Een eenvoudige gefractieerde extractie methode voor de uitgebreide analyse van metabolieten, lipiden en proteïnen uit een enkele monster

Het algemene doel van deze methode is om alle belangrijke moleculaire entiteiten te herstellen en te analyseren, inclusief polaire en semi-polaire metabolieten, lipiden en eiwitten uit een enkele monster met behulp van een eenvoudige gefractioneerde methyl-tributylether extractie. Over het algemeen vinden wetenschappers het moeilijk om meerdere verbindingsklassen uit een enkele monster te analyseren. Met behulp van de MTBE-extractie die we hier introduceren, kunt u meerdere verbindingsklassen, zoals lipiden, metabolieten en eiwitten, uit een enkele monster extraheren en analyseren.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het robuust alle moleculaire verbindingsklassen uit een kleine hoeveelheid enkele monster aliquot kan extraheren. Deze methode helpt bij het beantwoorden van fundamentele vragen in de systeembiologie, omdat het de experimentele basis biedt voor multiomics-analyse, waardoor fracties worden verkregen die kunnen worden gebruikt voor analyse door proteomics, lipidomics en metabolomics. Het volgende protocol wordt gedemonstreerd met behulp van Arabidopsis-bladweefsel.

Arabidopsis zijn kleine bloeiende planten in de Brassicaceae-familie en zijn verwant aan kool. Begin deze procedure door de buisjeshouders van de weefselhomogenisator in vloeibare stikstof gedurende ten minste 10 minuten voor te koelen. Haal de monsters uit de vloeibare stikstof en plaats ze in de buisjeshouders.

Vervolgens verwijdert u de buisjeshouders uit de vloeibare stikstof. Doe de buisjeshouders snel in de weefselhomogenisator en stel de homogenisator in om het biologische materiaal tot een fijn en homogeen poeder te malen. Voor bladeren gebruikt u 20 hertz gedurende één minuut.

De homogenisatietijd en -snelheid kunnen variëren afhankelijk van het weefsel. Zorg ervoor dat u homogeniseert tot het resulterende monster een zeer fijn poeder is. En het monster moet bij elke stap van homogenisatie bevroren worden gehouden.

Homogeniseer de monsters en verwijder vervolgens de biologische monsters uit de buisjeshouders. En als ze niet meteen worden gebruikt, plaatst u ze in een vrieskast van min 80 graden Celsius tot verdere extractie. Label vier twee-milliliter ronde bodem safe-lock microcentrifugebuisjes met het monsternummer.

Koel de buisjes en enkele spatels vooraf door ze onder te dompelen in vloeibare stikstof. Zodra de buisjes en spatels zijn afgekoeld, plaatst u een van de buisjes op een analytische weegschaal en gebruikt u een spatel om 25 milligram weefselpoeder in de microcentrifugebuis te doseren. Noteer het exacte gewicht voor elk monster en plaats de gedoseerde monsters onmiddellijk in vloeibare stikstof.

Voer deze stap snel uit om te voorkomen dat het plantmateriaal ontdooit. Bewaar de gedoseerde monsters bij min 80 graden Celsius tot verdere extractie. Om de extractie voor te bereiden, koelt u de methyl-tert-butylether of MTBE methanol extractiemengsel, bereid zoals beschreven in het begeleidende document, voor in een vrieskast van min 20 graden Celsius.

Haal de gedoseerde monsters eruit en voeg een milliliter van het voorgekoelde extractiemengsel toe aan elke monsterbuis. Voer deze stap snel uit. MTBE heeft een lage viscositeit en kan uit de pipettentip druppelen.

Meng elk monster onmiddellijk op een vortexmixer tot het weefsel goed is gehomogeniseerd in de extractiemengsel. Houd de buisjes in een rek op de werkbank totdat alle monsters zijn geëxtraheerd. Deze stap is cruciaal.

Hier bezinken we eiwitten en inactiveren we hun enzymatische activiteiten. Incubeer alle monsters op een orbitale shaker bij 100 RPM gedurende 45 minuten bij vier graden Celsius. Soniceer vervolgens de monsters gedurende 15 minuten in een ijskoud sonicatiebad.

Vervolgens, om te fractioneren door fasescheiding, voegt u 650 microliter van een drie-tot-een oplossing van water en methanol toe aan elke monsterbuis. Meng vervolgens door schudden gedurende één minuut. Centrifugeer de monsters bij een snelheid van 20.000 keer g gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius.

Na deze stap, gaat u voorzichtig om met de buisjes om vermenging van de twee vloeibare fasen te voorkomen en om verstoring van de bezonken pellet te voorkomen. In dit stadium zijn er twee toelaatbare vloeibare fasen met een vaste pellet op de bodem van de buis. De niet-polaire bovenste fase bevat lipiden.

De onderste waterige fase bevat polaire en semi-polaire metabolieten. De pellet bevat eiwitten, zetmeel en de celwand. Breng 500 microliter van het oplosmiddel van de bovenste lipidenhoudende fase over in een gelabelde 1,5 milliliter microcentrifugebuis.

Vervolgens, met behulp van een 200 microliter pipette, verwijdert u voorzichtig de resterende lipidenfase en gooit u deze weg. Breng vervolgens 400 microliter van het oplosmiddel van de onderste fase over in een gelabelde 1,5 milliliter microcentrifugebuis. Breng een extra aliquot van 200 microliter over naar een micro-fugebuis om verdere analyse uit te voeren, zoals gaschromatografie-gebaseerde metabolietenanalyse.

Verwijder en gooi het resterende deel van de waterige fase weg door het overtollige volume af te pipetten. Voeg vervolgens 500 microliter methanol toe om de verkregen eiwit-zetmeel-celwandpellet te wassen en schud het gedurende één minuut. Centrifugeer de monsters bij een snelheid van 10.000 keer g gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius.

Verdampt het oplosmiddel van de lipidenmonsters met behulp van een stikstofstroom verdamper om oxidatieve modificaties van de lipiden te voorkomen. De resulterende gedroogde monsters moeten onmiddellijk worden geanalyseerd. Verdampt het oplosmiddel van de waterige monsters een nacht in een vacuümconcentrator zonder verwarming.

De gedroogde waterige monsters kunnen enkele weken worden bewaard bij min 80 graden Celsius voor analyse. Breng de gedroogde lipidefracties opnieuw in suspensie in 400 microliter van een oplossing van zeven-tot-drie acetonitril tot 2-propanol. Breng voldoende vloeistof over in glazen flesjes en sluit goed af.

Plaats vervolgens de glazen flesjes in een gekoelde autosampler bij vier graden Celsius. Injecteer twee microliter per monster en scheid de lipiden op een omgekeerde fase C8-kolom gehouden bij 60 graden Celsius met behulp van een UPLC-systeem dat draait met