Controle van celhechting met behulp van Hydrogel-patroontechnieken voor toepassingen in tractiekrachtmicroscopie

Het algemene doel van deze procedure is het fabriceren van micropatroon hydrogels voor 2D-tractiekrachtmicroscopiestudies. Dit wordt bereikt door eerst een methacrylaatglas te laten glijden en daarop de eerste laag van een polyacrylamide hydrogel te vormen. De tweede stap is het maken van een andere hydrogellaag met fluorescerende kralen voor tractiekrachtmicroscopie.

De hydrogel is ingeklemd met een micro-patroon cover slip erop, wat resulteert in de overdracht van de micro-patroon matrix eiwitten op het hydrogel oppervlak. Vervolgens wordt de polyacrylamidehydrogel gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur laten polymeriseren. De slip van de bovenklep wordt vervolgens voorzichtig verwijderd.

Fluorescentiemicroscopie beeldvorming wordt gebruikt om de aanwezigheid van de kralen en de succesvolle overdracht van micro-patroon extracellulaire matrix eiwitten aan te tonen. Deze methode helpt om efficiënt en nauwkeurig verschillende trekkrachten te meten door gebruik te maken van de licht- en gebruiksafgifte van cellen. Het mogelijk maken om een hoger aantal experimentele waarnemingen uit hetzelfde monster te verkrijgen.

Dus de procedure wordt gedemonstreerd door Joel Christian, een afgestudeerde student uit mijn laboratorium. Voeg 10 milliliter dubbel gedestilleerd water toe aan een bekerglas. Voeg daarna 18,75 milliliter azijnzuur, 18,75 milliliter 3-propylmethacrylaat en 252,5 milliliter ethanol toe aan de oplossing.

Wanneer de oplossing klaar is, breng je deze over in een kristalliserende schaal. Neem 24 millimeter ronde afdekslipjes, maak ze schoon met een precisiedoekje en doe ze in een op maat gemaakt teflonrek. Dompel het vervolgens onder in de oplossing en incubeer gedurende 15 minuten.

Neem het rek en spoel het af met ethanol. Droog de afdekking slipt onder de luchtstroom. Methacrylaat afgedekte afdekslips kunnen tot een maand bij kamertemperatuur worden bewaard.

Neem een ronde afdekslip van 15 millimeter en leg deze op een petrischaaltje. Gebruik een diamantpen om de bovenzijde van de afdekplaat te markeren. Ga vervolgens verder met reinigen via zuurstofplasmabehandeling.

De afdekslip is schoon bij 0,4 millibar en 200 Watt gedurende twee minuten. Pipetteer 100 microliter van 0,01% Poly-L-Lysine-oplossing op het oppervlak van de afdekslip en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Was daarna de afdekslip met 10 millimolair bij een pH van 8,5.

Haal de overtollige vloeistof eruit, maar houd het oppervlak nat. Pipetteer 100 microliter van 50 milligram per milliliter mPEG-SVA in 10-millimolaire pH 8.5-oplossing op het oppervlak van de afdekslip en incubeer gedurende één uur bij kamertemperatuur. Spoel daarna de afdekslipjes af met een pH 8,5 van 10 millaris.

Voeg vervolgens twee microliter PLPP-gel gevolgd door 40 microliter ethanol toe aan het oppervlak. Kantel de petrischaal voorzichtig om de oplossing te homogeniseren. Wacht vijf minuten tot de oplossing polariseert.

Plaats de afdekplaat in een petrischaaltje met bodemgat van 35 millimeter. Leg de petrischaal met de afdekplaat op het microscooppodium. Pas de focus op het oppervlak van het glas aan.

Laad en vergrendel het vooraf getekende patroon. Start de patroonvorming door een UV-dosis van 30 millijoules per vierkante millimeter. Na het voltooien van de patroonstap verwijdert u de patroonafdekkingsslip en spoelt u het oppervlak af met PBS.

Incubeer het monster met een 100 microliter mengsel van 25 microgram per milliliter fibronectine en 25 microgram per milliliter fibrinogeen geconjugeerd met Alexa 488 opgelost in PBS gedurende één uur bij kamertemperatuur. Om het hydrogels substraat te bereiden, begin je met het plaatsen van de methacrylaatdeksel in een petrischaaltje. Bereid om te beginnen verse geoxideerde AgA-oplossing door 9,55 milliliter dubbel gedestilleerd water toe te voegen aan een Falcon-buis van 15 milliliter.

Voeg vervolgens 0,5 milliliter AgA toe. Voeg vervolgens 42 milligram natriummetapyruvaat toe aan de oplossing. Zet de oplossing vier uur op de shaker.

Bereid vervolgens de stamoplossing door acrylamide, bisacrylamamide en dubbel gedestilleerd water volgens tabel 1 te mengen. De voorraadoplossing kan tot een jaar bij vier graden Celsius worden bewaard. Bereid de werkoplossing voor de onderste laag door 99,3 microliter stamoplossing te mengen met 0,5 microliter ammoniumpersulfaat 1% en 0,2 microliter TEMED.

Neem 10 microliter uit de oplossing en pipetteer druppelsgewijs op de methacrylaatkapslip. Plaats voorzichtig een ronde afdekslip van 15 millimeter op de druppel en wacht 45 minuten tot deze polymeriseert. Maak vervolgens de bovenste afdekslip los met het scalpel.

Bereid vervolgens de werkoplossing voor de bovenste laag door 93,3 microliter stockoplossing te mengen met één microliter geoxideerde HEA, vijf microliter fluorescerende kralen, 0,5 microliter ammoniumpersulfaat 1% en 0,2 microliter TEMED. Neem vijf microliter uit de oplossing en pipetteer het druppelsgewijs op de hydrogel van de onderste laag. Plaats voorzichtig een micropatroon afdekslip op de druppel.

Wacht 45 minuten tot het polymeriseert. Maak de afdekslip voorzichtig los met een scalpel. En lijm de afdekplaat op de bodem van een op maat gemaakte zes-well plaat.

Voeg PBS toe aan de putten. Om de cellen te zien, aspirateer je de PBS uit de zes-putplaat. Voeg voor fibroblasten dmem met hoge glucose toe die L-glutamine bevat en vul het aan met 10% FPS en 1% penicilline en streptomycine.

Incubeer de cellen 's nachts bij 37 graden Celsius en 5% CO2. Schakel de CO2 en de verwarming in voor de microscopiefase. Zet vervolgens de microscoop aan en plaats de putplaat op het podium.

Stel het verlichtingspatroon in en markeer interessante cellen. Focus opnieuw op het oppervlak van de hydrogel. Verkrijg het beeld van de cellen in het brightfield-kanaal.

Als u de afbeelding van de kralen in de vervormde toestand wilt maken, schakelt u over naar het kanaal. Schakel vervolgens over naar het laserkanaal en verlicht de cel volgens het patroon gedurende drie minuten. Dit komt overeen met een dosis van 6.000 millijoules per vierkante millimeter.

Schakel daarna het kanaal om en verkrijg het beeld van de kralen in de ongevormde toestand. Om de trekkrachten te berekenen, opent u de fluorescerende kraalbeelden die al gecorrigeerd zijn voor de laterale drift. De volledige analyse van de tractiekrachten wordt gedetailleerd beschreven in het bijgevoegde script.

Om de selectieve hechting van cellen aan de micro-patroongebieden op het hydrogelsoppervlak te verifiëren, werden monsters afgebeeld met fluorescerende microscopie met behulp van vooraf gelabelde matrixeiwitten en met brightfield-microscopie om cellen te visualiseren. De mechanische eigenschappen van polyacrylamide hydrogels werden gevarieerd door verschillende hoeveelheden acrylamide en bis-acrylamide te mengen. De stijfheid van de hydrogel werd geëvalueerd met nano-indexeringsexperimenten door atomaire krachtmicroscopie.

Tractiekrachtmetingen werden uitgevoerd na het toepassen van een ruimtelijke, temporeel gecontroleerde, ultraviolette laserstraalverlichting om selectief micron-sized gebieden van de polyacrylamide hydrogel te verlichten. De tractiekrachten werden gereconstrueerd met behulp van geregulariseerde FTTC met een regularisatieparameter gekozen door gegeneraliseerde kruisvalidatie. Onze model modulaire aanpak op basis van aantrekkingskrachtmicroscopie in combinatie met licht- en gebruiksafgifte van micropatrooncellen is veelzijdig en kan verder worden benut met andere microscopie- en beeldvormingsinstellingen om de resolutie en gevoeligheid te verbeteren.