Geoptimaliseerd Protocol voor de Extractie van Proteïnen uit de Human Mitral Valve
June 14th, 2017
De eiwitsamenstelling van de menselijke mitrale klep is nog steeds gedeeltelijk onbekend, omdat de analyse ervan gecompliceerd is door lage cellulariteit en derhalve door biosynthese met een lage eiwit. Dit werk biedt een protocol om eiwit efficiënt te extraheren voor de analyse van het mitrale klep proteome.
Het algemene doel van deze procedure is om eiwitten efficiënt te extraheren uit de menselijke hartmitrale klep, geschikt voor proteomische analyse. Deze methode kan mogelijk helpen bij het onthullen van pathogene mechanismen op het gebied van hartklepaandoeningen, waardoor het mogelijk wordt om nieuwe diagnostische en prognostische ziektemarkers en hopelijk therapeutische doelen te identificeren. Het belangrijkste voordeel van dit protocol is dat het een efficiënte extractiewerkstroom biedt die compatibel is met veel analytische toepassingen.
De resultaten zijn een meer uitputtende karakterisering van het cardiac mitrale klepproteum. Bovendien kan dit protocol ook worden toegepast op andere systemen, zoals de varkensmitrale klep, die een grote gelijkenis vertoont met de menselijke klep en wordt gebruikt in experimentele modellen voor evaluaties van klepfunctie. De experimentele procedure wordt gedemonstreerd door Stefania Ghilardi, een technicus uit mijn laboratorium.
Om de menselijke mitrale klep voor te bereiden, begin met een explantaathart dat vier tot 12 uur onder koude ischemie heeft gestaan. In een cleanroom, verwijder het hart uit de transportzak en plaats het in een gesteriliseerde emmer. Breng het hart vervolgens over naar een bioveiligheidscabinet.
Daar, gebruik een wegwerpmes om loodrecht op de hoofdas te snijden op het niveau van de linker- en rechterventrikel, ongeveer vier centimeter vanaf de apex. Leg het hart vervolgens op een steriele doek. Beweeg vervolgens de opgaande aorta en longslagader opzij om de linkerboezemdak te bereiken.
Op het linkerboezemdak, gebruik pincetten en haken om rond het linkeroortje te snijden om de mitrale klep bloot te leggen. De mitrale klep bevindt zich volledig in de linkerventrikel. Blootstel dus het grote mitralisklepje en het kleine mitralisklepje.
De anterolaterale en posteromediale commissuren definiëren de rand van het voorste en achterste gebied. Nu, met schaar en niet-traumatische pincetten, dissecteer het linkerboezem en de dikte van de ventrikelwand die de mitrale klep omringt. Tijdens deze dissectie, identificeer de continuïteit van de mitraal-aortaklep.
Separeer vervolgens het voorste mitralisklepje van het achterste mitralisklepje door langs de commissuren te snijden die het achterste klepje begrenzen. Wanneer de procedure is voltooid, desinfecteer de tafel van het kabinet met een 70% isopropylalcoholoplossing en een 6% waterstofperoxideoplossing. Was nu het achterste klepje van de mitrale klep in zoutoplossing.
Snijd vervolgens de klep in kleine stukjes, elk kleiner dan een vierkante centimeter. Wikkel de stukjes afzonderlijk in aluminiumfolie en vries ze snel in met vloeibare stikstof. Gebruik pincetten om een monster uit de vloeibare stikstof te verwijderen en plaats het onmiddellijk op droog ijs om de eiwitextractie te beginnen.
Laat het monster niet ontdooien. Plaats vervolgens in een dewarkolf gevuld met vloeibare stikstof de mortel, bijbehorende stampers en het monster. Het is van cruciaal belang dat de vloeibare stikstof wordt gebruikt om het monster in te vriezen en het maalsysteem te koelen.
Deze stap voorkomt biologische degradatie en maakt efficiënt malen mogelijk, maar vereist technische training voor veilig gebruik. Eenmaal snel bevroren, plaats de mortel en stampers in een polystyreen doos met droog ijs. Plaats ook een spatel op het droog ijs.
Verwijder vervolgens het monster uit de folie en laad het in de mortel. Plaats de grotere stamper erboven. Gebruik een schroevendraaier om de stamper te draaien en maal het monster 15 tot 20 keer.
Tijdens het malen, meng het monster met de punt van een gekoelde spatel. Na gebruik van de grote stamper, herhaal het maalproces met een kleinere stamper. Het verkrijgen van een fijn poeder is cruciaal voor efficiënte eiwitextractie.
Gooi nu het poedervormige monster in een centrifugeerbuis van 15 milliliter met bekende massa. Borstel vervolgens eventueel resterend materiaal in de mortel met een koude spatel. Houd de buis met het monster op droog ijs en bepaal snel de massa van het monster.
Gooi vervolgens het monster in een glazen homogenisatiebuis. Voeg vervolgens 200 microliter ureumbuffer toe voor elke 10 milligram monster. Herstel de restanten die in de buis achterblijven door ze met de ureumbuffer af te spoelen.
Homogeniseer nu het monster met behulp van een gemotoriseerde PFTE-stamper die op 1.500 tpm draait. Druk de stamper langzaam 10 keer met een draaiende beweging op het monster. Breng vervolgens de stroperige gele supernatant over naar een schone 1,7 milliliter centrifugeerbuis met behulp van een glazen pipet.
Herhaal de homogenisatie op het resterende monster met de helft van de hoeveelheid ureum. Herstel de supernatant en combineer deze met de vorige verzameling. Plaats vervolgens de buis 30 minuten in een buisrotator.
Laad de buis na 30 minuten in een koude centrifuge en centrifugeer het monster gedurende een half uur bij 13.000 G. Herstel vervolgens de supernatant. Meet de eiwitconcentratie met behulp van de Bradford-eiwitanalyse.
Na het uitvoeren van het voorgeschreven protocol, werd het eiwitextract bestudeerd met behulp van verschillende methoden na enkele aanvullende behandelingen. In totaal werden 422 eiwitten geïdentificeerd in het mitrale klepweefsel door tweedimensionale elektroforese, vloeistof-fase iso-elektrisch focussering, vloeistofchromatografie-massaspectrometrie en 2D vloeistofchromatografie-massaspectrometrie. De 422 eiwitten werden geclassificeerd met behulp van Gene Ontology-analyse.
De extracellulaire gebieden bevatten verschillende verwachte eiwitten en andere intracellulaire en celoppervlakte-eiwitten. Velen ervan werden voor het eerst geïdentificeerd in mitrale kleppen. De aanwezigheid van vier van dergelijke eiwitten die eerder niet in mitrale kleppen waren geïdentificeerd, werd bevestigd met behulp van antilichamen in drie unieke monsters.
De eiwitten zijn Septine-11, Four and a half LIM domains eiwit één, Dermatoponine en alpha kristallijn B.Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u eiwitten uit de hartmitrale klep kunt extraheren voor
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit protocol heeft als doel om eiwitten efficiënt uit de menselijke hartklep te extraheren voor proteomische analyse. Het kan helpen bij het identificeren van nieuwe diagnostische en prognostische markeringen bij hartklepaandoeningen.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Hartbiologie
- Proteomics
- Hartklepaandoeningen
Achtergrond
- De eiwitsamenstelling van de menselijke mitralisklep is niet volledig begrepen.
- Een lage cellulairheid bemoeilijkt eiwitanalyse.
- Inzicht in het proteoom van de mitralisklep is cruciaal voor de hartgezondheid.
- Dit protocol kan ook worden toegepast op de varkens-mitralisklep.
Doel van het onderzoek
- Om een efficiënte methode te bieden voor eiwitextractie uit de mitralisklep.
- Om proteomische analyse te vergemakkelijken voor beter begrip van hartklepaandoeningen.
- Om potentiële therapeutische doelen en ziektemarkers te identificeren.
Gebruikte methoden
- Eiwitextractieprotocol voor menselijke hartklep.
- Compatibel met verschillende analytische toepassingen.
- Gedemonstreerd door een laboratoriumtechnicus.
- Mogelijke toepassing in experimentele modellen.
Belangrijkste resultaten
- Efficiënte extractieworkflow vastgesteld.
- Meer uitgebreide karakterisering van het mitralisklep proteoom.
- Protocol toepasbaar op andere vergelijkbare systemen.
- Inzichten in pathogene mechanismen van klepziekte.
Conclusies
- Dit protocol verbetert het begrip van de biologie van de mitralisklep.
- Het kan leiden tot de ontdekking van nieuwe diagnostische en therapeutische wegen.
- Verder onderzoek kan voortbouwen op dit fundamentele werk.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This protocol addresses a key bottleneck in cardiovascular target validation by enabling efficient protein extraction from low-cellularity, matrix-rich tissues like the human mitral valve. By supporting comprehensive proteomic profiling, it facilitates mechanistic de-risking of therapeutic targets in cardiac valve disease. The method enhances predictive confidence in early discovery by linking molecular phenotypes to pathogenic mechanisms.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through global protein identification in disease-relevant tissue.
- Operational Value: Provides a standardized workflow for extracting proteins from challenging extracellular matrix-rich samples.
- Predictive Value: Supports biomarker discovery and target prioritization by uncovering novel disease-associated proteins.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates protein extracts compatible with downstream applications such as immunoblotting and mass spectrometry.
- Reproducibility: Establishes a consistent extraction process critical for assay standardization across laboratories.
- Scalability: Permits application to model systems like porcine mitral valve for cross-species target validation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links protein expression data with mRNA and immunohistochemical analyses for multi-omics validation.
- Mechanistic De-risking: Identifies intracellular and extracellular proteins not previously detected in mitral valves, clarifying disease mechanisms.
- Preclinical Relevance: Enables target validation in models that closely resemble human valve physiology.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target identification to preclinical validation by providing reliable molecular readouts from diseased tissue.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing via comprehensive proteomic characterization of the mitral valve.
- Screening: Delivers quantifiable protein outputs suitable for screening campaigns targeting valve pathology.
- Analytics: Enables comparative analysis of protein expression profiles across conditions using Bradford assay and electrophoresis.
- Translational Research: Facilitates correlation of proteomic data with mRNA and immunohistochemical findings.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable proteomic preparation platform for cardiovascular target programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target confidence by revealing previously undetected proteins in mitral valve tissue.
- Operational Value: Ensures sample integrity through cold-chain handling and prevents degradation during extraction.
- Strategic Value: Reduces biological risk in target selection by providing mechanistic insights into valve disease pathways.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted advancement decisions through comprehensive molecular profiling of disease tissue.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue dissection and cold-sample handling to prevent thawing.
- Needs access to cryogenic equipment (liquid nitrogen, dry ice) and motorized homogenization tools.
- Demands standardized protocols across teams to ensure reproducible protein yields.
- Must account for tissue variability when adapting to different valve models or disease states.
- Limited by starting material availability; dependent on access to explanted human or porcine valves.
