Kwantificeren van micro-organismen in lage concentraties, met behulp van digitale holografische microscopie (DHM)
November 1st, 2017
Digitale holografische microscopie (DHM) is een volumetrische techniek waarmee imaging monsters die 50-100 X dikker dan helderveld microscopie bij vergelijkbare resolutie, met scherpstellen uitgevoerd na verwerking. Hier DHM wordt gebruikt voor het identificeren, tellen, en bijhouden van micro-organismen bij zeer lage dichtheden en vergeleken met metingen van de optische dichtheid, kiemgetal, en directe.
Het algemene doel van dit experiment is om de detectie van micro-organismen op zeer lage niveaus te demonstreren met behulp van digitale holografische microscopie. Deze techniek is gevoeliger dan traditionele lichtmicroscopie en biedt realtime informatie over bacteriële gedragingen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen op biologische en kosmologische gebieden, zoals het zoeken naar pathogene organismen in water of leven binnen ons zonnestelsel op ijzige manen.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat DHM een volumetrische techniek is, wat betekent dat we driedimensionale informatie over ons monster onmiddellijk kunnen vastleggen zonder dat we fysiek opnieuw hoeven te focussen. De implicaties van deze techniek strekken zich uit naar de diagnose van infecties in de bloedbaan of het hersenvocht vanwege het vermogen om lage bacterieconcentraties te detecteren. Om met deze procedure te beginnen, neem op de dag van het experiment een spectrofotometrische meting van de bacteriële mastercultuur die naar verwachting in het bereik van 0,6 tot 0,7 ligt.
Neem vervolgens een monster van de mastercultuur en tel de cellen direct met behulp van een Petroff-Hausser telkamer om zowel levende als dode cellen te tellen. Breng een monster van 10 microliter van de onverdunde cultuur over met een micropipet naar de kamer. Beeld het af onder een microscoop met een hoog droog objectief met fasecontrast.
Tel vervolgens de bacteriën in ten minste 20 vierkantjes en bereken het gemiddelde. Bereken de concentratie als het gemiddelde van 20 vierkantjes vermenigvuldigd met de verdunningsfactor. Om alleen levende cellen te tellen, maak een seriële verdunning van elk van de geselecteerde bacteriemonsters met steriele 0,9% zoutoplossing door 20 microliter van de bacterieoplossing over te brengen naar een andere put en deze te verdunnen met 180 microliter zoutoplossing.
Herhaal de procedure tot de laagste concentratie ongeveer 10 tot 3 cellen per milliliter is. Neem vervolgens 100 microliter van de monsters van ten minste twee verdunningen en plateer ze op de geschikte vaste mediaplaten. Verspreid ze met een steriele verspreider en voer ten minste drie replica's van elke verdunning uit.
Incubeer ze daarna overnacht of tot de kolonieën groeien op een geschikte temperatuur. Tel vervolgens de kolonieën. Bereken de kolonievormingseenheden en breng het gemiddelde over de replica's samen.
Maak in deze procedure seriële verdunningen van de mastercultuur voor DHM en post-DHM telling van CFU op Lysogeniebouillon mediaplaten. Verdun de bacteriën in 25 milliliter van een minimaal medium dat bewegingsvrijheid bevordert maar celdeling remt, zodat de concentratie van cellen niet aanzienlijk verandert tijdens het experiment. Om DHM-video's op te nemen, trek met een steriele spuit ongeveer 10 milliliter van de verdunning van belang naar binnen.
Verbind vervolgens de spuit met de DHM-monsterkamer met behulp van steriele fittingen en slangen. Laat het monster continu door de monsterkamer stromen met behulp van een spuitpomp. Terwijl het monster door de monsterkamer stroomt, verwerft u opeenvolgende hologrammen met een geschikte framesnelheid.
Laat voldoende tijd verstrijken om de volledige 10 milliliter monster door de DHM te laten stromen. Om ervoor te zorgen dat bacteriën niet groeien of afsterven tijdens de experimenten, inoculeer de verrijkte mediaplaten met 100 microliter van het gebruikte medium na de DHM-beeldopname door het met een steriele verspreider te verspreiden. Incubeer ze vervolgens 24 uur op de juiste temperatuur voordat u de kolonieën telt.
Accurate celtellingen zijn essentieel om de detectielimieten kwantitatief te bepalen. Het is belangrijk om alle verdunningen met grote zorgvuldigheid te maken met behulp van gekalibreerde micropipetten en alle tellingen te bevestigen door optische dichtheid, plateren en directe telling in de Petroff-Hausser kamer. Om de gegevens voor de aanwezigheid van bacteriën in de verkregen hologramvideo's te analyseren, voert u medium gesubstraheerd filteren uit door de beelden eerst om te zetten in een 32-bits formaat.
Bereken vervolgens de mediane pixelwaarde. Trek ten slotte deze mediane waarde af van elke respectieve pixel om stationaire artefacten in het hologram te elimineren. Tel vervolgens handmatig het aantal zichtbare gebiedsringen en scherpgestelde cellen.
Elke reeks hologrammen gaat gepaard met een tijdstempelbestand. Gebruik het tijdstempelbestand om de totale hoeveelheid monster te berekenen die werd gepompt op het moment dat het beeld werd vastgelegd. Bereken vervolgens de celdichtheid door het totale aantal gedetecteerde cellen te delen door het totale volume van het beeldvormende monster.
Gemiddeld vijf tot 10 frames voor nauwkeurige statistieken. Deze plot toont de voorspelde cellen per gezichtsveld op basis van een monstervolume van 365 micrometer bij 365 micrometer bij één millimeter. Voor concentraties waarbij het aantal cellen per gezichtsveld onder één valt, zijn meerdere beelden vereist om detectie te bereiken.
Dit is een DHM-hologramreeks van een Serratia marcescens-cultuur bij 2.100 cellen per milliliter gemeten door platetelling. De reeks toont ongeveer één cel elke één tot twee seconden, wat een uitstekende overeenkomst is met de voorspelling. En dit is een andere DHM-hologramreeks van een Serratia marcescens-cultuur bij 620 cellen per milliliter gemeten door platetelling.
Deze reeks toont ongeveer één cel elke zes tot zeven seconden. Wanneer u digitale holografische microscopie gebruikt om cellen af te beelden, vergeet dan niet om filtersterilisatietechnieken te gebruiken bij de voorbereiding van alle oplossingen. Dit voorkomt dat deeltjes in het instrument worden gebracht.
Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om gezonde celculturen voor te bereiden en extra groeimedium, platen en motiliteitsmedium bij de hand te hebben. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals fluorescente kleuring, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals het percentage cellen dat levend is versus dood. Na de ontwikkeling ervan heeft deze techniek de weg geëffend voor onderzoekers op het gebied van microbiologie om driedimensionale beweging in gekweekte cellen en omgevingsmonsters te onderzoeken.
Na het bek
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel bespreekt het gebruik van digitale holografische microscopie (DHM) voor het detecteren van micro-organismen bij lage dichtheden. DHM biedt een volumetrische beeldtechniek die traditionele microscopie overtreft in gevoeligheid en real-time analyse.
Belangrijkste Studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Microbiologie
- Beeldtechnieken
- Pathogeendetectie
Achtergrond
- Digitale holografische microscopie maakt beeldvorming van dikkere monsters mogelijk dan lichtveldmicroscopie.
- De techniek richt zich op de nabewerking van monsters, wat de bruikbaarheid ervan verbetert.
- DHM kan onmiddellijk driedimensionale informatie leveren.
- Deze methode is vooral nuttig voor het detecteren van lage concentraties bacteriën.
Doel van het Onderzoek
- Om de effectiviteit van DHM bij het detecteren van micro-organismen op lage niveaus te demonstreren.
- Om de toepassingen ervan in biologische en kosmologische onderzoeken te verkennen.
- Om het potentieel te beoordelen voor het diagnosticeren van infecties in klinische omgevingen.
Gebruikte Methoden
- Gebruik van digitale holografische microscopie voor real-time beeldvorming.
- Vergelijking met traditionele methoden zoals optische dichtheidsmetingen en plaattellingen.
- Initiële spectrofotometrische metingen van bacterieculturen.
- Het volgen en tellen van micro-organismen in verschillende monsters.
Belangrijkste Resultaten
- DHM identificeerde en volgde met succes micro-organismen bij zeer lage dichtheden.
- De resultaten toonden een hogere gevoeligheid in vergelijking met traditionele microscopiemethoden.
- De techniek leverde waardevolle inzichten in bacterieel gedrag.
- Mogelijke toepassingen in het detecteren van pathogenen in water en klinische monsters werden benadrukt.
Conclusies
- Digitale holografische microscopie is een veelbelovende tool voor microbiologisch onderzoek.
- De techniek kan de mogelijkheden voor pathogenendetectie aanzienlijk verbeteren.
- Toekomstige toepassingen kunnen zich uitstrekken naar verschillende gebieden, inclusief klinische diagnostiek.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
Digital holographic microscopy (DHM) enables real-time, label-free detection of microorganisms at low concentrations, addressing a critical bottleneck in pharmaceutical quality control and environmental monitoring. By providing volumetric imaging without staining or incubation delays, DHM supports rapid go/no-go decisions in bioprocessing and reduces reliance on culture-based methods. This capability enhances predictive confidence in contamination risk assessment across liquid formulations, water systems, and in-process samples.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables label-free observation of microbial motility and morphology to support functional characterization in early target de-risking.
- Operational Value: Eliminates need for fluorescent tags or fixation, preserving native cellular behavior during hypothesis testing.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides quantitative, real-time cell density measurements from hologram analysis to enable robust assay standardization.
- Operational Value: Supports continuous monitoring of microbial growth or inhibition in motility media without sampling artifacts.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates detection of low-abundance contaminants in biologics or cell therapy intermediates where traditional methods lack sensitivity.
- Operational Value: Enables process-adjacent monitoring using sterile fluid paths, reducing off-line testing and accelerating release timelines.
Pipeline & Workflow Integration
DHM fits within the discovery-to-preclinical continuum by offering a real-time, non-destructive readout for microbial detection that complements endpoint plating and genomic methods. It supports early-stage bioprocess monitoring where rapid feedback is essential for maintaining sterile conditions.
- Discovery Biology: Enables 3D tracking of microbial behavior in response to compounds or environmental stressors without perturbing native physiology.
- Screening: Delivers label-free, quantitative output suitable for high-content screening of antimicrobial compounds or process conditions.
- Analytics: Generates cell density metrics via hologram frame analysis and volumetric sampling, enabling statistical comparison across conditions.
- Translational Research: Supports continuity from bench to process by detecting low-level microbial presence in clinically relevant matrices like buffer or media.
- Enterprise Reuse: Represents a platform-capable technique adaptable across multiple microbial strains and sample types with minimal reconfiguration.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases detection confidence for low-concentration microorganisms, reducing false negatives in release testing.
- Operational Value: Cuts time-to-result from days (plating) to minutes, enabling real-time process intervention.
- Strategic Value: Reduces biological risk in late-stage development by improving early contamination surveillance.
- Portfolio Impact: Supports risk-based sampling strategies and informed go/no-go decisions in technology transfer and scale-up.
Implementation Considerations
- Requires expertise in holography principles, image processing, and microbial enumeration techniques.
- Needs stable illumination source, camera, and sample chamber with sterile fluid handling compatibility.
- Demands standardized protocols for hologram acquisition, background subtraction, and cell counting across operators.
- Must account for particle interference and motility effects when adapting to complex formulations or environmental samples.
- Limited by field of view and concentration range, necessitating sufficient sampling volume for rare event detection at very low densities.
