijfheid en ECM samenstelling. (D) Kwantificering root-mean-square waarden trek wordt belast op substraten van Young&#39;s modulus 30 kPa en 4 kPa voor collageen I (C1), collageen IV (C4), fibronectine (FN) en alle wederzijdse combinaties van deze ECM eiwitten. In (B) en (D), werden gegevens weergegeven als gemiddelde ± SEM en Student&#39;s t -testenwerden uitgevoerd op 30 kPa per ECM combinatie met P-waarden dienen P &lt;0,05 (*), P &lt;0,01 (**) en P &lt;0,001 (***). Schaal bars zijn 50 urn. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van Kourouklis et al. 35. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55362/55362fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td fo:width="1.2in"> Sectie </td><td fo:width="1.5in"> Probleem </td><td fo:width="1.5in"> mogelijke oorzaken </td><td> Oplossing </td></tr><tr><td rowspan="3"> 1. Fabricage van Polyacrylamide substraat. </td><td> Dekglaasje kan niet van hydrogel verwijderd. </td><td> Overpolymerization. </td><td> Verminder polymerisatietijd tot &lt;10 minuten (4 W / m 2). Controleer of UV crosslinker output is binnen de verwachte range. </td></tr><tr><td> Slechte polyacrylamide hydrogel polymerisatie. </td><td> Underpolymerization. </td><td> Polymerisatietijd verhogen tot&gt; 10 minuten (4 W / m 2). Controleer of de UV-crosslinker output is binnen de verwachte range. </td></tr><tr><td> Polyacrylamide hydrogels beschadigd na verwijdering van dekglaasje. </td><td> Zachte polyacrylamide hydrogels zijn gemakkelijk te beschadigen. </td><td> We zien afnemende hydrogel fabricage opbrengst (~ 50%) van de zachtste (dwz 4 kPa) hydrogels in het bijzonder. Handvat hydrogels zacht en verhogen startnummers om gewenste opbrengst te bereiken. </td></tr><tr><td rowspan="2"> 2. Vervaardiging van arrays. </td><td rowspan="2"> Slechte of inconsistente spot morfologie. </td><td> Inconsistent luchtbevochtiger functie. </td><td> Controleer of de luchtbevochtiger en Rheometer een functioneel gedurende de hele oplage en onderhouden van 65% RV. </td></tr><tr><td> Pins vast te zitten in de printkop of klompged. </td><td> Reinig de printkop mogelijk te maken voor vrije pin beweging. Clean pennen grondig voor of na elke oplage aggregaten van pin-kanalen te verwijderen. </td></tr><tr><td rowspan="8"> 3. Cel Cultuur en Assay Execution. </td><td rowspan="2"> Cell onthechting of overlijden op arrays na de eerste bijlage. </td><td> Bovenuitzaai en overmatige proliferatie. </td><td> Verminder initiële zaaidichtheid en tijd. Gebruik &quot;onderhoud&quot; of &quot;differentiatie&quot; media tijdens scala cultuur tot celproliferatie te verminderen. </td></tr><tr><td> Vorming van giftige acrylamide monomeer uit hydrogel. </td><td> Genieten hydrogels in dH 2 O tenminste 3 d om diffusie / vrijgave van acrylamide monomeer en verminderen celtoxiciteit. </td></tr><tr><td rowspan="4"> Cellen niet hechten aan arrays. </td><td> Underseeding. </td><td> Verhoging van de initiële zaaidichtheid en tijd. Gebruik een sterker hechtende celtype. </td></tr><tr><td> Slechte afzetting vanmatrix of biomolecuul conditie. </td><td> Clean pinnen van deeltjes en aggregaten, bevestigen afdrukken parameters, en het spotten van fluorescente markers, bijvoorbeeld rhodamine-geconjugeerde dextran te evalueren. </td></tr><tr><td> Specificiteit van cel-matrix interacties. </td><td> Verschillende celtypen zich specifiek op sommige, maar niet andere ECM eiwitten. Test meerdere verschillende ECM eiwitten met je cellen. </td></tr><tr><td> Suboptimale scala opslag na fabricage. </td><td> We raden het opslaan van gefabriceerde arrays &#39;s nachts bij 65% relatieve vochtigheid en kamertemperatuur, voor een deel aan fase veranderingen tijdens bevriezing te voorkomen. Celhechting gevoelig voor zowel vocht, temperatuur en opslagtijd; zorg ervoor dat deze parameters zijn consistent / geoptimaliseerd voor uw experimenten. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Detachement van hydrogel van glassubstraat tijdens celkweek. </td><td> Slechte slide reiniging en silaneren. </td><td> Vervang werkende oplossingen voor het reinigen en slidesilaneren. </td></tr><tr><td> Overdehydrated hydrogel. </td><td> Niet hydrogels dehydrateren op een hete plaat langer dan 15-30 minuten te verlaten. </td></tr><tr><td> 4. Analyse van de gegevens. </td><td> Hoge variabiliteit tussen repliceren plekken en glijbanen. </td><td> Variabiliteit in serie fabricage. </td><td> Controleer of de pinnen en printkop schoon zijn. Bevestig luchtbevochtiger functie. Visualiseren en kwantificeren spot en de vele kwaliteit met fluorescerende markers. WINKEL arrays zoals hierboven aanbevolen. </td></tr></tbody></table> Tabel 1: Problemen oplossen.

Celdifferentiatie wordt gereguleerd door een groot aantal micro-omgeving factoren, met inbegrip van zowel matrix samenstelling en de ondergrond eigenschappen. We beschrijven hier een techniek gebruikmaking cel microarrays in samenhang met trekkracht microscopie zowel celdifferentiatie en biomechanische cel- substraatinteracties als functie van de micro-omgeving context evalueren.

Een High-throughput Cell Microarray Platform voor Correlatieve Analyse van de Cel Differentiatie en trekkrachten

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

Het algemene doel van dit cel-microarrayplatform is om metingen van zowel celdifferentiatie als tractiekrachten te correleren als functie van de micro-omgevingscontext. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van tissue engineering, wat zowel fundamenteel onderzoek naar stamcelbiologie als de optimalisatie van differentiatieprotocollen mogelijk maakt. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn de doorvoersnelheid, de mogelijkheid om biochemische en biofysische signalen te variëren, en eindpuntuitlezingen via zowel immunofluorescentie als tractiekrachtmicroscopie, oftewel TFM.Hoewel deze methode is gebruikt voor het begrijpen van de differentiatie van leverprogenitoren, kan deze gemakkelijk worden toegepast op andere arteriële celtypen en weefselcontexten. Een visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien het experimentele succes afhankelijk is van de integratie van het array-protocol met zowel hoogwaardige hydrogel-substraten als tractiekrachtmicroscopie. Om polyacrylamide-hydrogels met fluorescente kraaltjes te fabriceren op een gesilaniseerde glazen petrischaal van 35 mm met glazen bodem voor de live-evaluatie van cel-substraatinteracties met behulp van TFM, moeten eerst de glazen substraten in oplossingen worden voorbereid zoals beschreven in het tekstprotocol.Plaats gesilaniseerde glazen petrischalen met een bodem van 35 mm in een glazen droogrek en pipetteer 20 µL van de pre-polymeerkraal- naar foto-initiatieuroplossing in een verhouding van 9-op-1 op het midden van elke schaal. Dek elke schaal voorzichtig af met een cirkelvormig dekglas van 12 mm, waarbij moet worden voorkomen dat er luchtbellen ontstaan. Om de fluorescerende kralen over het oppervlak van de hydrogel te verdelen, worden de schalen omgedraaid en 20 minuten bij kamertemperatuur gelaten.Belicht de schaal terwijl deze nog omgekeerd is gedurende 10 minuten met 365 nanometer UVA. Optimaliseer de polymerisatietijd indien nodig. Dompel de hydrogels vervolgens onder in 1 molar HEPES-buffer en laat deze overnacht bij kamertemperatuur in het donker staan.Verwijder de dekglasplaatjes voorzichtig met een scheermes, waarbij u erop let dat de gepolymeriseerde hydrogels niet beschadigd raken. Dehydrateer de hydrogels op een warmteplaat bij 50 °C tot ze droog zijn. Hydrogels kunnen drie maanden bij kamertemperatuur in het donker worden bewaard.Bereid de buffers voor het printen van de biomoleculen en voor de bronplaat voor zoals beschreven in het tekstprotocol. Nadat de schone pinnen zijn geladen zoals beschreven in het tekstprotocol, bereidt u de microarrayer voor en programmeert u deze met de software van de fabrikant. Zet vervolgens de bevochtiger aan.Stel het ingestelde punt in op 65% relatieve vochtigheid en wacht tot de rheometer het ingestelde punt heeft bereikt. Plaats de bronplaat in de juiste adapter. Plaats vervolgens de gedehydrateerde hydrogel-substraten in de juiste adapter.Pas de parameters van het programma aan om de lay-out van de bronplaat, het array-ontwerp en het gewenste formaat nauwkeurig weer te geven. Start de fabricage van het array. Controleer ten minste één keer per uur of de luchtvochtigheid niet onder 65% relatieve vochtigheid is gezakt en of de pinnen niet verstopt zijn.Als de luchtvochtigheid onverwacht is gedaald, pauzeer dan het arrayen om de bevochtiger bij te vullen en eventuele condensatie in de bijbehorende buisjes te verwijderen. Als de pinnen verstopt zijn, pauzeer dan het arrayen om de pinnen te reinigen of vervang ze door vooraf gereinigde pinnen. Zodra het programma is voltooid, worden de vervaardigde arrays in een objectglazendoos of microplaat geplaatst en afgedekt met aluminiumfolie.Laat de arrays een nacht bij kamertemperatuur en een relatieve vochtigheid van 65% staan. Uit onze ervaring blijkt dat de meest voorkomende problemen verband houden met de fabricage van de arrays. Wij raden aan om de technische kwaliteit en robuustheid van de gefabriceerde arrays te bevestigen met behulp van fluorescentielabelled moleculen, algemene eiwitkleuringen en immunofluorescentie.Dompel de 35 mm petrischalen met de array de dag na fabricage onder in 3 mL 1% volume per volume penicilline-streptomycine in PVS. Stel de array-substraten 30 minuten lang bloot aan UVC. Vervang vervolgens de penicilline-streptomycine-oplossing door celkweekmedium.Nadat de cellen zijn verzameld en geteld, worden de cellen op arrays gezaaid met 3 mL per 35 mm petrischaal. Incubeer de array-culturen bij 37 degrees Celsius en 5%CO2 gedurende twee tot 24 uur, of totdat er goed bevolkte cel-eilanden zijn gevormd. De zaaidichtheid en de tijd kunnen worden aangepast afhankelijk van de cellen en de specifieke toepassing.Nadat de cel-eilandjes zijn gevormd, worden de array-culturen twee keer gewassen met 3 mL voorverwarmd celkweekmedium. Op dit punt kunnen de relevante controles en behandelingen aan het biologische systeem worden toegevoegd. Vervang het medium van de arrays elke één tot twee dagen om de concentratie van de behandelingen te handhaven.Voer één tot vijf dagen na het starten van de array-culturen een live evaluatie uit van de interacties tussen cellen en het substraat met behulp van TFM. Plaats de 35 mm petrischalen met array-culturen in een geïncubeerde geïnverteerde fluorescentiemicroscoop met een robotische tafel voor TFM-metingen. Markeer in één schaal de posities en focusvlakken van individuele cel-eilanden met behulp van fasecontrastmicroscopie.Schakel over naar ver-rood fluorescentiemicroscopie om de beads te visualiseren. Keer vervolgens terug naar elke positie die in de vorige stap is opgeslagen en corrigeer de z-coördinaat van het brandvlak, zodat alleen de eerste laag beads onder het cel-eiland in focus is. Sla de nieuwe coördinaten op en ga over tot geautomatiseerde beeldvorming van alle cel-eilanden om de fasecontrast- en ver-rood fluorescentiebeelden van de pre-dissociatiefase vast te leggen.Voeg vervolgens voorzichtig 150 µL BSA/SDS-oplossing toe aan de schaal en wacht vijf minuten om volledige dissociatie van de cellen van het substraat mogelijk te maken. Controleer de dissociatie van de cellen met fasecontrastmicroscopie. Nadat de cel-eilanden van het substraat zijn gedissocieerd, keert u terug naar de gemarkeerde posities en controleert u of de eerste laag kralen nog steeds in focus is.Als deze bolletjes buiten het vlak liggen door vervorming veroorzaakt door cel-gegenereerde tractie, corrigeer dan de z-coördinaat van het gefocuste vlak zodat ze weer in focus zijn. Sla de gecorrigeerde z-coördinaten op en herhaal de geautomatiseerde beeldvorming van alle eilanden om de far-red fluorescentiebeelden na dissociatie vast te leggen. Herhaal deze stappen voor de resterende schaaltjes.Proteïne A/G-geconjugeerde notch-liganden jagged one en delta like one vertoonden een verbeterde retentie in hydrogels. De presentatie van het notch-ligand stimuleerde daarnaast de differentiatie van leverprogenitoren richting een galgangcel-lot, zoals aangegeven door de aanwezigheid van de groene galgangcelmarker. De respons op notch-liganden werd gekwantificeerd voor vijf extracellulaire matrix- (ECM-) proteïnen en toonde aan dat de respons van leverprogenitoren op liganden afhankelijk is van de ECM-context.Small hairpin RNA knockdown werd gebruikt om progenitorcellen te genereren zonder de liganden delta like one en jagged one. De cellen werden vervolgens blootgesteld aan de notch-liganden jagged one, delta like one en delta like four. De respons op het array van notch-liganden varieerde afhankelijk van de cel-intrinsieke expressie van elk ligand.Deze afbeeldingen tonen de differentiatie van leverprogenitoren als afhankelijk van zowel de stijfheid van het substraat als de samenstelling van de ECM. Kwantitatieve analyse onthulde dat collageen vier differentiatie ondersteunt op zowel zachte als stijve substraten, terwijl fibronectine differentiatie alleen ondersteunt op stijve substraten. Representatieve heatmaps suggereren dat aanhoudende tractiestress bij een lage substraatstijfheid op collageen vier de differentiatie tot galgangcellen bevordert.Deze bevinding werd bevestigd door kwantificering van de gemiddelde root mean square-waarden van de tractiespanning. Deze video en het bijbehorende protocol hebben de belangrijkste stappen beschreven voor het vervaardigen van hydrogels en arrays om celculturen uit te voeren op de gearrayde substraten en voor het meten van cel-substraatinteracties met behulp van tractiekrachtmicroscopie. Na gewenning aan de technieken kan elk experiment in slechts één tot twee weken worden voltooid, mits correct uitgevoerd.In aanvulling op deze methode dienen celculturen te worden gebruikt om array-condities met een hoge score te valideren middels kwalitatieve PCR, immunoblottings, mechanobiologische assen op standaard schaal of andere complementaire moleculaire biologische technieken. Dit veelzijdige platform kan worden toegepast voor het high-throughput onderzoek van celfuncties in een breed scala aan cel- en weefselcontexten, waaronder stamceldifferentiatie en kankercelbiologie.

a-high-throughput-cell-microarray-platform-for-correlative-analysis

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

In dit protocol, tonen we de fabricage van een Microactuator reeks van verticaal verschoven berichten op de technologie gebaseerd is, en hoe deze basistechnologie kunnen worden gewijzigd om high-throughput mechanisch dynamische celkweek te voeren in zowel twee-dimensionale en drie-dimensionale cultuur paradigma's.

Microfabricated Platforms voor Mechanisch Dynamic Cel Cultuur

This video describes the traction force microscopy assay. The assay determines the cellular traction of human colon cancer cells on the extracellular matrix present on soft elastic hydrogel having embedded fluorescent beads. The resultant displacement of fluorescent beads is measured using an appropriate software.

Traction Cytometry Assay: A Method to Quantify Traction Force Exerted by Cancer Cells on ECM

We hebben een geautomatiseerde celkweek en verhoor platform ontwikkeld voor micro-schaal cel stimulatie experimenten. Het platform biedt eenvoudige, veelzijdige en precieze controle in het cultiveren en stimuleren van kleine populaties van cellen en het terugwinnen van lysaten voor moleculaire analyses. Het platform is geschikt voor studies die kostbare cellen en / of reagentia.

Een veelzijdige Geautomatiseerde platform voor micro-schaal cel stimulatie Experimenten

Deze studie beschrijft een experimenteel platform om snel gemanipuleerde stamcellen en hun gedrag te karakteriseren voordat ze worden toegepast in langetermijn in vivo transplantatiestudies voor redding en herstel van het zenuwstelsel.

Hoge doorvoer analyse van volwassen stamcellen ontwikkeld voor toediening van therapeutische factoren voor Neuroprotective Strategies

Beschreven worden protocollen voor het kwantificeren van mechanische interacties tussen aderente cellen en microgestructureerde substraten. Deze interacties zijn nauw verbonden met essentiële celgedragingen, waaronder migratie, proliferatie, differentiatie en apoptose. De protocollen presenteren een open-source beeldanalysesoftware genaamd MechProfiler, die de bepaling van betrokken krachten voor elke micropost mogelijk maakt.

Gemakkelijk en nauwkeurig voor mechanische profilering op MicroPOST Arrays

We presenteren een hoge doorvoer tractiekracht assay gefabriceerd met silicone rubber (PDMS). Deze nieuwe assay is geschikt voor het bestuderen van fysieke veranderingen in cel contractiliteit tijdens verschillende biologische en biomedische processen en ziekten. We demonstreren het nut van deze methode door het meten van een TGF-β afhankelijke toename van de contractiliteit tijdens de epitheel-naar-mesenchymale overgang.

Hoge doorvoer Tractiekracht microscopie met behulp van PDM'S onthult dosisafhankelijke effecten van het transformeren van groei factor-β op de epitheliale-naar-mesenchymale overgang

Mechanische krachten zijn belangrijk voor het beheersen van de Celmigratie. Dit protocol demonstreert het gebruik van elastische hydrogels die kunnen worden vervormd met behulp van een glazen micro pipet en een micro manipulator om cellen te stimuleren met een lokale stijfheids gradiënt om veranderingen in celstructuur en migratie teweeg te brengen.

Enkelvoudige cel Duro Taxis assay voor de beoordeling van de mechanische controle van cellulaire beweging en gerelateerde signalering van gebeurtenissen

Dit protocol bevat instructies voor het implementeren van multiphoton-lithografie om driedimensionale arrays van fluorescerende fiducial markers te fabriceren die zijn ingebed in op poly (ethyleenglycol) gebaseerde hydrogels voor gebruik als referentie vrij, tractiekracht microscopie platforms. Door deze instructies te gebruiken, wordt het meten van de 3D-materiaal stam en de berekening van cellulaire tracties vereenvoudigd om de tractiekracht van hoge doorvoer te bevorderen.

Fabricage en implementatie van een referentie vrije aandrijfkracht microscopie platform

Collectieve Celmigratie in ontwikkeling, wondgenezing en kanker metastasen wordt vaak geleid door de gradiënten van groeifactoren of signalering van moleculen. Hier beschreven is een experimenteel systeem dat tractie microscopie combineert met een microfluïdisch systeem en een demonstratie van het kwantificeren van de mechanica van collectieve migratie onder biochemische gradiënt.

Tractie microscopie geïntegreerd met microfluïdica voor Chemotactische collectieve migratie

Het Integrative Toolkit to Analyze Cellular Signals (iTACS) platform automatiseert het proces van het gelijktijdig meten van een breed scala aan chemische en mechanische signalen in aanhangende cellen. iTACS is ontworpen om community-driven ontwikkeling te vergemakkelijken en onderzoekers in staat te stellen alle platformfuncties te gebruiken, ongeacht hun educatieve achtergrond.

Integratieve toolkit om cellulaire signalen te analyseren: krachten, beweging, morfologie en fluorescentie

Dit werk presenteert een flexibel protocol voor het gebruik van fluorescerend gelabelde elastomeer contracteerbare oppervlakken (FLECS) -technologie in microwell-formaat voor vereenvoudigde, hands-off kwantificering van contractiele krachten met één cel op basis van gevisualiseerde verplaatsingen van fluorescerende eiwitmicropatronen.

Vereenvoudigde, high-throughput analyse van eencellige contractiliteit met behulp van microgepatterde elastomeren

Leer een high-throughput cel microarray methode voor het correleren van cel differentiatie en trekkrachten met behulp van fluorescerende polyacrylamide hydrogels. Deze techniek ondersteunt stamcelonderzoek en weefselengineering toepassingen.

Een High-throughput Cell Microarray Platform voor Correlatieve Analyse van de Cel Differentiatie en trekkrachten

Meer video's verkennen