Patronen van bioactieve eiwitten of peptiden op Hydrogel Fotochemie voor biologische toepassingen gebruiken

Het algemene doel van deze methodologie is het creëren van geïmmobiliseerde bioactieve spatiale eiwitpatronen die kunnen worden gebruikt om cellulaire responsen te bestuderen. Deze methode maakt het mogelijk om in-vivo signalen te reproduceren met behulp van biomateriaalsstrategieën. Deze techniek maakt een nauwkeurige nabootsing mogelijk van bepaalde signaleringsmotieven die niet kunnen worden bereikt met standaard kweekmethoden, zoals sequentiële groeifactoren, cel-cel signalering en spatiaal specifieke biochemische signalen.

Dit protocol is van groot belang ten opzichte van bestaande methoden, omdat het een eenvoudige methode biedt voor het aanpassen van de stijfheid van het substraat en het eiwitpatroon. Hoewel deze methode technologieën voor tissue engineering en regeneratieve geneeskunde kan bevorderen, kan deze ook worden toegepast bij de studie van andere systemen, zoals weefselontwikkeling en het lot van stamcellen. Begin met het bereiden van stamoplossingen voor het belangrijkste hydrogelcomponent, polyethyleenglycoaldiacrylaat, de foto-initiator, lithiumfenyl-2,4,6-trimethylbenzoylfosfinaat en het ECM-eiwit, fibronectine, onder steriele omstandigheden zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol.

Filtersteriliseer elke oplossing met een spuitfilter van 0,22 micron vóór gebruik of het bewaren van de individuele aliquoten. Wikkel vervolgens de PEG-DA-oplossing in aluminiumfolie om deze tegen licht te beschermen. Wikkel de stamoplossing van de foto-initiator in aluminiumfolie om deze tegen licht te beschermen en bewaar de bereide oplossing bij 4 °C gedurende maximaal enkele maanden.

Indien de fibronectine-stamaanmaak is ingevroren, laat het steriele aliquot dan enkele uren op ijs of overnacht bij vier degree celsius ontdooien. Begin met het autoclaveren van één polyester vel voor elke gelvorm. Week vervolgens twee glazen objectglazen in drie plastic spacers voor elke gelvorm gedurende ten minste twee uur in 70%ethanol.

Week daarnaast voor elke gelvorm vijf binderclips gedurende 10 minuten in 70%ethanol. Plaats de glazen objectglazen, spacers en binderclips op een klein autoclaafvel in de celkweekkap om ze enkele uren aan de lucht te laten drogen. Bereid vervolgens de hydrogelvormen voor door de 0,5 millimeter dikke plastic spacers rond de rand van een objectglas te plaatsen.

Plaats het tweede glazen objectglas erop en bevestig vervolgens de afstandhouders strak naast elkaar met klemmen. Steriliseer tot slot het oppervlak van de mal door deze in de zuurkast te plaatsen en het UV-licht 30 minuten voor gebruik aan te zetten. Draai de mal halverwege het sterilisatieproces om om ervoor te zorgen dat beide oppervlakken worden blootgesteld.

Maak de gel-precursoreffecten zoals beschreven in tabel één van het bijbehorende tekstprotocol. Meng vervolgens de volumes PEG-DA, fibronectine en foto-initiator om de hydrogel te vormen. Pipetteer de oplossing krachtig om een homogene oplossing te verkrijgen, maar voorkom de vorming van luchtbellen.

Pipetteer de gelprecursoroplossing voorzichtig tussen de twee glasplaatjes van de gelvorm. Plaats de vorm vervolgens onder een UV-lamp en belicht deze gedurende één tot twee minuten om de hydrogel te vormen. Zodra de gel is gestold, verwijdert u de klemmen en neemt u het bovenste glasplaatje voorzichtig weg door tegengestelde druk uit te oefenen op de twee zijdelingse afstandshouders.

Gebruik vervolgens een biopsietang van de juiste maat om de hydrogelmonsters uit te snijden. Snijd meerdere hydrogels uit de gelrechthoek om als replica's en controlemonsters te dienen. Steriliseer het fotomasker door het 10 minuten te laten weken in 70% ethanol.

Laat het fotomasker vervolgens aan de lucht drogen in een celkweekkast. Pipetteer daarna één tot twee µL per cm² van een thiolerede eiwitoplossing op het oppervlak van elke uitgesneden hydrogel voor oppervlaktepatronering. Het is belangrijk om de eiwitoplossing gelijkmatig over het oppervlak van de hydrogel te verspreiden om een uniforme eiwitimmobilisatie te waarborgen.

Plaats het fotomasker voorzichtig op het oppervlak van de hydrogel. Druk het masker zachtjes aan om eventuele luchtbellen die tussen het masker en het hydrogeloppervlak ontstaan te verwijderen. Plaats de hydrogel vervolgens onder het UV-licht en stel deze voor een tweede ronde gedurende 30 tot 60 seconden bloot aan het UV-licht.

Was de hydrogels met PBS om eventuele ongereageerde stoffen te verwijderen en plaats elke hydrogel in de wellplaat zodat het patroonoppervlak naar boven is gericht. Was de gels vervolgens gedurende de nacht in PBS bij vier graden celsius. Verwijder de PBS uit de wells en voeg daarna 250 microliters basaal EGM2 toe aan elke well; incubeer de gels vervolgens gedurende vijf tot 10 minuten bij 37 degree celsius.

Verteer tijdens de incubatie een plaat met bijna-confluente HUVECs tot een enkelcel-suspensie met trypsine met gebruik van standaardtechnieken. Centrifugeer vervolgens de celsuspensie en verwijder voorzichtig het supernatant. Resuspendeer de celpellet in basaal EGM2 zonder toegevoegde groeifactoren en breng een deel van de celsuspensie over naar een hemocytometer.

Tel de cellen om de concentratie te bepalen. Centrifugeer vervolgens de plaat met de hydrogels 3 minuten lang bij 300 x G, om er zeker van te zijn dat de hydrogels zich onderaan de put bevinden en niet drijven. Het is essentieel dat de hydrogels niet in de putten drijven.

Drijvende hydrogels zullen het succes van het cellazaaien beperken en problemen veroorzaken bij de beeldvorming van de hydrogel. Pipetteer langzaam 75.000 cellen per vierkante centimeter op het centrum van elk hydrogeloppervlak om de gels niet te verstoren. Plaats de plaat vervolgens in een celkweekincubator bij 37 °C.

Verwijder de schaal gedurende enkele dagen periodiek om de celmigratie als reactie op het eiwitpatroon te observeren. Vervang elke twee tot drie dagen 50% van het medium. Bij het vormen van de hydrogels kunnen verschillende concentraties precursor PEG-diacrylaat worden gebruikt om de gewenste stijfheid van het substraat te verkrijgen.

Hier wordt getoond dat een 20%PEG-DA-oplossing correleert met een stijfheid van meer dan 100 kilopascals. Het is daarnaast belangrijk om zowel de concentratie van de foto-initiator als de UV-belichtingstijd in overweging te nemen, aangezien een toename van beide variabelen de bioactiviteit van gebonden moleculen zal verminderen, hier weergegeven door de bioactiviteit van lysosomen. Het minimaliseren van de UV-belichting tijdens de vorming van de hydrogel is cruciaal om vrije acrylaatfunctionele groepen te behouden voor daaropvolgende eiwitimmobilisatiereacties.

Hydrogels die langer dan twee minuten aan UV-licht zijn blootgesteld, zijn niet in staat om de in rood getoonde geïmmobiliseerde proteïnepatronen te creëren. Bovendien reageren er meer proteïnen met het oppervlak naarmate de UV-blootstelling van het proteïnepatroon toeneemt. Wanneer ze correct zijn geprepareerd, kunnen cellen op deze gepatroneerde hydrogel-substraten worden gekweekt om hun gedrag te manipuleren.

Hier werden endothelcellen uniform gezaaid op het oppervlak van VEGF-gepatroneerde PEG-hydrogels. Twee dagen na het zaaien werd waargenomen dat de endothelcellen migreerden naar de ruimtelijke regio's van de hydrogel waarin het geïmmobiliseerde VEGF zich bevond. Na de ontwikkeling van dit protocol kunnen onderzoekers dit gebruiken om elk eiwit of peptide te immobiliseren om nieuwe bioactieve platforms voor in-vitro cellsystemen te verkennen.

Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de concentratie van de foto-initiator en de UV-blootstellingstijd te minimaliseren om de bioactiviteit van de geïmmobiliseerde moleculen te behouden. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u bioactieve eiwitten en peptiden in patronen op PEG-hydrogels kunt aanbrengen, cellen uniform op hydrogels kunt zaaien en de daaropvolgende celrespons kunt observeren.