Extractie en kwantificering van oplosbare, radiogelabelde Inositol Polyfosfaten van verschillende plantensoorten met SAX-HPLC

Het hier aangetoonde protocol kan helpen om de biosynthese van inositolpolyfosfaten van planten te verduidelijken en vragen te beantwoorden over hun rol in bepaalde aspecten van plantenmetabolisme en -ontwikkeling. Deze methode is zeer gevoelig omdat het gebruik van de radioactief gelabelde precursor van inositolfosfaten een betrouwbare detectie van alle inositolfosfaatsoorten in planten mogelijk maakt. Visuele demonstratie van deze methode is belangrijk omdat de meeste plantenbiologen niet bekend zijn met HPLC-analyse en de benodigde setup.

Bovendien zijn kritieke stappen van dit protocol, zoals de extractie van inositolfosfaten, moeilijk te volgen zonder de juiste demonstratie. Begin met het opzetten van een systeem bestaande uit twee onafhankelijke HPLC pompen, een voor buffer A en een voor buffer B.Beide pompen moeten samen worden gecontroleerd via een computer of een master pomp. Voer een zuigerafdichtingswas voor beide pompen, hetzij via gravitatiekracht of via een derde lagedrukpomp.

Sluit beide pompen aan op een dynamische mixer en sluit de mixer vervolgens aan op een injectieklep met een monsterlus met ten minste één millilitercapaciteit. Gebruik haarvaten om de injectieklep aan te sluiten op de kolom en de kolom op de fractiecollector. Zaai lotuszaden in één rij op vierkante petrischaaltjes gevuld met solide groeimedia bestaande uit 0,8% bacteriologische agar in gedeïmiseerd water.

Laat de zaden te stratificeren voor ten minste drie dagen op vier graden Celsius in het donker. Plaats de zaden in een groei incubator. Breng 10 tot 20 zaailingen over in een put van een 12-goed heldere platte bodemcelkweekplaat gevuld met twee milliliter halfsterkte MS-zoutoplossing die wordt aangevuld met 1%sacharose en aangepast aan pH 5.7.

Voeg 45 microcurie 3H myo-inositol toe aan de plaat en draai het voorzichtig. Bedek de plaat met een deksel en verzegel het met microporeuze chirurgische tape. Plaats het dan terug in de groeibroeder.

Na vijf dagen van etikettering, verwijder zaailingen uit de media en was ze kort met gedeïniseerd water. Droog ze met papieren handdoeken en breng ze in een 1,5 milliliter microcentrifuge buis, zorg ervoor dat niet te vullen de buis. Snap bevriezen van de buis in vloeibare stikstof en bewaar het op min 80 graden Celsius tot de winning.

Neem de monsters uit de vriezer en bewaar ze in vloeibare stikstof tot klaar voor gebruik. Maal ze met een microcentrifuge buis stamper totdat ze beginnen te ontdooien, voeg dan 500 microliters van ijskoude extractie buffer. Blijf malen totdat het monster is gehomogeniseerd en de oplossing is gekleurd.

Centrifugeren de monsters gedurende 10 minuten op 18,000 keer G en vier graden Celsius. Breng de supernatant vervolgens over in een verse buis van 1,5 milliliter. De buizen die voor de winning worden gebruikt, worden beschouwd als vast radioactief afval en moeten dienovereenkomstig worden verwijderd.

Voeg voorzichtig 300 microliter neutralisatiebuffer toe aan het extract, wat onmiddellijk neerslag van eiwitten en borrelen zal veroorzaken. Meng het monster na een minuut met een pipetpunt en pipet vijf microliters op pH-papier om er zeker van te zijn dat de pH tussen de zeven en acht ligt. Voeg indien nodig kleine hoeveelheden neutralisatiebuffer of extractiebuffer toe totdat de gewenste pH is bereikt en laat de monsters minstens een uur rusten op ijs met een open deksel.

Dan centrifugeren ze voor 10 minuten en breng de supernatant in een verse 1,5 milliliter buis. Rust de fractiecollector uit met 96 kleine scintillatiefolie flacons en vul elke flacon met twee milliliter van een geschikte scintillatiecocktail die compatibel is met lage pH-buffers en hoge ammoniumfosfaatconcentraties. Start het HPLC-systeem, activeer vervolgens de zuigerafdichting en houd deze gedurende de hele run geactiveerd.

Injecteer het monster handmatig met een geschikte spuit. Start de pompen en de helling. Terwijl de HPLC-run aan de gang is, controleer de druk regelmatig.

De startdruk moet rond de 18 tot 24 bar liggen en moet langzaam stijgen tot 50 tot 60 bar zodra 100% buffer B is bereikt. Na de run sluit u de flesjes stevig en schud de fracties krachtig met de scintillatiecocktail om te mengen. Als u niet rechtstreeks met de meting bezig bent, houdt u de flesjes rechtop in het donker.

Om de breuken te meten, steek de flacons in de scintillatietellerrekken met behulp van rekken die de kleine flesjes passen en meet elke flacon gedurende vijf minuten in een vloeibare scintillatieteller. Bereid een 2D-lijndiagram voor waarin de gemeten tellingen per minuut of CPM worden uitgezet op basis van de bewaartijd. Om monsters met elkaar te vergelijken, normaliseert u de gegevens door de CPM van elke vooreen elbende fractie van minuut 25 tot en met 96 voor elk afzonderlijk monster op te tellen en door de totale CPM van dat monster te delen door de totale CPM van de andere monsters.

Om relatieve kwantificeringen van bepaalde inositolpofosfaatpieken uit te voeren en vervolgens staafgrafieken te maken die gegevens van replicaties voor statistische analyses bevatten, u de analyse voortzetten met een gespecialiseerde software die piekgebieden van chromatogrammen kan berekenen. Een volledig inositol polyfosfaatspectrum verkregen uit A.thaliana extracten na scintillatie tellen wordt hier getoond. De pieken zijn mooi gescheiden en kunnen worden toegewezen aan verschillende isomeren.

Wanneer een verouderde kolom wordt gebruikt, is een duidelijke vermindering van inositol hexakifosfaatfosfaat en de afwezigheid van inositol pyrofosfaat zichtbaar. SAX-HPLC analyse werd ook uitgevoerd op L.japonica zaailingen die werden geteeld en gelabeld onder dezelfde voorwaarden als de Arabidopsis zaailingen. Terwijl vermoedelijk alle inositol polyfosfaat soorten en pieken die bekend zijn van Arabidopsis kan worden gezien, zijn er verschillen in de relatieve hoeveelheden van specifieke inositol polyfosfaat isomeren tussen de twee soorten.

Om aan te tonen dat monsters niet onmiddellijk na de extractie hoeven te worden geanalyseerd, werd één monster in tweeën gesplitst en de helft ervan werd de volgende dag na opslag bij min 80 graden Celsius geanalyseerd. De verschillen tussen SAX-HPLC-profielen van de verse en bevroren monsters waren niet significant, wat aantoont dat één vriesdooicyclus het monster niet schaadt en dat de methode zelf reproduceerbare resultaten genereert. Bij het proberen van dit protocol, altijd malen de monsters grondig, bevroren en met extractie buffer, en streven naar bijna neutrale pH na neutralisatie om een maximale terugwinning van radio-gelabelde inositol fosfaat voor SAX-HPLC analyse te garanderen.

Het is mogelijk om radio-gelabeld van een SAX-HPLC run te zuiveren voor later gebruik, bijvoorbeeld in wederzijdse reacties door het verzamelen van fracties zonder scintillatie cocktails en het meten van slechts kleine aliquots.