Een eenvoudige methode voor glucosinolaat Extractie en analyse met hoge-druk vloeistofchromatografie (HPLC)
March 15th, 2017
Hier beschrijven we in grote detail een gevestigd en robuust protocol voor de extractie van glucosinolaten uit gemalen plantmateriaal. Na een on-column sulfatase-behandeling van de extracten, worden de desulfoglucosinolates geëlueerd en geanalyseerd door middel van hoog-druk vloeistof chromatografie.
Het algemene doel van dit protocol is om een eenvoudige en directe analyse van glucosinolaten in planten en andere biologische monsters uit te voeren. Deze methode om glucosinolaten te extraheren en te analyseren kan worden gebruikt om belangrijke vragen te beantwoorden in plant-insect ecologie, plantpathologie, plantenveredeling en voedingswetenschappen. Het grote voordeel van deze techniek is dat het goed gevalideerd is en breed toepasbaar is op een groot aantal biologische monsters.
Hoewel deze methode voornamelijk wordt gebruikt om glucosinolaten in plantaardig materiaal te kwantificeren, kan deze ook worden toegepast op grond of bereid voedsel. Deze extractieprocedure kan in bijna elk lab worden uitgevoerd omdat je meestal standaard laboratoriumapparatuur gebruikt. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode de analyses en inspecties beter uitvoeren wanneer ze de film minstens een keer lezen en bekijken.
Om de procedure te beginnen, meng je 10 gram G-25 gecross-linked dextrine-gel met 125 milliliter ultrapuur water. Bewaar het mengsel in een fles met dop bij 4 graden Celsius. Los vervolgens 10.000 eenheden type H-1 arylsulfatase op in 30 milliliter ultrapuur water.
Voeg hieraan 30 milliliter absoluut ethanol toe en roer het mengsel goed. Centrifugeer het mengsel gedurende 20 minuten bij 2.650 keer G bij kamertemperatuur. Combineer het supernatant met 90 milliliter absoluut ethanol in een beker.
Meng en giet in nieuwe centrifugeerbuisjes. Centrifugeer het mengsel gedurende 15 minuten bij 1.030 keer G bij kamertemperatuur. Gooi het supernatant weg.
Los en combineer de pellets in een totaal van 25 milliliter ultrapuur water. Vorm het mengsel goed en breng het mengsel over in 1 milliliter buisjes. Bewaar de sulfaatmonsters bij 20 graden Celsius gedurende maximaal één jaar.
Weeg vervolgens ongeveer 90 milligram sinogram en noteer het gewicht tot op 1 microgram nauwkeurig. Los vervolgens het sinogram-monohydraat op in 10 milliliter ultrapuur water. Bereid hieruit vijf referentieoplossingen met concentraties variërend van 50 tot 750 micromolair.
Bewaar de referentieoplossingen in buisjes van 1,5 milliliter bij 20 graden Celsius. Label vervolgens voor elk monster en referentie een 2 milliliter microcentrifugebuisje in een kolomrekpositie. Prik elke microcentrifugebuisjedobbelsteen door met een dissectieneedel voor later bevriezen en drogen.
Plaats de gelabelde buisjes in een blok in dezelfde configuratie en afstand als de gelabelde kolommen. Om de glazen pijpkolom voor te bereiden, gebruik je een houten of glazen staaf om voorzichtig een stukje glaswol van 1 centimeter bij 1 centimeter in de pijp te duwen. Pak de glaswol in bij de overgang van de pijpbuis naar de schacht.
Plaats een pijpkolom in elke gelabelde positie op het rek. Plaats het rek boven een afvallade. Snijd het uiteinde van een plastic 1 milliliter pipettetip af.
Schud het voorbereide dextrine-gel goed. Gebruik vervolgens de verbreedde pipettetip om 0,5 milliliter voorbereid dextrine-gel in elke kolom te laden. Controleer de kolommen op lekkend dextrine-gel en vervang eventueel lekkende kolommen.
Zodra alle kolommen met dextrine-gel zijn geladen, was je elke kolom met 1 milliliter ultrapuur water. Weeg tussen de 50 en 100 milligram vrije stof, fijngemalen plantaardig materiaal in een 2 milliliter reactiebuis met veiligheidsdop en noteer het gewicht met een nauwkeurigheid van 0,1 milligram. Plaats twee metalen bollen van 3 millimeter diameter in elke buis.
Voeg aan elke buis 1 milliliter 70% methanol in ultrapuur water toe en schud kortjes elke mengsel. Sluit de buizen met extra veiligheidsdoppen en plaats ze onmiddellijk in een waterbad van 90 tot 92 graden Celsius. Verwarm de buizen tot de zaagput begint te koken.
Breng de buizen over naar een ultrasoonbad en sonisch verwarm de monsters gedurende 15 minuten. Tijdens het sonisch verwarmen, begin met het ontdooien van het sulfaatmonster en sinogramreferenties. Na het sonisch verwarmen, centrifugeer de monsters gedurende 10 minuten bij 2.700 keer G bij kamertemperatuur.
Laad de supernatanten en ontdooide sinogramreferenties op de overeenkomstige kolommen, wees voorzichtig om geen plantmateriaal in de pijp te trekken. Voeg aan elke buis 1 milliliter 70% methanol toe. Vorm het mengsel.
En verwarm de mengsels sonisch gedurende 15 minuten. Centrifugeer de buizen opnieuw onder dezelfde omstandigheden als eerder. Laad de supernatanten op de overeenkomstige kolommen.
Voeg twee porties van 1 milliliter 70% methanol toe aan elke kolom, laat de kolommen tussen elke portie droog lopen. Was restmethanol van elke kolom met 1 milliliter ultrapuur water. Was vervolgens elke kolom met twee porties van 1 milliliter 20 millimolair natriumacetaatbuffer, pH 5,5.
Zodra de laatste porties natriumacetaatbuffer in de afvalrek zijn gedraineerd, verwijder je het rek uit de afvallade en droog de voeten van het rek af met tissue. Plaats het rek boven de blok gelabelde microcentrifugebuisjes, zodat de kolompunten in de overeenkomstige buisjes zitten. Laad 20 microliter sulfaatoplossing op elke kolom, zorg ervoor dat de oplossing het oppervlak van het kolom materiaal bereikt.
Spoel de sulfaatoplossing in het kolom materiaal met 50 microliter natriumacetaatbuffer. Het is erg belangrijk dat het sulfaat in de kolom wordt gewassen. Het enzym moet op de kolom zitten om te reageren op de intacte glucosinolaten die aan de kolom zijn gebonden.
Zodra de sulfaatoplossing in elke kolom is gewassen, bedek de kolommen met aluminiumfolie. Laat de kolommen een nacht staan. Eludeer vervolgens de de-sulfo-glucosinolates uit elke kolom met twee porties van 0,75 milliliter ultrapuur water.
Zodra de kolommen droog zijn gelopen, verwijder je het kolomrek en dop elke buis. Vries de buizen in vloeibare stikstof in, of bij 80 graden Celsius gedurende ten minste 30 minute
Overzicht
Dit artikel presenteert een gedetailleerd protocol voor het extraheren van glucosinolaten uit plantaardig materiaal met behulp van hoogdrukvloeistofchromatografie. De methode is ontworpen om eenvoudig en toepasbaar te zijn op verschillende biologische monsters.
Belangrijke studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Plant-insecten ecologie
- Plantenpathologie
- Voedingswetenschappen
Achtergrond
- Glucosinolates zijn belangrijke verbindingen in planten.
- Ze spelen een rol in plantenverdedigingsmechanismen.
- Het begrijpen van hun concentratie kan verschillende biologische studies helpen.
- Dit protocol is gevalideerd voor een breed scala aan monsters.
Doel van het onderzoek
- Om een betrouwbare methode te bieden voor glucosinolatextractie en analyse.
- Om onderzoek in plantgerelateerde gebieden te vergemakkelijken.
- Om kwantificering van glucosinolates in diverse monsters mogelijk te maken.
Gebruikte methoden
- Bereiding van dextrine gel en sulfatase oplossing.
- Steekproefextractie met behulp van methanol en sonicatie.
- Hoogdrukvloeistofchromatografie voor analyse.
- Vergelijking van retentietijden en UV-spectra met standaarden.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle extractie van glucosinolates uit plantaardig materiaal.
- Validatie van de methode over verschillende biologische monsters.
- Identificatie van glucosinolates door HPLC.
- Mogelijke toepassingen in ecologie en voedingswetenschappen.
Conclusies
- Het protocol is effectief voor glucosinolatanalyse.
- Het kan in verschillende onderzoeksomgevingen worden gebruikt.
- Verdere studies kunnen de toepassingen in de plantenwetenschappen uitbreiden.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Accurate quantification of glucosinolates supports target validation in plant-based bioactive compound discovery, enabling mechanistic de-risking of nutraceutical and crop protection candidates. This method provides predictive confidence in identifying beneficial versus detrimental glucosinolate profiles, informing lead identification and portfolio triage in agricultural biotechnology and functional food development. Its broad applicability across plant tissues and biological samples enhances translational continuity from discovery to preclinical evaluation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by linking specific glucosinolate structures to biological activities such as progoitrin (detrimental) or glucoraphanin (beneficial).
- Operational Value: Supports biological de-risking through reliable quantification of intact glucosinolates after myrosinase inactivation and sulfatase treatment.
- Predictive Value: Facilitates predictive confidence in target validation by generating quantitative data for structure-activity relationship analysis.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by delivering desulfoglucosinolates suitable for HPLC-based detection and quantification.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility through sinigrin-based calibration curves and established response factors.
- Scalability: Enables processing of 150–200 samples per person per day, supporting high-throughput screening readiness.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase glucosinolate profiling to preclinical validation through disease-relevant systems in plant pathology and food sciences.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by identifying harmful breakdown products (e.g., nitriles) versus beneficial ones (e.g., isothiocyanates) based on glucosinolate profiles.
- Biomarker Alignment: Enables translational biomarker development by correlating glucosinolate concentrations with phenotypic outcomes in ecological and breeding studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical support, particularly in nutraceutical and crop trait development pipelines.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying glucosinolate profiles that determine bioactive breakdown product formation.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs via HPLC with PDA/UV detection, enabling reliable compound evaluation across diverse plant matrices.
- Analytics: Provides measurable readouts (retention times, UV spectra, concentration calculations) that allow cross-condition comparison and structure-based classification.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through applications in food safety and plant health, where glucosinolate breakdown products influence biological outcomes.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable analytical platform due to its reliance on standard lab equipment and broad sample compatibility (plant, soil, foodstuffs).
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity in bioactive compound identification.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability across laboratories using accessible equipment.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in bioactive compound development.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on validated glucosinolate quantification.
Implementation Considerations
- Requires expertise in plant sample preparation, enzymatic treatment, and HPLC operation.
- Depends on access to centrifuges, water baths, ultrasonic baths, freeze-dryers, and HPLC systems with PDA/UV detection.
- Necessitates cross-team standardization of extraction timing, sulfatase incubation, and reference curve preparation.
- Involves adaptation considerations for varying plant matrices (leaf, seed, root) and non-plant samples (soil, foodstuffs).
- Includes practical limitations such as methanol handling hazards requiring fume hood use and the 12–24 hour freeze-dry step affecting turnaround time.
