Fabricage en implementatie van een referentie vrije aandrijfkracht microscopie platform

Tractie kracht microscopie wordt gebruikt om cel gegenereerde krachten te meten. Dit protocol vereenvoudigt de verzameling analyse van tractie kracht gegevens, om het toegankelijker te maken voor onervaren gebruikers. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande referentie-vrije tractie kracht microscopie platforms, is dat multiphoton lithografie maakt een snelle en eenvoudige patrooninstelling herontwerp volgens individuele experimentele behoeften.

Er zijn veel belangrijke stappen in de fabricage en implementatie van dit nieuwe referentievrije tractieplatform die gemakkelijker te begrijpen zijn door middel van visuele weergave in plaats van alleen tekst. Voor fotopolymerisatie van de basishydrogel voegt u eerst drie microliter van de pre-polymeeroplossing toe aan een dunne, vlakke plaat perfluoralkyalkanen en plaatst u platte 150 micrometer dikke PDMS-strips omliggende, maar niet in contact met de druppel pre-polymeeroplossing. Plaats een acrylaat silanized coverslip op de PDMS, met de pre-polymeer druppel gecentreerd onder de coverslip om de pre-polymeer druppel plat tot de dikte van de PDMS afstandhouders.

Stel de ingeklemde pre-polymeeroplossing ongeveer één minuut bloot aan UV-licht. Wanneer een hydrogel volledig is gevormd, zorgvuldig scheiden van de coverslip van de PDMS afstandhouders. Gebruik high performance dubbelzijdige acryllijm om een open bodem Petri schotel hechten aan de coverslip.

Let er vooral op bij het vasthouden van de hydrogel-beladen coverslip aan de Petri schotel. Een natte schotel of te weinig druk tijdens de toepassing zal het mogelijk maken lekken te vormen, verpest het monster. Druk op het contactoppervlak van de lijm om een volledige afdichting tussen de coverslip, lijm en petrischaal te creëren, waarbij u ervoor zorgt dat het glas niet wordt gebarsten.

Gebruik steriele gefilterde PBS om de hydrogel af te spoelen. Voeg vervolgens acht microliters van NVP toe aan 800 microliter van de laboratoriumoplossing die is voorbereid voor de hydrogelsynthese. Als u een binaire afbeelding wilt converteren naar een digitaal masker, opent u MATLAB en opent en voert u de runscript uit.

m MATLAB script. Selecteer het binaire TIF-bestand voor conversie en selecteer een map om de bestanden van de regio op te slaan. Voer de gewenste uiteindelijke grootte in micron van de geselecteerde afbeelding in.

De invoerafbeelding wordt geschaald en gedimensioneerd om aan deze parameters te voldoen. Als u één pixelarray wilt maken, schakelt u in de opties voor regio van interessegenerator het selectievakje Verwijderen onder Kleine gebieden/enkele pixels uit, schakelt u het selectievakje Vierkanten in en schakelt u Het selectievakje Gebruiken onder Horizontale onderbrekingslijnen uit. Klik vervolgens op OK. Het OVL-bestand wordt gevonden in de eerder opgegeven map.

Open het bestand in de microscoopsoftware en laad de gewenste gebieden die de lasersluiter controleerden tijdens twee fotonlaserscanninglithografie. De volgende stappen moeten worden uitgevoerd in omstandigheden met minimaal licht. Voor de fabricage van fiduciale marker arrays onder omstandigheden met weinig licht, grondig mengen 200 microliters van de eerder voorbereide NVP lab oplossing met 20 milligram Alexa Fluor 633 en verwijder alle PBS uit de schotel met de hydrogel.

Voeg het PEG-633 mengsel toe aan de hydrogel als een druppel die de basishydrogel volledig omvat en laad de petrischaal op de monsterhouder van het microscoopstadium. Bedek vervolgens de schotel en laat de patroonoplossing minstens 30 minuten in de hydrogel weken, beschermd tegen licht. Als u de microscoop voor beeldvorming wilt configureren, selecteert u de juiste lasers en filters voor het visualiseren van Alexa Fluor 488.

Zoek de hydrogel met behulp van het PEG-488 signaal en blokkeer het verzamelen van langere emissiegolflengten van de detector. Gebruik verticale en horizontale tegelscans om het midden van de hydrogel in het XY-vlak te lokaliseren en het gewenste moment in deze positie te bereiken. Gebruik lijnscans in de Z-stack functie om het oppervlak van de hydrogel te lokaliseren en nul de focus in deze positie.

Niveau van de hydrogel door het herhalen van de lijn scans uit de buurt van de XY centrum om het oppervlak positie te identificeren, het aanpassen van de set schroeven voor de microscoop stadium, indien nodig. Maak binnen de werkruimte van de microscoopsoftware een apart experimentbestand voor fotopatronen en stel de multi-fotonkracht in op 1,8% en de scansnelheid op zes. Pas de grootte van het afbeeldingskader en de pixels aan om een pixelgrootte van 0,1 micrometer per pixel en een beeldverhouding van 100 op één te bereiken en het regiobestand op het tabblad van het gebied te laden.

Gebruik een macro om alle regio's in te stellen om de functie Z-stack te verwerven en in te schakelen. Stel de afstand in op 3,5 micrometer voor een totale diepte van 28 micrometer en het totale aantal Z-segmenten van negen. Gebruik vervolgens de functie Posities om specifieke locaties in te stellen op de hydrogel waar de fiduciale markeringsarrays worden gefotopatterd.

Als de weken tijd nadert de 30 minuten merk, verwerven opeenvolgende Z-stack lijn scans van het oppervlak van de hydrogel om de vijf minuten om te controleren op zwelling op basis van veranderingen in de locatie van het oppervlak ten opzichte van de nul focus positie. Als er gedurende het interval van vijf minuten geen verandering in de oppervlaktepositie heeft plaatsgevonden, voert u de patrooninstellingen uit en gebruikt u de laser van 488 nanometer om te controleren of het oppervlak van de hydrogel niet is verplaatst tijdens de patronen. Haal vervolgens de hydrogel uit de microscoop, haal de PEG-633-oplossing uit de petrischaal en spoel de schotel af met steriele gefilterde PBS.

Als u een cel- en fiduciale markeringsafbeeldingen wilt verkrijgen, keert u de petrischaal terug naar de monsterhouder om de gebieden met patroon te lokaliseren. Zoek een cel van belang en verwerf een verzonden of fluorescerende afbeelding van de cel. Verwerf vervolgens een Z-stack van de patroonarray onder de cel zoals aangetoond, en verwerf een tweede reeks verzonden of fluorescerende beelden van de cel.

Bij het verzamelen van een afbeeldingsstapel moeten de resulterende afbeeldingen een regelmatige reeks patroonfuncties weergeven die in intensiteit oscilleren als functie van de Z-positie in de afbeeldingsstack. De tracking. m script biedt verschillende diagnostische beelden, waaronder een Z-projectie van de fluorescerende fiduciale markers om de pre-processing kwaliteit te beoordelen, een plot van de gedetecteerde centroids, kleur gecodeerd als een functie van de Z-positie om de objectdetectie kwaliteit te beoordelen, en een plot van de tracks die de gedetecteerde marker centroids die zijn gekoppeld aan kolommen in de Z-richting om de kwaliteit van het bijhouden van objecten te beoordelen.

Het SCRIPT DISP 3D.m biedt een plot van intensiteit als functie van de Z-positie voor elke kolom met gedetecteerde functies in een bepaalde beeldstack om de kwaliteit van de fiduciale markerintensiteitsprofielen te beoordelen. Beide DISP 3D.

m en DISP schaar. m samen histogrammen van de gemeten verplaatsingsgeluid in elk van de Cartesiaanse coördinatendimensies en geïnterpoleerde warmtekaarten van verplaatsing. Bovendien final3D_2 de interp.

m levert warmtekaarten van de oppervlaktetractieen berekend met behulp van de uitbestede code. Het belangrijkste om te onthouden tijdens deze procedure is dat oplossingen die LAP bevatten gevoelig zijn voor licht en zoveel mogelijk moeten worden beschermd tegen omgevingslichtbronnen. Vergeet niet dat NVP is een vluchtige organische verbinding en moet altijd worden behandeld in een chemische stroom kap.