Name: Geoptimaliseerd Protocol voor de Extractie van Proteïnen uit de Human Mitral Valve (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Leer een geoptimaliseerd protocol voor eiwitextractie uit de humane mitralisklep voor proteomische analyse. Deze methode helpt onderzoekers bij het identificeren van nieuwe diagnostische en prognostische markers voor hartklepziekten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Het Italiaanse Ministerie van Volksgezondheid steunde deze studie (RC 2013-BIO 15). We bedanken Barbara Micheli voor haar uitstekende technische bijstand.

In dit protocol worden de menselijke harten verzameld tijdens multi-organische explantatie (koude ischemietijd van 4-12 uur, gemiddeld 6 ± 2 uur) van multi-orgaandonoren die om technische of functionele redenen uitgesloten zijn van orgaantransplantatie, ondanks normale echocardiografische parameters. Ze worden gestuurd naar de Cardiovasculaire Weefselbank van Milaan, het Cardiologisch Centrum van Monzino (Milaan, Italië) voor het bankieren van de aorta- en longventielen. De mitrale posterior folders worden niet voor klinische doeleinden gebruikt, dus ze worden verzameld tijdens de aorta- en pulmonale klepisolatie nadat de toestemming van de donors verworven is. Het weefsel voor transplantatie en onderzoek wordt alleen verzameld na toestemming van de ouders; Op het toestemmingsblad machtigen ze (of niet) het gebruik van het hartweefsel voor onderzoek alleen als het niet geschikt is voor menselijk klinisch gebruik ( dwz microbiologische, functionele en serologische problemen), volgens de richtlijnen van de ethische commissie vanMonzino Cardiologic Center. 1. Mitralklepbereiding <ol><li> Oog de menselijke mitrale klep zo snel mogelijk na organische explantatie (koude ischemietijd van 4-12 uur). </li><li> Verwijder in een schone kamer het hart uit de transporttas met een koude (4 ° C) oplossing ( bijv. Zoutoplossing of evenwichtig medium Eurocollins of Wisconsin). Zet het in een emmer en plaats het in een biosafety-kast (biohazard verticale luchtstroom, klasse A, Good Manufacturing Practices (GMP) classificatie) om verder te gaan met de klepbereiding. </li><li> Plaats het hart op een steriele wegwerpdoek in de kast. Snijd het hart volledig, loodrecht op de hoofdas, op het niveau van de linker en rechter ventrikels, ongeveer 4 cm van de top, met behulp van een steriele wegwerpschaalpel. </li><li> Beweeg de oplopende aorta en longslagader om het linker atriale dak weer te geven. </li><li> Met steriele autoclavable tang en picks, snijd de linker auricle op deLinker atriumdak, waardoor de mitralklep zichtbaar is en het mogelijk maakt de grote mitrale leaflet (anterior) en de kleine mitrale leaflet (posterior) te identificeren. OPMERKING: Antero-laterale en de achterste mediale commissies definiëren de grens van de voorste folder en het achterste gedeelte. </li><li> Ontleed het linkeratrium en de ventrikelwanddikte rond de omtrek van de hele mitrale klep met behulp van steriele autoclaverbare scharen en niet-traumatische tang . </li><li> Identificeer de continuïteit van de mitro-aorta klep. OPMERKING: De linker ventrikel bevat de hele mitrale klep en akkoorden. </li><li> Scheep de anterior mitralklepje uit de posterior mitralklepje, snijd de posterior folder langs de insteek met de ventrikel (commissuur). </li><li> Was de posterior folder in de zoutoplossing. Knip de folder in kleine stukken (&lt;1 cm 2 ) en plak ze individueel in aluminiumfolie. Bevroren ze met vloeibare stikstof. Let op: Volg de veiligheidswerkzaamheden bij het gebruik van vloeibaar stikstof. <ol><li> Maak de tafel van de kast schoon met een 70% isopropylalcoholoplossing en 6% waterstofperoxideoplossing aan het einde van de procedure. </li></ol></li></ol> 2. Proteïne extractie <ol><li> Gebruik pincet om het monster op te slaan die in vloeibare stikstof is opgeslagen en plaats het op droogijs onmiddellijk terwijl het nog in de aluminiumfolie wordt verpakt. Laat het monster niet ontdooien tijdens overdrachten. </li><li> Voor het slijpen, koud de porselein / zirkonium mortel en stamper van een grindersysteem ( bijv. CryoGrinder), samen met het monster, door ze in een Dewar-fles met vloeibare stikstof (~ 500 ml) te plaatsen. Let op: Volg de veiligheidswerkzaamheden bij het gebruik van vloeibaar stikstof. </li><li> Zet de mortel en de stamper in een polystyreen doos met droogijs. Verwijder het monster uit de aluminiumfolie en steek het in de mortel. </li><li> Grind tHij proeft met de grote stamper tegen de mortel 15-20 keer, met behulp van de schroevendraaier om de stamper te draaien. Meng het monster tijdens het slijpproces met de punt van een voorgekoelde spatel. <ol><li> Herhaal met de kleine stamper. </li></ol></li><li> Breng het grondmonster over op een eerder gewogen buis ( bv. 15 ml centrifugebuis) door de buis om te zetten, plaats het over de mortel en draai ze om elkaar om het monster naar de buis te verplaatsen. Gebruik een voorgekoelde spatel om het materiaal van de mortel te herstellen. <ol><li> Houd de buis met het monster op droog ijs om te voorkomen dat het ontdooien tijdens de overdracht. </li></ol></li><li> Bereken het netto gewicht van het monster. </li><li> Reinig de mortel en de stamper na elk monster en ontreinig ze door autoclaven of verwarm ze bij 200 ° C gedurende 2 uur. </li><li> Breng het poedervormige monster uit de centrifugebuis door de inversie naar de glazen buis van een homogenisator. </li><li> Voeg gefilterde ureumbuffet toeR (8 M ureum, 2 M thiourea, 4% w / v CHAPS, 20 mM Tris en 55 mM dithiotreitol) aan de glazen buis, 200 μl ureumbuffer voor elke 10 mg poederstof. OPMERKING: Residueel poedermonster dat in de centrifugebuis achterblijft, kan worden hersteld met behulp van een deel van het berekende volume ureumbuffer. </li><li> Homogeniseer het monster met behulp van een roerder uitgerust met een borosilicaatglasmortel en een polytetrafluorethyleen (PTFE) stamper. Druk langzaam de stamper op het monster met een draaiende beweging (1500 rpm) 10 keer. </li><li> Herstel de supernatant en verplaats deze naar een schone 1,7 ml centrifugebuis. Trek het resterende monster opnieuw uit met verse ureumbuffer en voeg de helft toe van het volume dat tijdens de eerste extractie werd gebruikt. </li><li> Herhaal stap 2.10. </li><li> Herstel de supernatant en combineer deze met de supernatant uit stap 2.11. Plaats de gecombineerde supernatant gedurende 30 minuten op een buisrotator. </li><li> Centrifugeer de buis gedurende 30 minuten bij 13.000 xg en 4 ° C. </li><li> Herstel de supernatant anD de eiwitconcentratie meten volgens de Bradford-eiwitmeting, volgens de instructies van de fabrikant. Bewaar het monster bij -80 ° C tot aan het gebruik. </li></ol>

<ol><li>Vogel, C., Marcotte, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+regulation+of+protein+abundance+from+proteomic+and+transcriptomic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses.</a> Nat Rev Genet. 13 (4), 227-232 (2012).</li>
<li>de Sousa Abreu, R., Penalva, L. O., Marcotte, E. M., Vogel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+signatures+of+protein+and+mRNA+expression+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biosyst%22%5BJournal%5D)">Global signatures of protein and mRNA expression levels.</a> Mol Biosyst. 5 (12), 1512-1526 (2009).</li>
<li>Hanash, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12634796">Disease proteomics.</a> Nature. 422 (6928), 226-232 (2003).</li>
<li>Ahram, M., Petricoin, E. F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19578516">Proteomics Discovery of Disease Biomarkers.</a> Biomark Insights. 3, 325-333 (2008).</li>
<li>Chandramouli, K., Qian, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics%3A+challenges%2C+techniques+and+possibilities+to+overcome+biological+sample+complexity%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Genomics+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomics: challenges, techniques and possibilities to overcome biological sample complexity.</a> Hum Genomics Proteomics. 2009, (2009).</li>
<li>Singleton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+bioanalytical+sample+preparation+for+LC-MS+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Bioanalysis%22%5BJournal%5D)">Recent advances in bioanalytical sample preparation for LC-MS analysis.</a> Bioanalysis. 4 (9), 1123-1140 (2012).</li>
<li>Williams, T. H., Jew, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+the+mitral+valve+passive+flap+theory+overstated%3F+An+active+valve+is+hypothesized%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Hypotheses%22%5BJournal%5D)">Is the mitral valve passive flap theory overstated? An active valve is hypothesized.</a> Med Hypotheses. 62 (4), 605-611 (2004).</li>
<li>Rabkin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+interstitial+myofibroblasts+express+catabolic+enzymes+and+mediate+matrix+remodeling+in+myxomatous+heart+valves%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Activated interstitial myofibroblasts express catabolic enzymes and mediate matrix remodeling in myxomatous heart valves.</a> Circulation. 104 (21), 2525-2532 (2001).</li>
<li>Martins Cde, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+mitral+valve+proteomic+profiles+in+rheumatic+heart+disease+and+myxomatous+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Med+Insights+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Distinct mitral valve proteomic profiles in rheumatic heart disease and myxomatous degeneration.</a> Clin Med Insights Cardiol. 8, 79-86 (2014).</li>
<li>Tan, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unravelling+the+proteome+of+degenerative+human+mitral+valves%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Unravelling the proteome of degenerative human mitral valves.</a> Proteomics. 15 (17), 2934-2944 (2015).</li>
<li>Banfi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome+of+platelets+in+patients+with+coronary+artery+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Proteome of platelets in patients with coronary artery disease.</a> Exp Hematol. 38 (5), 341-350 (2010).</li>
<li>Banfi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+human+low-density+lipoprotein+reveals+the+presence+of+prenylcysteine+lyase%2C+a+hydrogen+peroxide-generating+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of human low-density lipoprotein reveals the presence of prenylcysteine lyase, a hydrogen peroxide-generating enzyme.</a> Proteomics. 9 (5), 1344-1352 (2009).</li>
<li>Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+measurement+with+the+Folin+phenol+reagent%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Protein measurement with the Folin phenol reagent.</a> J Biol Chem. 193 (1), 265-275 (1951).</li>
<li>Banfi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Very+low+density+lipoprotein-mediated+signal+transduction+and+plasminogen+activator+inhibitor+type+1+in+cultured+HepG2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Very low density lipoprotein-mediated signal transduction and plasminogen activator inhibitor type 1 in cultured HepG2 cells.</a> Circ Res. 85 (2), 208-217 (1999).</li>
<li>Brioschi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+human+mitral+valve+proteome%3A+A+preliminary+investigation+by+gel-based+and+gel-free+proteomic+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Normal human mitral valve proteome: A preliminary investigation by gel-based and gel-free proteomic approaches.</a> Electrophoresis. 37 (20), 2633-2643 (2016).</li>
<li>Brioschi, M., Lento, S., Tremoli, E., Banfi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+endothelial+cell+secretome%3A+a+means+of+studying+the+pleiotropic+effects+of+Hmg-CoA+reductase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of endothelial cell secretome: a means of studying the pleiotropic effects of Hmg-CoA reductase inhibitors.</a> J Proteomics. 78, 346-361 (2013).</li>
<li>Sun, S., Zhou, J. Y., Yang, W., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+protein+carbamylation+in+urea+solution+using+ammonium-containing+buffers%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Inhibition of protein carbamylation in urea solution using ammonium-containing buffers.</a> Anal Biochem. 446, 76-81 (2014).</li>
<li>Rabilloud, T., Adessi, C., Giraudel, A., Lunardi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+the+solubilization+of+proteins+in+two-dimensional+electrophoresis+with+immobilized+pH+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Improvement of the solubilization of proteins in two-dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients.</a> Electrophoresis. 18 (3-4), 307-316 (1997).</li>
<li>Santoni, V., Molloy, M., Rabilloud, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+proteins+and+proteomics%3A+un+amour+impossible%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Membrane proteins and proteomics: un amour impossible?</a> Electrophoresis. 21 (6), 1054-1070 (2000).</li>
<li>Shechter, D., Dormann, H. L., Allis, C. D., Hake, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction%2C+purification+and+analysis+of+histones%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Extraction, purification and analysis of histones.</a> Nat Protoc. 2 (6), 1445-1457 (2007).</li>
<li>Fujiki, Y., Hubbard, A. L., Fowler, S., Lazarow, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+intracellular+membranes+by+means+of+sodium+carbonate+treatment%3A+application+to+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of intracellular membranes by means of sodium carbonate treatment: application to endoplasmic reticulum.</a> J Cell Biol. 93 (1), 97-102 (1982).</li>
<li>Gorg, A., Weiss, W., Dunn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+two-dimensional+electrophoresis+technology+for+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics.</a> Proteomics. 4 (12), 3665-3685 (2004).</li>
<li>Mann, M., Kelleher, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+proteomics%3A+the+case+for+high+resolution+and+high+mass+accuracy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Precision proteomics: the case for high resolution and high mass accuracy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18132-18138 (2008).</li>
<li>Thakur, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+and+highly+sensitive+proteome+coverage+by+LC-MS%2FMS+without+prefractionation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Deep and highly sensitive proteome coverage by LC-MS/MS without prefractionation.</a> Mol Cell Proteomics. 10 (8), M110.003699(2011).</li>
<li>Loardi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+mitral+valve+prolapse%3A+the+harvest+is+big%2C+but+the+workers+are+few%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Biology of mitral valve prolapse: the harvest is big, but the workers are few.</a> Int J Cardiol. 151 (2), 129-135 (2011).</li>
<li>Schoen, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolving+concepts+of+cardiac+valve+dynamics%3A+the+continuum+of+development%2C+functional+structure%2C+pathobiology%2C+and+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Evolving concepts of cardiac valve dynamics: the continuum of development, functional structure, pathobiology, and tissue engineering.</a> Circulation. 118 (18), 1864-1880 (2008).</li>
<li>Lelovas, P. P., Kostomitsopoulos, N. G., Xanthos, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+anatomic+and+physiologic+overview+of+the+porcine+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Assoc+Lab+Anim+Sci%22%5BJournal%5D)">A comparative anatomic and physiologic overview of the porcine heart.</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 53 (5), 432-438 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Een kritische stap van dit protocol is het gebruik van vloeibare stikstof om het monster te bevriezen en het grindersysteem te chillen. Het gebruik van vloeibare stikstof voorkomt biologische afbraak en zorgt voor efficiënte poedering, maar vereist specifieke training voor veilige hantering. In dit protocol is een grindersysteem aanwezig voor het slijpen van monsters, omdat kleine monsters moeilijk te herstellen zijn van standaard mortel en stamper. In dit geval verspreiden kleine monsters a...

Recent bewijsmateriaal heeft het begrip van de rollen van de vele regulerende mechanismen die na mRNA synthese optreden veranderd. Inderdaad kunnen translatie-, post-transcriptie- en proteolytische processen het eiwit overvloed en functie regelen. Het dogma - dat zegt dat mRNA concentraties proxies zijn aan die van de bijbehorende eiwitten, in het veronderstellen dat transcriptieniveaus de belangrijkste determinant van eiwit overvloed zijn - is gedeeltelijk herzien. In het begin voorspellen transcriptieniveaus slechts gedeeltelijk eiwit overvloed, wat suggereert dat posttranscriptiegebeurtenissen Voorkomen dat de eiwitten in cellen 1 , 2 gereguleerd worden . Bovendien dicteert eiwitten uiteindelijk de functie van de cel en dicteert daarom zijn fenotype, dat dynamische veranderingen kan ondergaan in reactie op autocrine, paracriene en endocriene factoren; Bloedgedragen bemiddelaars; temperatuur; behandeling met geneesmiddelen; En ziekte ontwikkelenment. Zo is een expressieanalyse gericht op het eiwitgehalte bruikbaar om het proteome te karakteriseren en de kritische veranderingen die erin voorkomen, te ontrafelen als onderdeel van ziektepatogenese 3 . Daarom zijn de mogelijkheden die proteomics presenteren om de gezondheids- en ziekteomstandigheden te verduidelijken, ondanks de huidige technologische uitdagingen formidabel. De bijzonder veelbelovende onderzoeksgebieden waaraan proteomics kunnen bijdragen, omvat: het identificeren van gewijzigde eiwituitdrukking op elk niveau ( dwz hele cellen of weefsel, subcellulaire compartimenten en biologische vloeistoffen); De identificatie, verificatie en validatie van nieuwe biomarkers die nuttig zijn voor de diagnose en prognose van de ziekte; En hopelijk de identificatie van nieuwe eiwitdoelstellingen die ter therapeutische doeleinden kunnen worden gebruikt, alsmede voor de beoordeling van de werkzaamheid en toxiciteit van geneesmiddelen 4 . Het vastleggen van de complexiteit vanHet proteome vertegenwoordigt een technologische uitdaging. De huidige proteomische instrumenten bieden de mogelijkheid om op grote schaal analyses uit te voeren voor de identificatie, kwantificering en validatie van gewijzigde eiwitniveaus. Daarnaast heeft de introductie van fractionerings- en verrijkingstechnieken, die gericht zijn op het vermijden van de interferentie veroorzaakt door de meest overvloedige eiwitten, ook verbeterde eiwitidentificatie door de minste overvloedige eiwitten te omvatten. Tenslotte is proteomics aangevuld met de analyse van post-translational modificaties, die zich als belangrijke modulatoren van eiwitfunctie voordoen. De monstervoorbereiding en het eiwitherstel in de biologische monsters onder analyse blijven echter de beperkende stappen in de proteomische workflow en vergroten het potentieel voor mogelijke valkuilen 5 . Inderdaad, in de meeste moleculaire biologie technieken die moeten worden geoptimaliseerd, zijn de eerste stappen tissue homogenizatIon- en cellysis, in het bijzonder tijdens de analyse van eiwitten met weinig overvloed waarvoor geen amplificatiemethoden bestaan. Bovendien kan de chemische aard van eiwitten hun eigen herstel beïnvloeden. Bijvoorbeeld, de analyse van zeer hydrofobe eiwitten is zeer uitdagend omdat ze gemakkelijk neerslaan tijdens isoelectrische focus, terwijl transmembraan eiwitten bijna onoplosbaar zijn (in Referentie 5 onderzocht). Bovendien vormt de variatie van de weefselsamenstelling een belangrijke barrière voor het ontwikkelen van een universele extractiemethode. Ten slotte, omdat bijna alle klinische exemplaren van beperkte hoeveelheid zijn, is het essentieel om eiwitbereiding mogelijk te maken met maximaal herstel en reproduceerbaarheid van minimale monsterhoeveelheden 6 . Dit werk beschrijft een geoptimaliseerd protocol voor extractie van eiwitten uit de normale menselijke hart mitralisklep, die een zeer uitdagend monster voor proteomische analyse vertegenwoordigt. De normale mitrale klep is een compLex structuur tussen het linker atrium en de linker hartslag van het hart ( figuur 1 ). Het speelt een belangrijke rol in de controle van de bloedstroom van het atrium naar de ventrikel, het voorkomen van terugstroom en het verzekeren van de juiste zuurstofvoorziening aan het hele lichaam, waardoor een adequate hartuitgang wordt behouden. Het wordt echter vaak beschouwd als een &quot;inactief&quot; weefsel, met een lage cellulariteit en weinig componenten, voornamelijk in de extracellulaire matrix. Dit komt doordat de inwendige valvulaire interstitiële cellen (VIC&#39;s) onder normale omstandigheden een stil fenotype met een biosynthese van lage proteïnen 7 voordoen. Er is echter aangetoond dat in een pathologische toestand het aantal VICs in de spongiosa toeneemt en hun proteïnesynthese geactiveerd wordt, samen met andere functionele en fenotypische veranderingen 8 . Daarom is het niet verwonderlijk dat de minimale gegevens die beschikbaar zijn inDe literatuur richt zich op de analyse van pathologische mitrale kleppen 9 , 10 , waarin het verhoogde aantal geactiveerde VIC&#39;s het relatief hoge aantal geïdentificeerde eiwitten kan verklaren. Ten slotte kan het onderhavige protocol dienen om het begrip van de pathogene mechanismen die verantwoordelijk zijn voor mitrale klepziekten te ontwikkelen door middel van het bestuderen van mitrale klep eiwit componenten. Inderdaad, een beter begrip van de onderliggende pathologische processen kan bijdragen tot het verbeteren van het klinisch beheer van klepziekten, waarvan de huidige indicaties voor interventie grotendeels op hemodynamische overwegingen zijn gebaseerd.

<table><tbody><tr><td>Saline oplossing</td><td></td><td></td><td>0,9 % NaCl</td></tr><tr><td>Eurocollins A</td><td>SALF</td><td>30874046</td><td>Gebalanseerd transportmedium voor organen. Combineer 400 ml Eurocollins A met 100 ml Eurocollins B om gebalanceerd Eurocollins-medium te verkrijgen</td></tr><tr><td>Eurocollins B</td><td>SALF</td><td>30874022</td><td>Gebalanseerd transportmedium voor organen. Combineer 400 ml Eurocollins A met 100 ml Eurocollins B om gebalanceerd Eurocollins-medium te verkrijgen</td></tr><tr><td>Wisconsin</td><td>Bridge life</td><td>RM/N 4081</td><td>Gebalanseerd transportmedium voor organen</td></tr><tr><td>Biohazard vertical flow air</td><td>Burdinola</td><td></td><td>Class A GMP-classificatie</td></tr><tr><td>Dewar Flask</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nalgene 4150-1000</td><td></td></tr><tr><td>Cryogrinder systeem</td><td>OPS diagnostics</td><td>CG 08-01</td><td>Grindersysteem met mortels, stampers en schroevendraaier</td></tr><tr><td>Roestvrijstalen pincetten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roestvrijstalen spatel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wegwerp steriele scalpel</td><td>Medisafe</td><td>MS-10</td><td></td></tr><tr><td>Roestvrijstalen schaar</td><td></td><td></td><td>Autoclaveerbaar</td></tr><tr><td>Roestvrijstalen punten</td><td></td><td></td><td>Autoclaveerbaar</td></tr><tr><td>Wegwerp steriele drap</td><td>Mon&amp;Tex</td><td>3.307.08</td><td></td></tr><tr><td>Steriliserende oplossing met isopropylalcohol</td><td></td><td></td><td>70% isopropylalcohol</td></tr><tr><td>Steriliserende oplossing met waterstofperoxide</td><td></td><td></td><td>6% waterstofperoxide</td></tr><tr><td>Micropipet, 1 ml, met tips</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml centrifugebuizen</td><td>VWR international</td><td>9278</td><td></td></tr><tr><td>1,7 ml centrifugebuizen</td><td>VWR international</td><td>PIER90410</td><td></td></tr><tr><td>Urea buffer</td><td></td><td></td><td>8 M ureum, 2 M thioureum, 4 % w/v CHAPS, 20 mM Trizma, 55 mM Dithiotreitol</td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma aldrich</td><td>U6504-1KG</td><td>Te gebruiken voor Urea buffer</td></tr><tr><td>Thioureum</td><td>Sigma aldrich</td><td>T8656</td><td>Te gebruiken voor Urea buffer</td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Sigma aldrich</td><td>C3023-5GR</td><td>Te gebruiken voor Urea buffer</td></tr><tr><td>Dithiotreitol</td><td>Sigma aldrich</td><td>D0632-5G</td><td>Te gebruiken voor Urea buffer</td></tr><tr><td>Spuit 50 ml</td><td>PIC</td><td></td><td>Te gebruiken voor het filteren van Urea buffer</td></tr><tr><td>0,22 μm filter</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RB</td><td>Te gebruiken voor het filteren van Urea buffer</td></tr><tr><td>PFTE stamper, 2 ml</td><td>Kartell</td><td>6302</td><td>Onderdeel van Potter-Elvehjem homogenisator</td></tr><tr><td>Glas mortel met borosilicaat</td><td>Kartell</td><td>6102</td><td>Onderdeel van Potter-Elvehjem homogenisator</td></tr><tr><td>Roerder</td><td>VELP scientifica</td><td>Roerder DLH</td><td>Te gebruiken voor homogenisatie door Potter-Elvehjem</td></tr><tr><td>Bradford-eiwitbepaling</td><td>Bio-Rad laboratories</td><td>5000006</td><td></td></tr><tr><td>Buisrotator</td><td>Pbi International</td><td>F205</td><td></td></tr><tr><td>Vloeibare stikstof</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aluminiumfolie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IJs</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polystyreen doos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Droogig</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td></td><td></td><td>Voor centrifugatie van 1,7 ml centrifugebuizen bij 13.000 x g</td></tr><tr><td>Freezer -80&deg;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Precisiebalans</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Autoclaaf</td><td></td><td></td><td>Voor sterilisatie</td></tr><tr><td>Cryogene handschoenen voor vloeibare stikstof</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Handschoenen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Professionele geforceerde ventilatie en natuurlijke luchtconvectie-oven</td><td></td><td></td><td>Voor sterilisatie</td></tr><tr><td>Protease-remmercocktail</td><td>Sigma aldrich</td><td>P8340-5ML</td><td>100X-oplossing</td></tr><tr><td>ProteoExtract Protein Precipitation Kit</td><td>Calbiochem</td><td>539180</td><td></td></tr><tr><td>RapiGest</td><td>Waters</td><td>186001861</td><td></td></tr><tr><td>Cytoscape</td><td>www.cytoscape.org</td><td>versie 2.7</td><td>Softwareplatform voor Gene Ontology-analyse</td></tr><tr><td>BiNGO</td><td>http://apps.cytoscape.org/apps/bingo</td><td>versie 3.0.3</td><td>Plugin voor Gene-ontologieanalyse</td></tr><tr><td>AlphaB Crystallin/CRYAB Antilichaam</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP1-97494</td><td>Muis monoklonaal antilichaam tegen CryAB</td></tr><tr><td>Septin-11 Antilichaam</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP1-83824</td><td>Konijn polyklonaal antilichaam tegen septin-11</td></tr><tr><td>FHL1 Antilichaam</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP-188745</td><td>Konijn polyklonaal antilichaam tegen FHL-1</td></tr><tr><td>Dermatopontin Antilichaam</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB110-68135</td><td>Konijn polyklonaal antilichaam tegen dermatopontin</td></tr><tr><td>Geit Anti-muis IgG HRP</td><td>Sigma aldrich</td><td>A4416-0.5ML</td><td>Secundair antilichaam voor immunoblotting</td></tr><tr><td>Geit Anti-konijn IgG HRP</td><td>Bio-Rad laboratories</td><td>170-5046</td><td>Secundair antilichaam voor immunoblotting</td></tr></tbody></table>

geoptimaliseerd protocol voor de extractie van proteïnen uit de human mitral valve

Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve

Analyse van het cellulaire proteome kan bijdragen tot het verhelderen van de moleculaire mechanismen die aanliggende ziekten zijn door de ontwikkeling van technologieën die de grootschalige identificatie en kwantificering van de eiwitten in complexe biologische systemen mogelijk maken. De kennis die wordt verkregen uit een proteomische benadering kan mogelijk leiden tot een Beter inzicht hebben in de pathogene mechanismen die onderliggende ziekten liggen, waardoor de diagnose van nieuwe diagnostische en prognostische ziekte markers mogelijk wordt gemaakt, en hopelijk van therapeutische doelen. Echter, de cardiale mitrale klep vertegenwoordigt een zeer uitdagend monster voor proteomische analyse vanwege de lage cellulariteit in proteoglycan en collageenverrijkte extracellulaire matrix. Dit maakt het uitdagend om eiwitten te extraheren voor een globale proteomische analyse. Dit werk beschrijft een protocol dat compatibel is met latere eiwitanalyse, zoals kwantitatieve proteomics en immunoblotting. Dit kan voor de correlatie van gegevens zorgenG eiwit expressie met gegevens over kwantitatieve mRNA expressie en niet-kwantitatieve immunohistochemische analyse. Inderdaad zullen deze benaderingen leiden tot een uitgebreider begrip van de moleculaire mechanismen die onderliggende ziekten liggen, van mRNA tot post-translatie eiwitmodificatie. Zo kan deze methode relevant zijn voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in de studie van hartklep-fysiopathologie.

De extractie en ontbinding van eiwitten in de ureumbuffer is direct verenigbaar met proteomische methoden op basis van isoelectrofocusing (tweedimensionale elektroforese (2-DE) 11 en vloeibare fase isoelektrische focusing (IEF) 12 ) en met immunoblotting na verdunning in Laemmli buffer 13 Bevattende een proteaseremmerscocktail 14 . ...

De eiwitsamenstelling van de menselijke mitrale klep is nog steeds gedeeltelijk onbekend, omdat de analyse ervan gecompliceerd is door lage cellulariteit en derhalve door biosynthese met een lage eiwit. Dit werk biedt een protocol om eiwit efficiënt te extraheren voor de analyse van het mitrale klep proteome.

Geoptimaliseerd Protocol voor de Extractie van Proteïnen uit de Human Mitral Valve

Analysis of the cellular proteome can help to elucidate the molecular mechanisms underlying diseases due to the development of technologies that permit ...

Het algemene doel van deze procedure is om efficiënt eiwitten te extraheren uit de menselijke mitrale hartklep, geschikt voor proteomische analyse. Deze methode kan potentieel helpen bij het ontsluiten van pathogene mechanismen op het gebied van hartklepziekten, waardoor de identificatie van nieuwe diagnostische en prognostische ziektemarkers en hopelijk therapeutische doelwitten mogelijk wordt. Het belangrijkste voordeel van dit protocol is dat het een efficiënte extractieworkflow biedt die compatibel is met vele analytische toepassingen.De resultaten bieden een meer uitgebreide karakterisering van het proteoom van de hartmitralisklep. Bovendien kan dit protocol ook worden toegepast op andere systemen, zoals de mitralisklep van varkens, die sterk lijkt op de menselijke klep en wordt gebruikt in experimentele modellen voor evaluaties van de klepfunctie. De experimentele procedure zal worden gedemonstreerd door Stefania Ghilardi, een laborant uit mijn laboratorium.Om de menselijke mitralisklep voor te bereiden, begint u met een geëxplanteerd hart dat gedurende vier tot 12 uur onder koude ischemie is gehouden. Verwijder het hart in een cleanroom uit de transportzak en plaats het in een gesteriliseerde emmer. Verplaats het hart vervolgens naar een veiligheidskast.Maak daar met een wegwerpscalpel een loodrechte snede ten opzichte van de hoofdas ter hoogte van de linker- en rechterventrikels, ongeveer vier centimeter vanaf de apex. Plaats het hart vervolgens op een steriel afdekdoek. Schuif daarna de aorta ascendens en de arteria pulmonalis opzij om toegang te krijgen tot het dak van het linkeratrium.Gebruik op het dak van het linker atrium een pincet en een dissectiepen om rond de linker auricula te snijden om de mitralisklep bloot te leggen. De mitralisklep bevindt zich volledig in de linker ventrikel. Leg daarom de grote mitralisklepflap en de kleine mitralisklepflap bloot.De anterolaterale en posteromediale commissuren definiëren de grens van het anterieure en posterieure gebied. Dissecteer nu met een schaar en niet-traumatische pincetten het linkeratrium en de wanddikte van de ventrikel rondom de mitralisklep. Identificeer tijdens deze dissectie de continuïteit tussen de mitralis- en aortaklep.Scheid vervolgens de voorste mitralisklepbewaar van de achterste mitralisklepbewaar door te snijden langs de commissuren die de achterste klepbewaar begrenzen. Wanneer de procedure is voltooid, desinfecteer dan de tafel van de kast met een 70% isopropylalcoholoplossing en een 6% waterstofperoxideoplossing. Was nu de achterste klepbewaar van de mitralisklep in zoutoplossing.Snijd de klep vervolgens in kleine stukjes, elk kleiner dan een vierkante centimeter. Wikkel de stukjes individueel in aluminiumfolie en vries ze snel in met vloeibare stikstof. Om te beginnen met de eiwitextractie, gebruik dan een pincet om een monster uit de vloeibare stikstof te halen en plaats dit onmiddellijk op droogijs.Laat het monster niet ontdooien. Plaats vervolgens de vijzel, de bijbehorende stampers en het monster in een Dewar-kolf gevuld met vloeibare stikstof. Het is essentieel dat de vloeibare stikstof wordt gebruikt om het monster te bevriezen en het maalsysteem af te koelen.Deze stap voorkomt biologische degradatie en maakt efficiënt poederen mogelijk, maar vereist een technische training voor een veilige hantering. Plaats de vijzel en stamper na het flash-freezen in een polystyreen box met droogijs. Plaats daarnaast een spatel op het droogijs.Verwijder vervolgens het monster uit het folie en plaats het in de vijzel. Positioneer de grotere stamper erboven. Draai de stamper met een schroevendraaier en maal het monster 15 tot 20 keer.Meng het monster tijdens het malen met de punt van een gekoelde spatel. Herhaal na gebruik van de grote stamper het maalproces met een kleinere stamper. Het verkrijgen van een fijn poeder is essentieel voor een efficiënte eiwitextractie.Giet nu het gepoederde monster in een centrifugebuis van 15 milliliter met een bekende massa. Borstel vervolgens alle overgebleven materiaal met een koude spatel in de vijzel. Bewaar de buis met het monster op droogijs en bepaal snel de massa van het monster.Giet vervolgens het monster in een glazen homogenisatiebuis. Voeg daarna 200 µL ureabuffer toe voor elke 10 mg monster. Zorg er hierbij voor dat de residuen in de buis worden teruggewonnen door deze uit te spoelen met de ureabuffer-aliquot.Homogenise nu het monster met een gemotoriseerde PFTE-stamper bij 1.500 rpm. Druk de stamper langzaam 10 keer met een draaiende beweging op het monster. Breng vervolgens het stroperige gele supernatant met een glaspipet over naar een schone centrifugebuis van 1,7 milliliter.Herhaal nu de homogenisatie op het resterende monster met de helft van de hoeveelheid ureum. Verzamel het supernatant en voeg dit samen met de vorige collectie. Plaats de buis vervolgens gedurende 30 minuten op een buisrotator.Laad de buis na 30 minuten in een koude centrifuge en centrifugeer het monster gedurende een half uur bij 13, 000 G. Herstel vervolgens de supernatant en meet de proteïneconcentratie met behulp van de Bradford-proteïneanalyse.Na het uitvoeren van het voorgeschreven protocol werd het proteïnextract bestudeerd met behulp van verschillende methoden na enkele aanvullende behandelingen. In totaal werden 422 proteïnen in het weefsel van de mitralisklep geïdentificeerd middels tweedimensionale elektroforese, vloeistoffase-isoelektrische focussering, vloeistofchromatografie-massaspectrometrie en 2D vloeistofchromatografie-massaspectrometrie. De 422 proteïnen werden geclassificeerd met behulp van Gene Ontology-analyse.De extracellulaire regio's bevatten verschillende verwachte eiwitten en andere intracellulaire eiwitten en eiwitten van het celoppervlak. Veel hiervan werden voor het eerst geïdentificeerd in mitraliskleppen. De aanwezigheid van vier van deze eiwitten, die voorheen niet in mitraliskleppen waren geïdentificeerd, werd bevestigd met antilichamen in drie unieke monsters.De eiwitten zijn Septin-11, Four and a half LIM domains protein one, Dermatoponin en alpha crystalline B. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe u eiwitten uit de mitralisklep van het hart extraheert voor identificatie en kwantificering. Zodra deze methode onder de knie is, kan dit protocol in bijna twee uur worden voltooid indien correct uitgevoerd. Om bij deze procedure de grootste opbrengst aan eiwitten met een hoge eiwitintegriteit te verkrijgen, is het essentieel dat de monsters tijdens geen enkele overdracht ontdooien.

optimized-protocol-for-extraction-proteins-from-human-mitral

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

De analyse van eiwitexpressie in jonge embryonale muiskleppen is belemmerd door het beperkte beschikbare weefsel. Dit manuscript biedt een protocol voor het bereiden van eiwitten uit zich ontwikkelende embryonale muisklepgebieden voor western blot-analyse.

Eiwit Isolatie van het ontwikkelen van embryonale Mouse Heart Valve Gewest

We hebben een werkwijze voor het zuiveren van eiwitten mederegulerende interactie met de LC-MS / MS systeem.

Een eiwit Bereidingswijze voor de High-throughput identificatie van eiwitten Interactie met een nucleair Cofactor Met behulp van LC-MS / MS Analysis

Hier presenteren wij een interactief capture protocol toegepast op Arabidopsis thaliana leaf mesophyll protoplasten. Deze methode berust op in vivo UV-verknoping en staat voor isolatie en identificatie van plantaardige mRNA-bindende eiwitten uit een fysiologische omgeving.

MRNA Interactome Capture van Plant Protoplasts

Mitochondriën zijn slechts een klein percentage van de plant cel, moeten ze voor een aantal studies worden gezuiverd. Mitochondriën kunnen worden geïsoleerd uit een verscheidenheid van organen van de plant door homogenisering, gevolgd door de differentiaal- en dichtheid kleurovergang centrifugeren te verkrijgen van een hoogst gezuiverde mitochondriale fractie.

Isolatie en respiratoire metingen van Mitochondria van Arabidopsis thaliana

Mitochondriën zijn ribosomen die afweek van hun tegenhangers bacteriële en cytoplasmatische gespecialiseerd. Hier laten we zien hoe de mitoribosomes van hun inheemse compartiment in HEK cellen kan worden verkregen. Bij deze methode wordt isolatie van mitochondriën uit schorsing cellen en daaruit voortvloeiende zuivering van mitoribosomes.

Snelle isolatie van de Mitoribosome van HEK cellen

Hier presenteren we een protocol voor het uitvoeren van Polysoom profilering op het hart van de geïsoleerde geperfundeerd muis. We worden methoden beschreven voor perfusie van het hart, Polysoom, profilering en analyse van de fracties van de Polysoom met betrekking tot mRNAs, miRNAs en de Polysoom Proteoom.

Dynamische Proteomic en miRNA analyse van Polysomes van geïsoleerde muis hart na Langendorff perfusie

Dit protocol beschrijft een interne doorvoer voor aanvullende analytische en omics technieken, culminerend in een volledig gekoppeld karakterisering van natuurlijke organische stof en microbiële proteomics in verschillende ecosystemen. Deze aanpak maakt robuuste vergelijkingen voor het identificeren van de metabolische banen en het transformaties die belangrijk zijn voor het beschrijven van de gasproductie van broeikasgassen en het voorspellen van reacties op veranderingen in het milieu.

Single-doorvoer complementaire High-resolution analytische technieken voor het karakteriseren van complexe natuurlijke organische stof mengsels

Hier presenteren we een protocol te halen, op te lossen en te identificeren mitochondriale supercomplexen die blootstelling aan detergenten en Coomassie blauw minimaliseert. Dit protocol biedt een optimaal evenwicht tussen resolutie, en behoud van enzymactiviteiten, terwijl het minimaliseren van het risico om labiele proteïne-eiwitinteractie te verliezen.

Hybride duidelijke/blauwe inheemse elektroforese voor de scheiding en de analyse van mitochondrial Ademhalingsketen supercomplexen

We presenteren een tweestappenprotocol voor hoogwaardige mitochondrische isolatie dat compatibel is met eiwitontdekking en kwantificering op proteoomschaal. Ons protocol vereist geen genetische manipulatie en is dus geschikt voor het bestuderen van mitochondriën uit primaire cellen en weefsels.

Tweestaps tagvrije isolatie van mitochondriën voor verbeterde eiwitontdekking en kwantificering

Dit artikel beschrijft een methodologie voor de isolatie, karakterisering en kwantificering van humane plasma-afgeleide extracellulaire blaasjes (EV) en presenteert een workflow voor labelvrije analyse van het EV-proteoom met behulp van vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS).

Isolatie, karakterisering en proteomische analyse van plasma-afgeleide extracellulaire blaasjes voor de ontdekking van cardiovasculaire biomarkers

Bio-energetische en metabolomische studies op mitochondriën hebben hun veelzijdige rol bij veel ziekten aan het licht gebracht, maar de isolatiemethoden voor deze organellen variëren. De hier beschreven methode is in staat om hoogwaardige mitochondriën uit meerdere weefselbronnen te zuiveren. De kwaliteit wordt bepaald door ademhalingscontroleratio's en andere meetwaarden die worden beoordeeld met respirometrie met hoge resolutie.

Robuuste mitochondriale isolatie van knaagdierweefsel 

Leer een geoptimaliseerd protocol voor eiwitextractie uit de humane mitralisklep voor proteomische analyse. Deze methode helpt onderzoekers bij het identificeren van nieuwe diagnostische en prognostische markers voor hartklepziekten.

Geoptimaliseerd Protocol voor de Extractie van Proteïnen uit de Human Mitral Valve

Meer video's verkennen