Eenvoudige lithografie-vrije single cell micropatterning met behulp van Laser-Cut Stencils

We beschrijven een op stencil gebaseerde lithografie-vrije eencellige micropattern methode die veel obstakels in verband met fotolithografie en zachte lithografie overwint. De stencils zijn herbruikbaar en het proces is goedkoop en aanpasbaar. Deze methode opende een nieuwe weg voor niet-ingenieur onderzoekers om celvorm en gebied-geïnduceerde mechanotransductie in verschillende fysiologische en pathologische contexten te bestuderen.

Bovendien, dit protocol maakt het mogelijk voor micropatterning van duizenden cellen die kunnen worden gebruikt voor high-throughput drug screening en ziekte modellering in een schotel. Visuele demonstratie zal de implantatie van twee cruciale stappen vergemakkelijken: het loskoppelen van coverslip van hydrogel, het drogen van hydrogel voldoende voor het plaatsen van het stencil. Bereid de polyacrylamide hydrogel oplossing voor in een nieuwe 50 milliliter propyleencentrifugebuis zoals beschreven in het manuscript.

Vervolgens, om de 5%fotoinitiator oplossing te bereiden, los de ingrediënten op in 700 microliter van 100% ethanol. De ingrediënten zijn niet oplosbaar in water dus zorg ervoor dat u volledig oplossen door vortexing. Voeg 300 microliter PBS toe voor een eindvolume van één milliliter.

Werken op ijs, verdun kelder membraan matrix eiwit voorraad oplossing met ijskoude DMEM F12 media of 1X PBS aan de geoptimaliseerde verdunningsverhouding. Blijf op ijs voor later gebruik. Bij het werken met kelder membraan matrix, zorg ervoor dat altijd werken op ijs en gebruik ijskoude oplossingen in gekoelde pipet tips en buizen.

Plaats een UV-banklamp in een biologische veiligheidskap. Plaats vervolgens de eerder gesteriliseerde paraffinefilms. Als de paraffinefolies niet volledig droog zijn, gebruikt u een vacuümaspiratiesysteem om eventuele restvloeistof te verwijderen.

Met behulp van autoclaved tang, plaats zes autoclaved coverslips op de paraffine film zes in elke Petri schotel. Om de UV cross-linkable polyacrylamide uiteindelijke oplossing voor te bereiden, verdun de foto-initiatoroplossing met de polyacrylamide hydrogel precursoroplossing. Steriliseren van de oplossing met behulp van een 50 milliliter filterunit met een poriegrootte van 0,22 micrometer.

Dan afzien van 200 microliter uv cross-linkable polyacrylamide definitieve oplossing op elk van de zes glazen coverslips in de petrischaaltjes. Bedek met behulp van autoclaved tangen zorgvuldig elke coverslip met een tweede coverslip die een laag van de oplossing tussen de twee coverslips overvult. Plaats de petrischaaltjes met de hoezenlips onder de UV-banklamp met het deksel niet gesloten.

De dekking van wit papier op het niet-witte oppervlak is belangrijk om het uv-intensiteitsverlies te minimaliseren. Voor bescherming tegen UV-straling, bedek de lamp met aluminiumfolie. Fotopolymeer de polyacrylamide hydrogels gedurende vijf minuten.

Gebruik een scheermesje om elk paar coverslips zorgvuldig te scheiden. Vul het reservoir met zes hydrogel coverslip composieten met PBS. Na vijf minuten spoelen, breng je de hydrogel coverslip composieten terug naar de paraffinefilm in de Petri schotel.

Haal een buis van Sulfo-SANPAH uit opslag bij min 80 graden Celsius. Voeg 1.200 microliter voorgekoelde PBS aan de buis toe en meng door op en neer te pipetten. Doe 200 microliter van de verdunde Sulfo-SANPAH op de paraffinefilm in de petrischaal.

Plaats een hydrogel coverslip composiet over de Sulfo-SANPAH met de hydrogel contact met de Sulfo-SANPAH. Plaats vervolgens de hydrogel coverslip composieten onder de UV-lamp en leg ze gedurende vijf minuten bloot om de Sulfo-SANPAH te activeren. Als de Sulfo-SANPAH van oranje naar bruin verandert, wat wijst op succesvolle activering en integratie, gaat u binnen 10 minuten naar de volgende stappen.

Vul het wegwerp polypropyleenreservoir aan met verse PBS. Breng de geactiveerde hydrogel coverslip composieten naar het reservoir en spoel ze kort om ongebonden Sulfo-SANPAH te verwijderen. Plaats de hydrogel coverslip composieten op de paraffine film in de Petri gerechten en zorgvuldig deppen ze met steriele pluisjes-vrije doekjes.

Plaats een stencil op de top van elke hydrogel coverslip composiet. Om een strakke afdichting tussen het stencil en het composiet te garanderen, verwijdert u overtollig vocht door te deppen met autoaclaved pluisvrije doekjes. Doe voorzichtig de verdunde keldermembraanmaten eiwitoplossing af die 200 microliters bovenop elke hydrogel coverslipcomposiet plaatst.

Incubeer de constructies 's nachts op 37 graden Celsius. De volgende dag, breng de composieten naar een zes-put plaat. Een strakke afdichting tussen hydrogel en stencil kan eenvoudig worden gevalideerd door te observeren of de matrix eiwitoplossing bovenop het stencil is bewaard.

Het niet vormen van een strakke afdichting leidt tot een snelle lekkage van de eiwitoplossing door de gaten. Dompel de composieten volledig onder in PBS. Met behulp van autoclaved pincet, voorzichtig los de stencils van de hydrogels zonder scheuren de hydrogels.

Haal de PBS uit de putten en vul de putten met DMEM. Incubeer de plaat 's nachts op 37 graden Celsius. Na het verwijderen van de plaat uit de couveuse, onderzoek de DMEM.

Als de DMEM niet troebel is, zijn de hydrogel coverslip composieten klaar om te worden gebruikt voor celbeplating. Stencils werden vervaardigd met arrays van vierkanten en rechthoeken. Micropatronen werden gemicrosileerd uit de stencils en er werden eilanden van matrixeiwit verkregen.

Celeilanden werden ook verkregen. Bijvoorbeeld, eilanden van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten. Matrix eiwitconcentratie speelde een essentiële rol bij het genereren van de juiste patronen.

Een optimale concentratie leidde tot een homogene verdeling van eiwitten. Suboptimale matrix eiwit oplossing concentraties leidde tot suboptimale patronen. Het is van cruciaal belang om de voorkant van het stencil te gebruiken.

Als de achterkant van het stencil wordt gebruikt, neemt de grootte van de matrix-eiwiteilanden toe als gevolg van de richting van het lasersnijden. Terwijl het gebruik van de achterkant van het stencil de breedte van de rechthoekige patronen niet significant beïnvloedde, nam de hoogte aanzienlijk toe, wat leidde tot een vermindering van de beoogde beeldverhouding. Stencil-gebaseerde patronen werden toegepast op silicium elastomeersubstraten.

De gedessineerde cardiomyocyten op siliciumelastomersubstraten werden gevisualiseerd door immunocytochemie van harttroponine T bij lage vergroting en door sarcomeric eiwit alpha-actinine bij hoge vergroting. De stencil-gebaseerde patroon werd ook toegepast op patroon twee cardiomyocyten naast elkaar op hydrogels met verschillende stijfheid. De ontdekking van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel en bijbehorende differentiatieprotocollen heeft dit tot een ideaal in vitro menselijk model gemaakt voor het bestuderen van oncogenese en pathogenese.

Een belangrijke beperking van het gebruik van het IPS-systeem is echter het ontbreken van structuur aan de micro-omgeving, die een bijzondere biochemische samenstelling en stijfheid heeft om met cellen te communiceren. De patronen kunnen worden gecombineerd met tractiekracht microscopie en immunocytochemie testen om de structuur en functie van de cardiomyocyten te karakteriseren. Analyse van IPS-afgeleide celtypen, in ons geval cardiomyocyte, in een meer fysiologische morfologie opent mogelijkheden om uitdagende cardiomyocyten te bestuderen in cultuurschotel.

De techniek kan ook worden toegepast op vele andere systemen, zoals en hoge inhoud screening platen. De vorm en het substraat kunnen gemakkelijk aan de toepassing worden aangepast.