Geoptimaliseerd Protocol voor de Extractie van Proteïnen uit de Human Mitral Valve

Het algemene doel van deze procedure is om efficiënt eiwitten te extraheren uit de menselijke mitrale hartklep, geschikt voor proteomische analyse. Deze methode kan potentieel helpen bij het ontsluiten van pathogene mechanismen op het gebied van hartklepziekten, waardoor de identificatie van nieuwe diagnostische en prognostische ziektemarkers en hopelijk therapeutische doelwitten mogelijk wordt. Het belangrijkste voordeel van dit protocol is dat het een efficiënte extractieworkflow biedt die compatibel is met vele analytische toepassingen.

De resultaten bieden een meer uitgebreide karakterisering van het proteoom van de hartmitralisklep. Bovendien kan dit protocol ook worden toegepast op andere systemen, zoals de mitralisklep van varkens, die sterk lijkt op de menselijke klep en wordt gebruikt in experimentele modellen voor evaluaties van de klepfunctie. De experimentele procedure zal worden gedemonstreerd door Stefania Ghilardi, een laborant uit mijn laboratorium.

Om de menselijke mitralisklep voor te bereiden, begint u met een geëxplanteerd hart dat gedurende vier tot 12 uur onder koude ischemie is gehouden. Verwijder het hart in een cleanroom uit de transportzak en plaats het in een gesteriliseerde emmer. Verplaats het hart vervolgens naar een veiligheidskast.

Maak daar met een wegwerpscalpel een loodrechte snede ten opzichte van de hoofdas ter hoogte van de linker- en rechterventrikels, ongeveer vier centimeter vanaf de apex. Plaats het hart vervolgens op een steriel afdekdoek. Schuif daarna de aorta ascendens en de arteria pulmonalis opzij om toegang te krijgen tot het dak van het linkeratrium.

Gebruik op het dak van het linker atrium een pincet en een dissectiepen om rond de linker auricula te snijden om de mitralisklep bloot te leggen. De mitralisklep bevindt zich volledig in de linker ventrikel. Leg daarom de grote mitralisklepflap en de kleine mitralisklepflap bloot.

De anterolaterale en posteromediale commissuren definiëren de grens van het anterieure en posterieure gebied. Dissecteer nu met een schaar en niet-traumatische pincetten het linkeratrium en de wanddikte van de ventrikel rondom de mitralisklep. Identificeer tijdens deze dissectie de continuïteit tussen de mitralis- en aortaklep.

Scheid vervolgens de voorste mitralisklepbewaar van de achterste mitralisklepbewaar door te snijden langs de commissuren die de achterste klepbewaar begrenzen. Wanneer de procedure is voltooid, desinfecteer dan de tafel van de kast met een 70% isopropylalcoholoplossing en een 6% waterstofperoxideoplossing. Was nu de achterste klepbewaar van de mitralisklep in zoutoplossing.

Snijd de klep vervolgens in kleine stukjes, elk kleiner dan een vierkante centimeter. Wikkel de stukjes individueel in aluminiumfolie en vries ze snel in met vloeibare stikstof. Om te beginnen met de eiwitextractie, gebruik dan een pincet om een monster uit de vloeibare stikstof te halen en plaats dit onmiddellijk op droogijs.

Laat het monster niet ontdooien. Plaats vervolgens de vijzel, de bijbehorende stampers en het monster in een Dewar-kolf gevuld met vloeibare stikstof. Het is essentieel dat de vloeibare stikstof wordt gebruikt om het monster te bevriezen en het maalsysteem af te koelen.

Deze stap voorkomt biologische degradatie en maakt efficiënt poederen mogelijk, maar vereist een technische training voor een veilige hantering. Plaats de vijzel en stamper na het flash-freezen in een polystyreen box met droogijs. Plaats daarnaast een spatel op het droogijs.

Verwijder vervolgens het monster uit het folie en plaats het in de vijzel. Positioneer de grotere stamper erboven. Draai de stamper met een schroevendraaier en maal het monster 15 tot 20 keer.

Meng het monster tijdens het malen met de punt van een gekoelde spatel. Herhaal na gebruik van de grote stamper het maalproces met een kleinere stamper. Het verkrijgen van een fijn poeder is essentieel voor een efficiënte eiwitextractie.

Giet nu het gepoederde monster in een centrifugebuis van 15 milliliter met een bekende massa. Borstel vervolgens alle overgebleven materiaal met een koude spatel in de vijzel. Bewaar de buis met het monster op droogijs en bepaal snel de massa van het monster.

Giet vervolgens het monster in een glazen homogenisatiebuis. Voeg daarna 200 µL ureabuffer toe voor elke 10 mg monster. Zorg er hierbij voor dat de residuen in de buis worden teruggewonnen door deze uit te spoelen met de ureabuffer-aliquot.

Homogenise nu het monster met een gemotoriseerde PFTE-stamper bij 1.500 rpm. Druk de stamper langzaam 10 keer met een draaiende beweging op het monster. Breng vervolgens het stroperige gele supernatant met een glaspipet over naar een schone centrifugebuis van 1,7 milliliter.

Herhaal nu de homogenisatie op het resterende monster met de helft van de hoeveelheid ureum. Verzamel het supernatant en voeg dit samen met de vorige collectie. Plaats de buis vervolgens gedurende 30 minuten op een buisrotator.

Laad de buis na 30 minuten in een koude centrifuge en centrifugeer het monster gedurende een half uur bij 13, 000 G. Herstel vervolgens de supernatant en meet de proteïneconcentratie met behulp van de Bradford-proteïneanalyse.

Na het uitvoeren van het voorgeschreven protocol werd het proteïnextract bestudeerd met behulp van verschillende methoden na enkele aanvullende behandelingen. In totaal werden 422 proteïnen in het weefsel van de mitralisklep geïdentificeerd middels tweedimensionale elektroforese, vloeistoffase-isoelektrische focussering, vloeistofchromatografie-massaspectrometrie en 2D vloeistofchromatografie-massaspectrometrie. De 422 proteïnen werden geclassificeerd met behulp van Gene Ontology-analyse.

De extracellulaire regio's bevatten verschillende verwachte eiwitten en andere intracellulaire eiwitten en eiwitten van het celoppervlak. Veel hiervan werden voor het eerst geïdentificeerd in mitraliskleppen. De aanwezigheid van vier van deze eiwitten, die voorheen niet in mitraliskleppen waren geïdentificeerd, werd bevestigd met antilichamen in drie unieke monsters.

De eiwitten zijn Septin-11, Four and a half LIM domains protein one, Dermatoponin en alpha crystalline B. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe u eiwitten uit de mitralisklep van het hart extraheert voor identificatie en kwantificering. Zodra deze methode onder de knie is, kan dit protocol in bijna twee uur worden voltooid indien correct uitgevoerd. Om bij deze procedure de grootste opbrengst aan eiwitten met een hoge eiwitintegriteit te verkrijgen, is het essentieel dat de monsters tijdens geen enkele overdracht ontdooien.