Een eenvoudige gefractieerde extractie methode voor de uitgebreide analyse van metabolieten, lipiden en proteïnen uit een enkele monster

Het algemene doel van deze methode is om alle belangrijke moleculaire entiteiten, waaronder polaire en semi-polaire metabolieten, lipiden en eiwitten, uit één enkel monster te herstellen en te analyseren met behulp van een eenvoudige gefractioneerde methyl-tributylether-extractie. Over het algemeen vinden wetenschappers het lastig om meerdere verbindingenklassen uit een enkel monster te analyseren. Met de MTBE-extractie die we hier introduceren, kunt u meerdere verbindingenklassen, zoals lipiden, metabolieten en eiwitten, uit één enkel monster extraheren en analyseren.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat alle klassen moleculaire verbindingen robuust kunnen worden geëxtraheerd uit een kleine hoeveelheid van een enkel monsteraliquoot. Deze methode helpt bij het beantwoorden van fundamentele vragen in de systeembiologie, aangezien het de experimentele basis vormt voor multi-omics analyse door fracties te leveren die kunnen worden gebruikt voor proteomics, lipidomics en metabolomics. Het volgende protocol wordt gedemonstreerd met gebruik van bladweefsel van Arabidopsis.

Arabidopsis zijn kleine bloemplanten uit de Brassicaceae-familie en zijn verwant aan kool. Begin deze procedure door de houders van de weefselhomogeniseerbuizen ten minste 10 minuten voor te koelen in vloeibare stikstof. Haal de monsters uit de vloeibare stikstof en plaats ze in de buishouders.

Verwijder vervolgens de buishouders uit de vloeibare stikstof. Plaats de buishouders snel in de weefselhomogenisator en stel de homogenisator zo in dat het biologische materiaal tot een fijn en homogeen poeder wordt vermalen. Gebruik voor bladeren 20 hertz gedurende één minuut.

De homogenisatietijd en -snelheid kunnen variëren afhankelijk van het weefsel. Zorg ervoor dat u homogeniseert totdat het resulterende monster een zeer fijn poeder is. Daarnaast moet het monster bij elke stap van de homogenisatie bevroren worden gehouden.

Homogeniseer de monsters en verwijder vervolgens de biologische monsters uit de buishouders. Indien deze niet direct worden gebruikt, kunnen ze in een vriezer op -80 °C worden bewaard tot de verdere extractie. Label vier ronde-bodem safe-lock microcentrifugebuisjes van 2 mL met het monsternummer.

Koel de buisjes en enkele spatels voor door ze onder te dompelen in vloeibare stikstof. Zodra de buisjes en spatels afgekoeld zijn, plaatst u een van de buisjes op een analytische balans en gebruikt u een spatel om 25 milligram weefselpoeder in het microcentrifugebuisje af te wegen. Noteer het exacte gewicht voor elk monster en plaats de afgewogen monsters vervolgens onmiddellijk in vloeibare stikstof.

Voer deze stap snel uit om te voorkomen dat het plantmateriaal ontdooit. Bewaar de aliquoterde monsters bij -80 °C tot aan de verdere extractie. Ter voorbereiding op de extractie wordt het methyl-tert-butylether, of MTBE-methanol-extractiemengsel, dat is bereid zoals beschreven in het bijbehorende document, voorgekoeld in een vriezer van -20 °C.

Haal de aliquote monsters eruit en voeg één milliliter van het vooraf gekoelde extractiemengsel toe aan elke monsterbuis. Voer deze stap snel uit. MTBE heeft een lage viscositeit en kan uit de pipetpunt druppelen.

Meng elk monster onmiddellijk op een vortexmixer totdat het weefsel goed is gehomogeniseerd in het extractiemengsel. Bewaar de buisjes in een rek op de werkbank totdat alle monsters zijn geëxtraheerd. Deze stap is cruciaal.

Hier precipiteren we de eiwitten en inactiveren we hun enzymatische activiteiten. Incubeer alle monsters op een orbitale schudder bij 100 RPM gedurende 45 minuten bij vier graden Celsius. Sonicize de monsters vervolgens gedurende 15 minuten in een ijskoud sonicatiebad.

Voeg vervolgens, om te fractioneren door fasescheiding, 650 µL van een drie-op-één oplossing van water en methanol toe aan elke monsterbuis. Meng daarna door één minuut te vortexen. Centrifugeer de monsters bij een snelheid van 20 000 ×g gedurende vijf minuten bij vier °C.

Hanteer de buisjes na deze stap voorzichtig om vermenging van de twee vloeistoffasen te voorkomen en om te vermijden dat het neergeslagen pellet wordt verstoord. In dit stadium zijn er twee aanvaardbare vloeistoffasen aanwezig met een vast pellet op de bodem van het buisje. De niet-polaire bovenste fase bevat lipiden.

De onderste waterige fase bevat polaire en semi-polaire metabolieten. De pellet bevat eiwitten, zetmeel en de celwand. Breng 500 microliters van het oplosmiddel uit de bovenste lipide-bevattende fase over naar een gelabelde 1,5 milliliter microcentrifugebuis.

Verwijder vervolgens met een 200 µL pipet voorzichtig de resterende lipidefase en gooi deze weg. Draag daarna 400 µL van het oplosmiddel uit de onderste fase over naar een gelabelde 1,5 mL microcentrifugebuis. Draag een extra aliquot van 200 µL over naar een microcentrifugebuis voor verdere analyse, zoals metabolietanalyse op basis van gaschromatografie.

Verwijder en gooi het restant van de waterige fase weg door het overtollige volume af te pipetteren. Voeg vervolgens 500 µL methanol toe om het verkregen eiwit-zetmeel-celwandpellet te wassen en vortex dit gedurende één minuut. Centrifugeer de monsters bij een snelheid van 10 000 ×g gedurende vijf minuten bij vier °C.

Verdampt het oplosmiddel uit de lipidemonsters met een stikstofstroomverdampers om oxidatieve modificaties van de lipiden te voorkomen. De resulterende gedroogde monsters moeten onmiddellijk worden geanalyseerd. Verdampt het oplosmiddel uit de waterige monsters gedurende de nacht in een vacuümconcentrator zonder verhitting.

De gedroogde waterige monsters kunnen gedurende enkele weken bij min 80 graden Celsius worden bewaard vóór de analyse. Resuspendeer de gedroogde lipidefracties in 400 µL van een oplossing van acetonitril en 2-propanol in een verhouding van zeven-op-drie. Overbreng een voldoende hoeveelheid vloeistof naar glazen vials en sluit deze stevig af.

Plaats vervolgens de glazen vials in een gekoelde autosampler bij 4 °C. Injecteer 2 µL per monster en scheid de lipiden op een reversed phase C8-kolom bij 60 °C met behulp van een UPLC-systeem met een stroomsnelheid van 400 µL/min. Gebruik voor de chromatografische scheiding de mobiele fasen zoals beschreven in Tabel 1 van het bijbehorende document.

Verwerf de massaspectra in positieve en negatieve ionisatiemodus met een geschikt MS-instrument dat het massa-bereik tussen een lading-massaverhouding van 150 en 1500 bestrijkt. Resuspendeer de polaire fase in 200 microliters van een oplossing van methanol (UPLC-kwaliteit) en water in een verhouding van één-op-één. Breng voldoende vloeistof over in glazen vials en sluit deze stevig af.

Plaats vervolgens de glazen vials in een gekoelde autosampler op 4 °C. Injecteer 2 µL van elk monster en scheid de metabolieten op een RP C-18 kolom bij 40 °C met behulp van een UPLC-systeem met een stroomsnelheid van 400 µL/min. Gebruik de mobiele fasen voor chromatografische scheiding volgens de parameters die zijn vermeld in Tabel 2 van het bijbehorende document.

Verwrijf volledige scanspectra van de massa in positieve en negatieve ionisatiemodus met behulp van een geschikte massaspectrometer over een massa-ladingverhouding tussen 50 en 1500. Voer ten slotte eiwitextractie, digestie en analyse uit, zoals beschreven in het bijbehorende document. 25 milligrams Arabidopsis-bladweefsel werden geoogst, vermalen en geëxtraheerd voordat ze werden onderworpen aan drie analytische UPLC-MS-platforms.

De polaire en semi-polaire primaire en secundaire metabolieten uit de polaire fase werden geanalyseerd met reversed-phase C-18 UPLC-MS. Base peak chromatogrammen van lipiden, getoond in het bovenste paneel, en semi-polaire metabolieten, getoond in het onderste paneel, werden geanalyseerd in positieve ionisatiemodus. Het cirkeldiagram in de rechterbovenhoek van elk chromatogram toont het aantal geïdentificeerde lipiden en metabolieten toegewezen aan verschillende chemische klassen.

Zo werden er bijvoorbeeld 58 verschillende lipiden toegewezen aan de triacylglycerolgroep, in de bovenste grafiek aangeduid als TAG. Meer hydrofiele metabolieten uit deze fractie, zoals suikers en polaire aminozuren, die geen goede retentie vertonen op het reversed-phase materiaal, kunnen worden geanalyseerd met andere analytische methoden, zoals GCMS of hydrofiele interactie-vloeistofchromatografie. De eiwitten die uit de extractie zijn verkregen, werden in oplossing gedigesteerd en geanalyseerd middels shotgun LCMS.

Het cirkeldiagram in de rechterbovenhoek geeft het aantal geïdentificeerde eiwitten aan dat is toegewezen aan verschillende biologische processen. Zo werden 268 eiwitten toegewezen aan de categorie lokalisatie. Samenvattend kunnen meer dan 200 lipidensoorten, 50 geannoteerde semipolaire metabolieten en enkele duizenden eiwitten routinematig worden geïdentificeerd uit monsters zoals het monster dat in dit voorbeeld is gebruikt.

Bovendien vertoonde de methode een brede toepasbaarheid bij het gebruik van verschillende weefsels, organen en celcultuurmateriaal. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u de meeste essentiële verbindingen uit één enkel monster kunt extraheren en analyseren. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om alle monsters bevroren te houden, het materiaal correct te vermalen en oplosmiddelen en chemicaliën van analytische zuiverheid te gebruiken.

Na deze procedure kunnen alle analytische methoden worden toegepast om de moleculaire samenstelling van de geëxtraheerde monsters te bepalen.