Kwantificeren van micro-organismen in lage concentraties, met behulp van digitale holografische microscopie (DHM)
1 november 2017
Digitale holografische microscopie (DHM) is een volumetrische techniek waarmee imaging monsters die 50-100 X dikker dan helderveld microscopie bij vergelijkbare resolutie, met scherpstellen uitgevoerd na verwerking. Hier DHM wordt gebruikt voor het identificeren, tellen, en bijhouden van micro-organismen bij zeer lage dichtheden en vergeleken met metingen van de optische dichtheid, kiemgetal, en directe.
Het algemene doel van dit experiment is om de detectie van micro-organismen op zeer lage niveaus te demonstreren met behulp van digitale holografische microscopie. Deze techniek is gevoeliger dan traditionele lichtmicroscopie en biedt realtime informatie over bacteriële gedragingen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen op biologische en kosmologische gebieden, zoals het zoeken naar pathogene organismen in water of leven binnen ons zonnestelsel op ijzige manen.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat DHM een volumetrische techniek is, wat betekent dat we driedimensionale informatie over ons monster onmiddellijk kunnen vastleggen zonder dat we fysiek opnieuw hoeven te focussen. De implicaties van deze techniek strekken zich uit naar de diagnose van infecties in de bloedbaan of het hersenvocht vanwege het vermogen om lage bacterieconcentraties te detecteren. Om met deze procedure te beginnen, neem op de dag van het experiment een spectrofotometrische meting van de bacteriële mastercultuur die naar verwachting in het bereik van 0,6 tot 0,7 ligt.
Neem vervolgens een monster van de mastercultuur en tel de cellen direct met behulp van een Petroff-Hausser telkamer om zowel levende als dode cellen te tellen. Breng een monster van 10 microliter van de onverdunde cultuur over met een micropipet naar de kamer. Beeld het af onder een microscoop met een hoog droog objectief met fasecontrast.
Tel vervolgens de bacteriën in ten minste 20 vierkantjes en bereken het gemiddelde. Bereken de concentratie als het gemiddelde van 20 vierkantjes vermenigvuldigd met de verdunningsfactor. Om alleen levende cellen te tellen, maak een seriële verdunning van elk van de geselecteerde bacteriemonsters met steriele 0,9% zoutoplossing door 20 microliter van de bacterieoplossing over te brengen naar een andere put en deze te verdunnen met 180 microliter zoutoplossing.
Herhaal de procedure tot de laagste concentratie ongeveer 10 tot 3 cellen per milliliter is. Neem vervolgens 100 microliter van de monsters van ten minste twee verdunningen en plateer ze op de geschikte vaste mediaplaten. Verspreid ze met een steriele verspreider en voer ten minste drie replica's van elke verdunning uit.
Incubeer ze daarna overnacht of tot de kolonieën groeien op een geschikte temperatuur. Tel vervolgens de kolonieën. Bereken de kolonievormingseenheden en breng het gemiddelde over de replica's samen.
Maak in deze procedure seriële verdunningen van de mastercultuur voor DHM en post-DHM telling van CFU op Lysogeniebouillon mediaplaten. Verdun de bacteriën in 25 milliliter van een minimaal medium dat bewegingsvrijheid bevordert maar celdeling remt, zodat de concentratie van cellen niet aanzienlijk verandert tijdens het experiment. Om DHM-video's op te nemen, trek met een steriele spuit ongeveer 10 milliliter van de verdunning van belang naar binnen.
Verbind vervolgens de spuit met de DHM-monsterkamer met behulp van steriele fittingen en slangen. Laat het monster continu door de monsterkamer stromen met behulp van een spuitpomp. Terwijl het monster door de monsterkamer stroomt, verwerft u opeenvolgende hologrammen met een geschikte framesnelheid.
Laat voldoende tijd verstrijken om de volledige 10 milliliter monster door de DHM te laten stromen. Om ervoor te zorgen dat bacteriën niet groeien of afsterven tijdens de experimenten, inoculeer de verrijkte mediaplaten met 100 microliter van het gebruikte medium na de DHM-beeldopname door het met een steriele verspreider te verspreiden. Incubeer ze vervolgens 24 uur op de juiste temperatuur voordat u de kolonieën telt.
Accurate celtellingen zijn essentieel om de detectielimieten kwantitatief te bepalen. Het is belangrijk om alle verdunningen met grote zorgvuldigheid te maken met behulp van gekalibreerde micropipetten en alle tellingen te bevestigen door optische dichtheid, plateren en directe telling in de Petroff-Hausser kamer. Om de gegevens voor de aanwezigheid van bacteriën in de verkregen hologramvideo's te analyseren, voert u medium gesubstraheerd filteren uit door de beelden eerst om te zetten in een 32-bits formaat.
Bereken vervolgens de mediane pixelwaarde. Trek ten slotte deze mediane waarde af van elke respectieve pixel om stationaire artefacten in het hologram te elimineren. Tel vervolgens handmatig het aantal zichtbare gebiedsringen en scherpgestelde cellen.
Elke reeks hologrammen gaat gepaard met een tijdstempelbestand. Gebruik het tijdstempelbestand om de totale hoeveelheid monster te berekenen die werd gepompt op het moment dat het beeld werd vastgelegd. Bereken vervolgens de celdichtheid door het totale aantal gedetecteerde cellen te delen door het totale volume van het beeldvormende monster.
Gemiddeld vijf tot 10 frames voor nauwkeurige statistieken. Deze plot toont de voorspelde cellen per gezichtsveld op basis van een monstervolume van 365 micrometer bij 365 micrometer bij één millimeter. Voor concentraties waarbij het aantal cellen per gezichtsveld onder één valt, zijn meerdere beelden vereist om detectie te bereiken.
Dit is een DHM-hologramreeks van een Serratia marcescens-cultuur bij 2.100 cellen per milliliter gemeten door platetelling. De reeks toont ongeveer één cel elke één tot twee seconden, wat een uitstekende overeenkomst is met de voorspelling. En dit is een andere DHM-hologramreeks van een Serratia marcescens-cultuur bij 620 cellen per milliliter gemeten door platetelling.
Deze reeks toont ongeveer één cel elke zes tot zeven seconden. Wanneer u digitale holografische microscopie gebruikt om cellen af te beelden, vergeet dan niet om filtersterilisatietechnieken te gebruiken bij de voorbereiding van alle oplossingen. Dit voorkomt dat deeltjes in het instrument worden gebracht.
Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om gezonde celculturen voor te bereiden en extra groeimedium, platen en motiliteitsmedium bij de hand te hebben. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals fluorescente kleuring, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals het percentage cellen dat levend is versus dood. Na de ontwikkeling ervan heeft deze techniek de weg geëffend voor onderzoekers op het gebied van microbiologie om driedimensionale beweging in gekweekte cellen en omgevingsmonsters te onderzoeken.
Na het bek
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel bespreekt het gebruik van digitale holografische microscopie (DHM) voor het detecteren van micro-organismen bij lage concentraties. DHM biedt een volumetrische beeldvormingstechniek die traditionele microscopie overtreft in gevoeligheid en real-time analyse.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Microbiologie
- Beeldvormingstechnieken
- Pathogeendetectie
Achtergrond
- Digitale holografische microscopie maakt het mogelijk om dikkere monsters af te beelden dan met helderveldmicroscopie.
- De techniek richt zich op monsters na de verwerking, wat de bruikbaarheid vergroot.
- DHM kan onmiddellijk driedimensionale informatie verschaffen.
- Deze methode is bijzonder nuttig voor het detecteren van lage concentraties bacteriën.
Doel van de studie
- Om de effectiviteit van DHM aan te tonen bij het detecteren van micro-organismen bij lage concentraties.
- Om de toepassingen ervan in biologisch en kosmologisch onderzoek te verkennen.
- Om het potentieel voor het diagnosticeren van infecties in klinische omgevingen te beoordelen.
Gebruikte methoden
- Gebruik van digitale holografische microscopie voor real-time beeldvorming.
- Vergelijking met traditionele methoden zoals optische dichtheidsmetingen en plaat tellingen.
- Initiële spectrophotometrische metingen van bacteriële culturen.
- Het volgen en tellen van micro-organismen in verschillende monsters.
Belangrijkste resultaten
- DHM identificeerde en volgde micro-organismen met succes bij zeer lage dichtheden.
- De resultaten toonden een hogere gevoeligheid aan in vergelijking met traditionele microscopie-methoden.
- De techniek leverde waardevolle inzichten in het gedrag van bacteriën.
- Potentiële toepassingen bij het detecteren van pathogenen in water en klinische monsters werden benadrukt.
Conclusies
- Digitale holografische microscopie is een veelbelovend instrument voor microbiologisch onderzoek.
- De techniek kan de mogelijkheden voor het detecteren van pathogenen aanzienlijk verbeteren.
- Toekomstige toepassingen kunnen worden uitgebreid naar diverse gebieden, waaronder klinische diagnostiek.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Digitale holografische microscopie (DHM) maakt real-time, labelvrije detectie van micro-organismen bij lage concentraties mogelijk, waarmee een kritieke flessenhals in de farmaceutische kwaliteitscontrole en milieumonitoring wordt aangepakt. Door volumetrische beeldvorming te bieden zonder kleuring of incubatievertragingen, ondersteunt DHM snelle go/no-go beslissingen in bioprocessing en vermindert het de afhankelijkheid van kweekgebaseerde methoden. Deze mogelijkheid vergroot het voorspellende vertrouwen bij de beoordeling van contaminatierisico's in vloeibare formuleringen, watersystemen en in-process monsters.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt labelvrije observatie van microbiële motiliteit en morfologie mogelijk ter ondersteuning van functionele karakterisering bij vroegtijdige risicoreductie van targets.
- Operationele waarde: Elimineert de noodzaak voor fluorescente labels of fixatie, waardoor het natuurlijke cellulaire gedrag tijdens het testen van hypothesen behouden blijft.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Levert kwantitatieve real-time metingen van de celdichtheid via hologramanalyse om een robuuste standaardisatie van assays mogelijk te maken.
- Operationele waarde: Ondersteunt continue monitoring van microbiële groei of inhibitie in motiliteitsmedia zonder bemonsteringsartefacten.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Vergemakkelijkt de detectie van contaminanten met een lage abundantie in biologische geneesmiddelen of tussenproducten voor celtherapie waar traditionele methoden onvoldoende gevoelig zijn.
- Operationele waarde: Maakt monitoring naast het proces mogelijk met behulp van steriele vloeistofpaden, waardoor offline testen worden verminderd en de tijdlijnen voor vrijgave worden versneld.
Integratie van pipeline en workflow
DHM past binnen het continuüm van ontdekking tot preklinisch onderzoek door een real-time, niet-destructieve uitlezing voor microbiële detectie te bieden die complementair is aan endpoint-plating en genomische methoden. Het ondersteunt bioprocesmonitoring in een vroeg stadium, waarbij snelle feedback essentieel is voor het handhaven van steriele omstandigheden.
- Discovery Biology: Maakt 3D-tracking van microbieel gedrag in reactie op verbindingen of omgevingsstressoren mogelijk zonder de natuurlijke fysiologie te verstoren.
- Screening: Levert labelvrije, kwantitatieve output die geschikt is voor high-content screening van antimicrobiële verbindingen of procescondities.
- Analytics: Genereert metrics voor celdichtheid via analyse van hologramframes en volumetrische bemonstering, waardoor statistische vergelijkingen tussen condities mogelijk zijn.
- Translationeel onderzoek: Ondersteunt de continuïteit van laboratorium naar proces door de detectie van een lage microbiële aanwezigheid in klinisch relevante matrices zoals buffers of media.
- Bedrijfsbrede herbruikbaarheid: Vertegenwoordigt een platformwaardige techniek die aanpasbaar is voor meerdere microbiële stammen en monstertypes met minimale herconfiguratie.
Operationele impact & impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt de detectiebetrouwbaarheid voor micro-organismen in lage concentraties, waardoor het aantal fout-negatieven bij vrijgaveonderzoeken wordt verminderd.
- Operationele waarde: Verkort de tijd tot resultaat van dagen (platen) naar minuten, waardoor procesinterventies in realtime mogelijk worden.
- Strategische waarde: Vermindert het biologische risico in de late ontwikkelingsfase door verbeterde surveillance van vroege contaminatie.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risicogebaseerde bemonsteringsstrategieën en geïnformeerde go/no-go-beslissingen bij technologietransfer en opschaling.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in holografische principes, beeldverwerking en technieken voor microbiële enumeratie.
- Vereist een stabiele lichtbron, camera en een monsterkamer die compatibel is met steriele vloeistofafhandeling.
- Vraagt om gestandaardiseerde protocollen voor hologramaquistie, achtergrondsubtractie en celtelling tussen verschillende operators.
- Moet rekening houden met interferentie van deeltjes en motiliteitseffecten bij aanpassing aan complexe formuleringen of milieu-monsters.
- Beperkt door het gezichtsveld en het concentratiebereik, waardoor een voldoende bemonsteringsvolume nodig is voor de detectie van zeldzame gebeurtenissen bij zeer lage dichtheden.
Veelgestelde vragen over biofarmacie
Chapters in this video
0:05
Title
0:56
Growth and Enumeration of Bacteria
2:38
Preparation of Highly Dilute Samples for DHM and Recording DHM Videos
4:06
Calculations of Cell Density and Limits of Detection
5:22
Results: Growth Curves and Representative DHM Data
6:14
Conclusion
