Een High-throughput Cell Microarray Platform voor Correlatieve Analyse van de Cel Differentiatie en trekkrachten

Het algemene doel van dit cel-microarrayplatform is om metingen van zowel celdifferentiatie als tractiekrachten te correleren als functie van de micro-omgevingscontext. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van tissue engineering, wat zowel fundamenteel onderzoek naar stamcelbiologie als de optimalisatie van differentiatieprotocollen mogelijk maakt. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn de doorvoersnelheid, de mogelijkheid om biochemische en biofysische signalen te variëren, en eindpuntuitlezingen via zowel immunofluorescentie als tractiekrachtmicroscopie, oftewel TFM.

Hoewel deze methode is gebruikt voor het begrijpen van de differentiatie van leverprogenitoren, kan deze gemakkelijk worden toegepast op andere arteriële celtypen en weefselcontexten. Een visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien het experimentele succes afhankelijk is van de integratie van het array-protocol met zowel hoogwaardige hydrogel-substraten als tractiekrachtmicroscopie. Om polyacrylamide-hydrogels met fluorescente kraaltjes te fabriceren op een gesilaniseerde glazen petrischaal van 35 mm met glazen bodem voor de live-evaluatie van cel-substraatinteracties met behulp van TFM, moeten eerst de glazen substraten in oplossingen worden voorbereid zoals beschreven in het tekstprotocol.

Plaats gesilaniseerde glazen petrischalen met een bodem van 35 mm in een glazen droogrek en pipetteer 20 µL van de pre-polymeerkraal- naar foto-initiatieuroplossing in een verhouding van 9-op-1 op het midden van elke schaal. Dek elke schaal voorzichtig af met een cirkelvormig dekglas van 12 mm, waarbij moet worden voorkomen dat er luchtbellen ontstaan. Om de fluorescerende kralen over het oppervlak van de hydrogel te verdelen, worden de schalen omgedraaid en 20 minuten bij kamertemperatuur gelaten.

Belicht de schaal terwijl deze nog omgekeerd is gedurende 10 minuten met 365 nanometer UVA. Optimaliseer de polymerisatietijd indien nodig. Dompel de hydrogels vervolgens onder in 1 molar HEPES-buffer en laat deze overnacht bij kamertemperatuur in het donker staan.

Verwijder de dekglasplaatjes voorzichtig met een scheermes, waarbij u erop let dat de gepolymeriseerde hydrogels niet beschadigd raken. Dehydrateer de hydrogels op een warmteplaat bij 50 °C tot ze droog zijn. Hydrogels kunnen drie maanden bij kamertemperatuur in het donker worden bewaard.

Bereid de buffers voor het printen van de biomoleculen en voor de bronplaat voor zoals beschreven in het tekstprotocol. Nadat de schone pinnen zijn geladen zoals beschreven in het tekstprotocol, bereidt u de microarrayer voor en programmeert u deze met de software van de fabrikant. Zet vervolgens de bevochtiger aan.

Stel het ingestelde punt in op 65% relatieve vochtigheid en wacht tot de rheometer het ingestelde punt heeft bereikt. Plaats de bronplaat in de juiste adapter. Plaats vervolgens de gedehydrateerde hydrogel-substraten in de juiste adapter.

Pas de parameters van het programma aan om de lay-out van de bronplaat, het array-ontwerp en het gewenste formaat nauwkeurig weer te geven. Start de fabricage van het array. Controleer ten minste één keer per uur of de luchtvochtigheid niet onder 65% relatieve vochtigheid is gezakt en of de pinnen niet verstopt zijn.

Als de luchtvochtigheid onverwacht is gedaald, pauzeer dan het arrayen om de bevochtiger bij te vullen en eventuele condensatie in de bijbehorende buisjes te verwijderen. Als de pinnen verstopt zijn, pauzeer dan het arrayen om de pinnen te reinigen of vervang ze door vooraf gereinigde pinnen. Zodra het programma is voltooid, worden de vervaardigde arrays in een objectglazendoos of microplaat geplaatst en afgedekt met aluminiumfolie.

Laat de arrays een nacht bij kamertemperatuur en een relatieve vochtigheid van 65% staan. Uit onze ervaring blijkt dat de meest voorkomende problemen verband houden met de fabricage van de arrays. Wij raden aan om de technische kwaliteit en robuustheid van de gefabriceerde arrays te bevestigen met behulp van fluorescentielabelled moleculen, algemene eiwitkleuringen en immunofluorescentie.

Dompel de 35 mm petrischalen met de array de dag na fabricage onder in 3 mL 1% volume per volume penicilline-streptomycine in PVS. Stel de array-substraten 30 minuten lang bloot aan UVC. Vervang vervolgens de penicilline-streptomycine-oplossing door celkweekmedium.

Nadat de cellen zijn verzameld en geteld, worden de cellen op arrays gezaaid met 3 mL per 35 mm petrischaal. Incubeer de array-culturen bij 37 degrees Celsius en 5%CO2 gedurende twee tot 24 uur, of totdat er goed bevolkte cel-eilanden zijn gevormd. De zaaidichtheid en de tijd kunnen worden aangepast afhankelijk van de cellen en de specifieke toepassing.

Nadat de cel-eilandjes zijn gevormd, worden de array-culturen twee keer gewassen met 3 mL voorverwarmd celkweekmedium. Op dit punt kunnen de relevante controles en behandelingen aan het biologische systeem worden toegevoegd. Vervang het medium van de arrays elke één tot twee dagen om de concentratie van de behandelingen te handhaven.

Voer één tot vijf dagen na het starten van de array-culturen een live evaluatie uit van de interacties tussen cellen en het substraat met behulp van TFM. Plaats de 35 mm petrischalen met array-culturen in een geïncubeerde geïnverteerde fluorescentiemicroscoop met een robotische tafel voor TFM-metingen. Markeer in één schaal de posities en focusvlakken van individuele cel-eilanden met behulp van fasecontrastmicroscopie.

Schakel over naar ver-rood fluorescentiemicroscopie om de beads te visualiseren. Keer vervolgens terug naar elke positie die in de vorige stap is opgeslagen en corrigeer de z-coördinaat van het brandvlak, zodat alleen de eerste laag beads onder het cel-eiland in focus is. Sla de nieuwe coördinaten op en ga over tot geautomatiseerde beeldvorming van alle cel-eilanden om de fasecontrast- en ver-rood fluorescentiebeelden van de pre-dissociatiefase vast te leggen.

Voeg vervolgens voorzichtig 150 µL BSA/SDS-oplossing toe aan de schaal en wacht vijf minuten om volledige dissociatie van de cellen van het substraat mogelijk te maken. Controleer de dissociatie van de cellen met fasecontrastmicroscopie. Nadat de cel-eilanden van het substraat zijn gedissocieerd, keert u terug naar de gemarkeerde posities en controleert u of de eerste laag kralen nog steeds in focus is.

Als deze bolletjes buiten het vlak liggen door vervorming veroorzaakt door cel-gegenereerde tractie, corrigeer dan de z-coördinaat van het gefocuste vlak zodat ze weer in focus zijn. Sla de gecorrigeerde z-coördinaten op en herhaal de geautomatiseerde beeldvorming van alle eilanden om de far-red fluorescentiebeelden na dissociatie vast te leggen. Herhaal deze stappen voor de resterende schaaltjes.

Proteïne A/G-geconjugeerde notch-liganden jagged one en delta like one vertoonden een verbeterde retentie in hydrogels. De presentatie van het notch-ligand stimuleerde daarnaast de differentiatie van leverprogenitoren richting een galgangcel-lot, zoals aangegeven door de aanwezigheid van de groene galgangcelmarker. De respons op notch-liganden werd gekwantificeerd voor vijf extracellulaire matrix- (ECM-) proteïnen en toonde aan dat de respons van leverprogenitoren op liganden afhankelijk is van de ECM-context.

Small hairpin RNA knockdown werd gebruikt om progenitorcellen te genereren zonder de liganden delta like one en jagged one. De cellen werden vervolgens blootgesteld aan de notch-liganden jagged one, delta like one en delta like four. De respons op het array van notch-liganden varieerde afhankelijk van de cel-intrinsieke expressie van elk ligand.

Deze afbeeldingen tonen de differentiatie van leverprogenitoren als afhankelijk van zowel de stijfheid van het substraat als de samenstelling van de ECM. Kwantitatieve analyse onthulde dat collageen vier differentiatie ondersteunt op zowel zachte als stijve substraten, terwijl fibronectine differentiatie alleen ondersteunt op stijve substraten. Representatieve heatmaps suggereren dat aanhoudende tractiestress bij een lage substraatstijfheid op collageen vier de differentiatie tot galgangcellen bevordert.

Deze bevinding werd bevestigd door kwantificering van de gemiddelde root mean square-waarden van de tractiespanning. Deze video en het bijbehorende protocol hebben de belangrijkste stappen beschreven voor het vervaardigen van hydrogels en arrays om celculturen uit te voeren op de gearrayde substraten en voor het meten van cel-substraatinteracties met behulp van tractiekrachtmicroscopie. Na gewenning aan de technieken kan elk experiment in slechts één tot twee weken worden voltooid, mits correct uitgevoerd.

In aanvulling op deze methode dienen celculturen te worden gebruikt om array-condities met een hoge score te valideren middels kwalitatieve PCR, immunoblottings, mechanobiologische assen op standaard schaal of andere complementaire moleculaire biologische technieken. Dit veelzijdige platform kan worden toegepast voor het high-throughput onderzoek van celfuncties in een breed scala aan cel- en weefselcontexten, waaronder stamceldifferentiatie en kankercelbiologie.