Name: Kwantificeren van micro-organismen in lage concentraties, met behulp van digitale holografische microscopie (DHM) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Leer digitale holografische microscopie voor het detecteren van micro-organismen in lage concentraties. Deze volumetrische techniek biedt real-time driedimensionale beeldvorming met hogere gevoeligheid dan traditionele microscopie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs erkennen de Gordon en Betty Moore Foundation subsidies 4037 en 4038 aan het California Institute of Technology voor financiering van dit werk.

1. groei en opsomming van bacteriën Opmerking: Dit geldt voor bijna elke bacteriële stam geteeld in de passende middellange 36. In ons voorbeeld gebruiken we drie stammen: Serratia marcescens als een gemeenschappelijk, eenvoudig identificeerbare lab stam; en een kleinere, zeer motile milieu stam, Shewanella oneidensis heer-1. Als u wilt vergelijken detectie van motile vs. niet-sporenvormende cellen, niet-sporenvormende Shewanella mutant, Δ FlgM, wordt ook gebruikt voor vergelijking 37. Alle stammen worden gekweekt in lysogenie Bouillon (LB).
<ol><li>Voorbereiden steriele LB medium (per liter gedistilleerd water: 10 g bacto trypton, 5 g bacto Gist, 10 g NaCl; filter of autoclaaf). Bereiden standaard 100 mm diameter LB-agar platen (zelfde recept als medium plus 15 g per liter agar; autoclaaf (121 ° C, 20 min) te steriliseren en giet wanneer koel genoeg om te behandelen). Opslag medium en platen in ijskast.</li>
	<li>De dag vóór het experiment zaad 5-6 mL &#34; Master &#34; kweekmedium uit een vers bacteriële kolonie, met behulp van de juiste bioveiligheid en steriele techniek. Incubeer op een shaker (120 rpm) bij 30 ° C ~ 12 h. incubatietijd zullen afhankelijk van de stam- en groeisnelheid bij. In onze experimenten, de stammen van de Shewanella worden ge¨ uncubeerd 12 uur; echter, Serratia wordt geoogst na 8 uur, om ervoor te zorgen dat de cultuur zal worden exposeren medio-logaritmische groei.</li>
	<li>De dag van het experiment, neem een spectrofotometrische lezing (OD 600) van de bacteriële cultuur, die wordt verondersteld te worden in het bereik van 0,6 naar 0,7-Master. Het moet in de logaritmische groeifase (zoals eerder bepaald). Als niet, subcultuur 100 µL in 5 mL van medium en toestaan van celgroei naar de mid log fase.</li>
	<li>Neemt een monster van de meester cultuur en de cellen direct met behulp van een Petroff-Hausser tellen kamer tellen. Dit zowel live als dode cellen zal opsommen.
	<ol><li>Extract van een monster 10 µL van de onverdunde cultuur met een micropipet en overdracht in de bedwelmingsruimte.</li>
		<li>Afbeelding onder een hoge-droge objectieve Microscoop (40 X of 63 X, NA 0,7 - 0.8) met fase contrast.</li>
		<li>Rekenen de bacteriën in ten minste 20 vierkanten en gemiddelde. 
		Opmerking: Tellen alleen die bacteriën die volledig binnen een vierkant en alleen die kruising over de bovenkant en linker grenzen (of onderkant en recht, als u liever). Als vierkantjes zijn gescheiden door verschillende lijnen, kies een als een grens.</li>
		<li>Berekenen concentratie als het gemiddelde van 20 vierkanten x verdunningsfactor. Merk op dat directe graven werken niet goed voor concentraties &#60; 10 7 / mL.</li>
	</ol></li> <li>Maken seriële verdunningen van de cultuur voor het tellen van de kolonie-vormende eenheden (kve). Dit levende cellen alleen zal opsommen.
	<ol><li>Maken een seriële verdunning van elk van de geselecteerde bacteriële monsters met een steriele zoutoplossing 0,9% oplossing. Breng 20 µL van de bacteriële oplossing en Verdun het met 180 µL zoutoplossing. Herhaal deze actie tot de laagste concentratie ~ 10 3 cellen/mL.</li>
		<li>Nemen 100 µL van ten minste twee verdunningen-voorgesteld zijn 10 3 en 10 4 /mL &#8212; en plaat op een passende vaste voedingsbodems plaat. Bestrijk met een steriele strooier. Uitvoeren van ten minste 3 replicatieonderzoeken van elke verdunning.</li>
		<li>Broeden op een passende temperatuur voor uw bacteriën, 's nachts of tot kolonies groeien.</li>
		<li>Tellen kolonies en berekenen van kolonievormende eenheden (kve) volgens (# van kolonies x verdunningsfactor) / volume verguld = CFU/mL. CFU gemiddelden over de duplobepalingen.</li>
	</ol></li></ol> 2. Bereiding van de monsters sterk verdund voor DHM <ol><li>Make seriële verdunningen van de meester cultuur voor DHM en post-DHM tellen van de kolonie-vormende eenheden op LB media platen (zie 1.4.1 - 1.4.4). Uitvoeren van deze dubbel-blinde, zodat de persoon die van de opnamen niet op de hoogte van de concentratie in elk monster gemeten is.
	<ol><li>De bacteriën verdund in 10-15 mL van een minimale voedingsbodem die zal aanmoediging motiliteit (naar gelang van het geval), maar remmen de celdeling, zodat de concentratie van cellen niet merkbaar tijdens het experiment verandert. Dit kan worden zoutoplossing 0,9% of een meer specifieke motiliteit medium. Bijvoorbeeld, als met behulp van Escherichia coli, moet beweeglijkheid medium bevatten EDTA 38. Voor deze voorbeelden, we gebruiken 0.9% zout.</li>
	</ol></li></ol> 3. DHM Videos opnemen <ol><li>met een steriele injectiespuit, trek in ongeveer 10 mL van de verdunning van belang.</li>
	<li>Verbinden de spuit de DHM-monsterkamer met behulp van steriele fittingen en buizen. 
	Opmerking: Een op maat gemaakte microfluidic kamer werd gebouwd zodat de consistente stroom van monster door de optische weglengte van het instrument. Zie het gedeelte ' resultaten ' voor meer informatie. Voorafgaand aan het experiment, alle onderdelen van de monsterkamer moeten worden gesteriliseerd met autoclaaf.</li>
	<li>Stromen het monster uit de spuit via de monsterkamer continu gebruik maakt van een spuitpomp. 
	Opmerking: Juiste debiet afhankelijk fluidic kanaal afmetingen, gewenste doorvoer, alsmede gegevens overname beperkingen.</li>
	<li>Als het monster is stroomde door de monsterkamer, verwerven hologrammen achter elkaar op een juiste framesnelheid. Een tijdstempel bestand wordt gemaakt welke logboeken de tijd van elke afbeelding vastleggen om later tijdens de data-analyse (protocol sectie 4) worden gebruikt. Het verkrijgen van alle hologrammen bij omgevingstemperatuur (23° C). Hologrammen opnemen door het uitvoeren van een vooraf geschreven C++ uitvoerbaar bestand geboden door de camerafabrikant. 
	Opmerking: Juiste framesnelheid afhankelijk van het debiet gekozen. Voor dit experiment, is het aanbevolen om gebruik van een framesnelheid, zodanig dat een bacterie beeld zou worden &#62; 2 keer als zij over het instrument reisden &#39; s gezichtsveld.</li>
	<li>Voldoende tijd voor de hele 10 mL van het monster te worden stroomde door de DHM.</li>
	<li>Om ervoor te zorgen dat bacteriën niet groeien of sterven tijdens de experimenten, beënten verrijkt media platen met 100 µL van de verbruikte media post-DHM Fotolader. Bestrijk met een steriele strooier en Incubeer bij juiste temp gedurende 24 uur; Telling kolonies aanwezig.</li>
</ol> 4. Berekening van de celdichtheid en grenzen van opsporing <ol><li>met de verworven hologram video's, het analyseren van de gegevens voor de aanwezigheid van bacteriën.
	<ol><li>De mediane pixelwaarde berekend voor een tijdreeks van hologrammen dan deze gemiddelde waarde van elke respectieve pixel te elimineren stationaire artefacten in het hologram aftrekken. Dit kan worden gedaan in ImageJ door de volgende stappen uit te voeren: <ol><li>omzetten in 32-bits (Image-Type-32 bits)</li> <li>Bereken de mediaan (Image-Stack-Zproject-mediaan)</li> <li>aftrekken van de mediaan van de rest van de stapel ( Process-ImageCalculator-Subtract)</li></ol></li> <li>het aantal zichtbare luchtige ringen en in-focus cellen tellen handmatig. In ImageJ, dit wordt gedaan door te wijzen op de objecten met het gereedschap Ankerpunt.</li>
		<li>Elke reeks van hologrammen zal vergezeld gaan van een tijdstempel bestand (opgenomen op tijdstip van verwerving van het hologram). Gebruik het bestand tijdstempel voor het berekenen van de totale hoeveelheid monster gepompt destijds de afbeelding werd gevangengenomen.</li>
	</ol></li> <li>De celdichtheid berekenen door het verdelen van het totale aantal cellen gedetecteerd door de totale hoeveelheid monster beeld. Gemiddelde van 5-10 frames voor nauwkeurige statistieken.</li>
</ol> 5. Afbeelding van wederopbouw Amplitude en fase <ol><li>Kies representatieve video's met 10-200 cellen per frame. Laden van rauwe (niet mediaan-afgetrokken) hologrammen in de wederopbouw-software (voorbeelden: ImageJ numerieke Propagation 39; SHAMPOO [GitHub]).
	<ol><li>Met behulp van ImageJ, ga naar OD-numerieke Propagation-numerieke diffractie.</li>
		<li>Bij de opdrachtprompt, tekenen een Fourier-masker om te kiezen van de reële- of virtueel beeld en elimineren alle functies sinusvormige lawaai.</li>
		<li>Amplitude en fase bij passende z-stappen door het invoeren van de wederopbouw afstand reconstrueren.</li>
	</ol></li> <li>Mediaan aftrekken de amplitude gegevens geluiddempingsinrichtingen zoals in 4.1.1.</li>
	<li>Plot gegevens als een 3D-kubus of projectie. Ga naar Plugins &#8212; Volume Viewer.</li>
</ol>

<ol><li>Akineden, O., Weirich, S., Abdulmawjood, A., Failing, K., Buelte, M. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s12161-014-9918-3">Application of a Fluorescence Microscopy Technique for Detecting Viable Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis Cells in Milk.</a> Food Anal. Methods. 8, 499-506 (2015).</li>
<li>Deibl, J., Paulsen, P., Bauer, F. Rapid enumeration of total aerobic microbial counts on meat and in meat products by means of the direct epifluorescence filter technique. Wien Tierarztl Monat. 85, 327-333 (1998).</li>
<li>Huang, J., Li, Y., Slavik, M. F., Tao, Y., Huff, G. R. <a target="_blank" href="http://agris.fao.org/agris-search/search.do?recordID=US201302902942">Identification and enumeration of Salmonella on sample slides of poultry carcass wash water using image analysis with fluorescent microscopy.</a> Transactions of the Asae. 42, 267-273 (1999).</li>
<li>Durtschi, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+sensitivity+of+bacterial+detection+in+cerebrospinal+fluid+by+fluorescent+staining+on+low-fluorescence+membrane+filters%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Increased sensitivity of bacterial detection in cerebrospinal fluid by fluorescent staining on low-fluorescence membrane filters.</a> J Med Microbiol. 54, 843-850 (2005).</li>
<li>Panicker, R. O., Soman, B., Saini, G., Rajan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Review+of+Automatic+Methods+Based+on+Image+Processing+Techniques+for+Tuberculosis+Detection+from+Microscopic+Sputum+Smear+Images%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Syst%22%5BJournal%5D)">A Review of Automatic Methods Based on Image Processing Techniques for Tuberculosis Detection from Microscopic Sputum Smear Images.</a> J Med Syst. 40, (2016).</li>
<li>Riepl, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applicability+of+solid-phase+cytometry+and+epifluorescence+microscopy+for+rapid+assessment+of+the+microbiological+quality+of+dialysis+water%5BTitle%5D)+AND+%22Nephrol+Dial+Transplant%22%5BJournal%5D)">Applicability of solid-phase cytometry and epifluorescence microscopy for rapid assessment of the microbiological quality of dialysis water.</a> Nephrol Dial Transplant. 26, 3640-3645 (2011).</li>
<li>Hwang, C. Y., Cho, B. C. <a target="_blank" href="http://www.int-res.com/abstracts/ame/v30/n1/p1-9/">Virus-infected bacteria in oligotrophic open waters of the East Sea, Korea.</a> Aquat Microb Ecol. 30, 1-9 (2002).</li>
<li>Kepner, R. L., Pratt, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Fluorochromes+for+Direct+Enumeration+of+Total+Bacteria+in+Environmental-Samples+-+Past+and+Present%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Use of Fluorochromes for Direct Enumeration of Total Bacteria in Environmental-Samples - Past and Present.</a> Microbiol Rev. 58, 603-615 (1994).</li>
<li>Queric, N. V., Soltwedel, T., Arntz, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+a+rapid+direct+viable+count+method+to+deep-sea+sediment+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Meth%22%5BJournal%5D)">Application of a rapid direct viable count method to deep-sea sediment bacteria.</a> J Microbiol Meth. 57, 351-367 (2004).</li>
<li>Prieto-Ballesteros, O., Vorobyova, E., Parro, V., Rodriguez Manfredi, J. A., Gomez, F. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0273117710007374">Strategies for detection of putative life on Europa.</a> Adv Space Res. 48, 678-688 (2011).</li>
<li>Gleeson, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosignature+Detection+at+an+Arctic+Analog+to+Europa%5BTitle%5D)+AND+%22Astrobiology%22%5BJournal%5D)">Biosignature Detection at an Arctic Analog to Europa.</a> Astrobiology. 12, 135-150 (2012).</li>
<li>Carr, C. E., Zuber, M. T., Ruvkun, G., Ieee, <a target="_blank" href="https://www.infona.pl/resource/bwmeta1.element.ieee-art-000006497129">2013 Ieee Aerospace Conference IEEE Aerospace Conference Proceedings</a>. , (2013).</li>
<li>Konstantinidis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0094576514003610">A lander mission to probe subglacial water on Saturn's moon Enceladus for life.</a> Acta Astronautica. 106, 63-89 (2015).</li>
<li>McKay, C. P., Anbar, A. D., Porco, C., Tsou, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follow+the+Plume%3A+The+Habitability+of+Enceladus%5BTitle%5D)+AND+%22Astrobiology%22%5BJournal%5D)">Follow the Plume: The Habitability of Enceladus.</a> Astrobiology. 14, 352-355 (2014).</li>
<li>Hoover, R. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHoover%2C+RB+%22Instruments%2C+Methods%2C+and+Missions+for+Astrobiology+Xvii%22">Instruments, Methods, and Missions for Astrobiology Xvii</a>. Hoover, R. B., Levin, G. V., Rozanov, A. Y., Wickramasinghe, N. C. , Vol. 9606 Proceedings of SPIE (2015).</li>
<li>Handelsman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metagenomics%3A+application+of+genomics+to+uncultured+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%3A+MMBR%22%5BJournal%5D)">Metagenomics: application of genomics to uncultured microorganisms.</a> Microbiol Mol Biol Rev: MMBR. 68, 669-685 (2004).</li>
<li>Lebaron, P., Parthuisot, N., Catala, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+blue+nucleic+acid+dyes+for+flow+cytometric+enumeration+of+bacteria+in+aquatic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparison of blue nucleic acid dyes for flow cytometric enumeration of bacteria in aquatic systems.</a> Appl Environ Microbiol. 64, 1725-1730 (1998).</li>
<li>Marie, D., Partensky, F., Jacquet, S., Vaulot, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+and+cell+cycle+analysis+of+natural+populations+of+marine+picoplankton+by+flow+cytometry+using+the+nucleic+acid+stain+SYBR+Green+I%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Enumeration and cell cycle analysis of natural populations of marine picoplankton by flow cytometry using the nucleic acid stain SYBR Green I.</a> Appl Environ Microbiol. 63, 186-193 (1997).</li>
<li>Noble, R. T., Fuhrman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.int-res.com/articles/ame/14/a014p113.pdf">Use of SYBR Green I for rapid epifluorescence counts of marine viruses and bacteria.</a> Aquat Microb Ecol. 14, 113-118 (1998).</li>
<li>Forster, S., Snape, J. R., Lappin-Scott, H. M., Porter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+fluorescent+gram+staining+and+activity+assessment+of+activated+sludge+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous fluorescent gram staining and activity assessment of activated sludge bacteria.</a> Appl Environ Microbiol. 68, 4772-4779 (2002).</li>
<li>Lauer, B. A., Reller, L. B., Mirrett, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+Of+Acridine-Orange+And+Gram+Stains+For+Detection+Of+Microorganisms+In+Cerebrospinal-Fluid+And+Other+Clinical+Specimens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparison Of Acridine-Orange And Gram Stains For Detection Of Microorganisms In Cerebrospinal-Fluid And Other Clinical Specimens.</a> J Clin Microbiol. 14, 201-205 (1981).</li>
<li>Mason, D. J., Shanmuganathan, S., Mortimer, F. C., Gant, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescent+gram+stain+for+flow+cytometry+and+epifluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A fluorescent gram stain for flow cytometry and epifluorescence microscopy.</a> Appl Environ Microbiol. 64, 2681-2685 (1998).</li>
<li>Saida, H., Ytow, N., Seki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photometric+application+of+the+Gram+stain+method+to+characterize+natural+bacterial+populations+in+aquatic+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Photometric application of the Gram stain method to characterize natural bacterial populations in aquatic environments.</a> Appl Environ Microbiol. 64, 742-747 (1998).</li>
<li>Sizemore, R. K., Caldwell, J. J., Kendrick, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternate+Gram+Staining+Technique+Using+A+Fluorescent+Lectin%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Alternate Gram Staining Technique Using A Fluorescent Lectin.</a> Appl Environ Microbiol. 56, 2245-2247 (1990).</li>
<li>Bitton, G., Dutton, R. J., Foran, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Rapid+Technique+For+Counting+Microorganisms+Directly+On+Membrane+Filters%5BTitle%5D)+AND+%22Stain+Technology%22%5BJournal%5D)">New Rapid Technique For Counting Microorganisms Directly On Membrane Filters.</a> Stain Technology. 58, 343-346 (1983).</li>
<li>Broadaway, S. C., Barton, S. A., Pyle, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+staining+and+enumeration+of+small+numbers+of+total+bacteria+in+water+by+solid-phase+laser+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid staining and enumeration of small numbers of total bacteria in water by solid-phase laser cytometry.</a> Appl Environ Microbiol. 69, 4272-4273 (2003).</li>
<li>Yagupsky, P., Nolte, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+aspects+of+septicemia%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Quantitative aspects of septicemia.</a> Clin Microbiol Rev. 3, 269-279 (1990).</li>
<li>Kang, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+of+single+bacteria+in+unprocessed+blood+using+Integrated+Comprehensive+Droplet+Digital+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Rapid detection of single bacteria in unprocessed blood using Integrated Comprehensive Droplet Digital Detection.</a> Nat Commun. 5, 5427(2014).</li>
<li>Hand, K. P. <a target="_blank" href="https://solarsystem.nasa.gov/docs/Europa_Lander_SDT_Report_2016.pdf">Report of the Europa Lander Science Definition Team</a>. , (2017).</li>
<li>Popescu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+cell+mass+and+growth+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol-Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of cell mass and growth dynamics.</a> Am J Physiol-Cell Physiol. 295, C538-C544 (2008).</li>
<li>Mir, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+measurement+of+cycle-dependent+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Optical measurement of cycle-dependent cell growth.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 13124-13129 (2011).</li>
<li>Rappaz, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+characterization+of+the+fission+yeast+cell+cycle+by+monitoring+dry+mass+with+digital+holographic+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Noninvasive characterization of the fission yeast cell cycle by monitoring dry mass with digital holographic microscopy.</a> J.Biomed Opt. 14, 034049(2009).</li>
<li>Jo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+identification+of+individual+bacteria+using+Fourier+transform+light+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">Label-free identification of individual bacteria using Fourier transform light scattering.</a> Opt. Express. 23, 15792-15805 (2015).</li>
<li>Wallace, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust%2C+compact+implementation+of+an+off-axis+digital+holographic+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">Robust, compact implementation of an off-axis digital holographic microscope.</a> Opt. Express. 23, 17367-17378 (2015).</li>
<li>Lindensmith, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Submersible%2C+Off-Axis+Holographic+Microscope+for+Detection+of+Microbial+Motility+and+Morphology+in+Aqueous+and+Icy+Environments%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">A Submersible, Off-Axis Holographic Microscope for Detection of Microbial Motility and Morphology in Aqueous and Icy Environments.</a> Plos One. 11, e0147700(2016).</li>
<li>Dumas, E. M., Ozenne, V., Mielke, R. E., Nadeau, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+of+CdTe+Quantum+Dots+in+Bacterial+Strains%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans.+NanoBiosci%22%5BJournal%5D)">Toxicity of CdTe Quantum Dots in Bacterial Strains.</a> IEEE Trans. NanoBiosci. 8, 58-64 (2009).</li>
<li>Frisk, A., Jyot, J., Arora, S. K., Ramphal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+functional+characterization+of+flgM%2C+a+gene+encoding+the+anti-sigma+28+factor+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Identification and functional characterization of flgM, a gene encoding the anti-sigma 28 factor in Pseudomonas aeruginosa.</a> J Bacteriol. 184, 1514-1521 (2002).</li>
<li>Adler, J., Templeton, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+environmental+conditions+on+the+motility+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Gen+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The effect of environmental conditions on the motility of Escherichia coli.</a> Journal Gen Microbiol. 46, 175-184 (1967).</li>
<li>Piedrahita-Quintero, P., Castaneda, R., Garcia-Sucerquia, J. <a target="_blank" href="https://www.osapublishing.org/ao/abstract.cfm?uri=ao-54-21-6410">Numerical wave propagation in Image J.</a> Appl Opt. 54, 6410-6415 (2015).</li>
<li>Schnars, U., Jüptner, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+recording+and+numerical+reconstruction+of+holograms%5BTitle%5D)+AND+%22Meas.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Digital recording and numerical reconstruction of holograms.</a> Meas. Sci. Technol. 13, R85(2002).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Numerieke wederopbouw van hologrammen: voor de numerieke wederopbouw van hologrammen, de hoekige spectrum methode (ASM) wordt gebruikt. Het gaat hierbij om de convolutie van het hologram met de Greense functie voor de DHM. De complexe wavefront van de afbeelding op een bepaalde brandvlak kan worden berekend door gebruik te maken van de Fourier convolutie stelling als volgt:
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56343/56343eq2.jpg">(1)
Waar <i...

Bepaling van nauwkeurige bacteriële graven in zeer verdunde monsters is van cruciaal belang in vele toepassingen: een paar voorbeelden zijn water en voedsel kwaliteit analyse1,2,3; opsporing van ziekteverwekkers in het bloed, cerebrospinaal vocht of sputum4,5; productie van farmaceutische producten, met inbegrip van steriel water6; en milieu Gemeenschap analyse in oligotrofe omgevingen zoals de open oceaan en sedimenten7,8,9. Er is ook steeds meer belangstelling in opsporing van mogelijke bestaande microbiële leven op de ijzige manen van Jupiter en Saturnus, met name Europa10,11 en Enceladus12,13, 14, waarvan bekend is dat hebben ondergrond vloeibare oceanen. Omdat er geen missie sinds Viking in 1978 heeft geprobeerd te vinden van overgeleverde leven op een andere planeet, is er beperkte ontwikkeling van technologieën en instrumenten voor bacteriële identificatie en tellen tijdens ruimte missies15.
Traditionele methoden van kiemgetal vinden alleen culturable cellen, die een minderheid van soorten in milieu stammen, soms kunnen vertegenwoordigen &#60; 1%16. Platen vereisen dagen of weken van incubatie voor maximaal succes, afhankelijk van de stam. Epifluorescence microscopie heeft grotendeels plaat graven als de gouden standaard voor snelle en accurate microbiële opsomming vervangen. Nucleic-zuur-labeling fluorescente kleurstoffen zoals 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole-dihydrochloride (DAPI), SYBR Green of acridine oranje die zich aan nucleic zuren binden zijn de typische kleurstoffen gebruikt17,18,19 , hoewel vele studies gebruiken fluorescerende indicatoren van Gram ondertekenen20,21,22,23,24. Met behulp van deze methoden zonder pre concentratie stappen leidt tot detectiegrenzen (LoDs) van ~ 105 cellen per mL. Er zijn verbeteringen in LoD mogelijk gebruik van filtratie. Een vloeibare monster is vacuüm-gefilterd op een membraan, meestal polycarbonaat en ideaal zwart te verminderen achtergrond. Low-achtergrond kleurstoffen zoals de vlekken van DNA bovengenoemde kunnen rechtstreeks worden toegepast op de filter-25. Voor het nauwkeurig tellen met het blote oog, ~ 105 cellen zijn vereist per filter, wat dat voor monsters meer verdund dan ~ 105 cellen per mL betekent, significante steekproef volumes worden verzameld en gefilterd. Laser-scannen apparaten zijn ontwikkeld om systematisch Ontdek alle regio's van de filter en dus vermindering van het aantal cellen die nodig zijn voor het tellen, verlegging van de grenzen van de detectie tot ~ 102 cellen per mL26. Echter, deze zijn niet beschikbaar in de meeste laboratoria, en vereisen geavanceerde hardware zowel als software waarmee deskundige bevestiging dat deeltjes waargenomen zijn bacteriën en niet puin.
Ter referentie, volwassenen met sepsis beginnen meestal met symptomen bij &#60; 100 cellen/mL bloed en zuigelingen op &#60; 10 cellen/mL. Een bloed trekken uit een volwassene neemt 10 mL, en van een kind, 1 mL. PCR gebaseerde methoden worden geremd door de aanwezigheid van menselijke en niet-pathogene flora DNA en door PCR-remmende componenten in het bloed27,28. Ondanks een verscheidenheid van technieken in opkomst blijven culturen de gouden standaard voor de diagnose van infecties van de bloedbaan, vooral in de meer landelijke gebieden of ontwikkelingslanden. Voor de detectie van het leven op andere planeten, kunnen thermodynamische berekeningen schatten het energiebudget voor leven en dus ook de verwachte mogelijk biomassa. 1 - 100 cellen/mL verwachting thermodynamisch redelijk op Europa29. Het kan worden gemakkelijk afgeleid uit deze nummers dat detectie van zeer kleine aantallen cellen in grote hoeveelheden waterige oplossing een belangrijk onopgelost probleem is.
In deze paper, tonen we detectie van Serratia marcescens en Shewanella oneidensis (wild-type en niet-sporenvormende mutant) bij concentraties van 105, 104, 103en 100 cellen/mL met behulp van een off-axis digitale holografische Microscoop (DHM). Het belangrijkste voordeel van DHM over traditionele lichte microscopie is de gelijktijdige beeldvorming van een dikke monstervolume op hoge resolutie — in deze uitvoering was de monsterkamer 0.8 mm dik. Deze steekproef kamers werden gebouwd door de zacht-litho Polydimethylsiloxaan (PDMS) van een precisie-gefreesd aluminium schimmel met een tolerantie van ± 50 µm. Dit is een ongeveer 100-fold verbetering in de diepte van veld opzichte high-power licht microscopie. DHM biedt ook kwantitatieve fase informatie, waardoor metingen van optische weglengte (product van de brekingsindex en dikte). DHM en soortgelijke technieken werden gebruikt voor het toezicht op bacteriële en gist celcyclus en berekening van bacteriële droge massa30,31,32; verstrooiing verschillen kunnen zelfs worden gebruikt om te onderscheiden van de bacteriestammen33.
Het instrument dat wij gebruiken is custom-built specifiek voor gebruik met micro-organismen, als eerder gepubliceerde34,35, en het ontwerp en de constructie worden gedemonstreerd en besproken. Waterige oplossingen worden doorlopend geleverd aan een 0,25 µL volume monsterkamer via spuitpomp; het debiet wordt bepaald door de framesnelheid van de camera met het oog op de beeldvorming van het gehele monstervolume. Een statistische berekening voorspelt het aantal monster volumes die image moet worden gemaakt om op te sporen van een groot aantal cellen met een bepaalde concentratie.
Voor cel-detectie toepassingen was wederopbouw van de hologrammen in amplitude en fase beelden niet vereist; analyse werd uitgevoerd op het ruwe hologram. Dit bespaart aanzienlijke rekenkracht en schijfruimte: een 500 Mb hologram video zal worden 1-2 Tb wanneer gereconstrueerd. We echter wederopbouw door de diepte van het monster te bevestigen dat de hologrammen de gewenste soort vertegenwoordigt bespreken. Een belangrijk kenmerk van DHM is haar vermogen om te controleren zowel de intensiteit en de fase van de beelden. Organismen die bijna transparant in intensiteit (zoals de meeste biologische cellen zijn) worden duidelijk weergegeven in fase. Zoals het is een label-vrije techniek, worden geen kleurstoffen gebruikt. Dit is een eendvantage voor mogelijke ruimtevaart toepassingen, omdat kleurstoffen niet op de voorwaarden van een missie overleven kunnen en — belangrijker — niet kan worden aangenomen om te werken met buitenaardse organismen, die mag niet DNA of RNA voor codering gebruiken. Het is ook een voordeel voor werk in extreme omgevingen zoals de arctische en Antarctische, waar kleurstoffen kunnen moeilijk te brengen naar de externe locatie en kunnen afnemen bij opslag. Reconstructie van beelden in fase en amplitude wordt uitgevoerd met behulp van een open-source softwarepakket dat we beschikbaar hebben gesteld op GitHub (SHAMPOO) of met behulp van ImageJ.

<table><tbody><tr><td>Bacto Yeast</td><td>BD Biosciences</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Tryptone</td><td>BD Biosciences</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7710</td><td>Veel opties om te kopen</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD Biosciences</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>10 cm Petri schotels</td><td>VWR</td><td>10053-704</td><td></td></tr><tr><td>15 mL kweekbuisjes</td><td>Falcon (Corning Life Sciences)</td><td>352002</td><td>Los gesloten</td></tr><tr><td>Petroff-Hauser kamer</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>3920</td><td></td></tr><tr><td>10 mL spuiten</td><td>BD Biosciences</td><td>309604</td><td>Luer-Lok tip niet noodzakelijk</td></tr><tr><td>Mannelijke Luer naar 1/16&rdquo; barb fitting</td><td>McMaster-Carr</td><td>51525K291</td><td></td></tr><tr><td>Autoklaveerbare 1/16&rdquo; ID PVC buis voor flow</td><td>Nalgene</td><td>8000-0004</td><td>Verkocht per lengte, koop dienovereenkomstig</td></tr><tr><td>Spuitpomp</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PHD 2000</td><td></td></tr><tr><td>Steekproefkamer</td><td>Aangepast</td><td>n/a</td><td>Zie Materiaalsectie</td></tr><tr><td>Holografisch microscoop</td><td>Aangepast</td><td>n/a</td><td>Zie Wallace et al.</td></tr><tr><td>Open source software</td><td>Aangepast</td><td>https://github.com/bmorris3/shampoo</td><td></td></tr></tbody></table>

kwantificeren van micro-organismen in lage concentraties, met behulp van digitale holografische microscopie (dhm)

Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy (DHM)

Nauwkeurig detecteren en tellen sparse bacteriële monsters kent vele toepassingen in de voedingsmiddelen, dranken en farmaceutische verwerkingsindustrie, in de medische diagnostiek, en voor de detectie van het leven door robotic missies naar andere planeten en manen van het zonnestelsel. Momenteel worden schaars bacteriële monsters geteld door cultuur beplating of epifluorescence microscopie. Cultuur platen vereisen lange incubatie tijd (dagen tot weken), en epifluorescence microscopie vereist uitgebreide kleuring en concentratie van het monster. Hier laten we zien hoe off-axis digitale holografische microscopie (DHM) te gebruiken bij het inventariseren van bacteriën in zeer verdunde culturen (100-104 cellen/mL). Eerst, de bouw van de aangepaste DHM is besproken, samen met gedetailleerde instructies voor het bouwen van een low cost-instrument. De beginselen van holografie worden besproken, en een statistisch model is gebruikt om te schatten hoe lang video's moeten worden om op te sporen cellen, op basis van de kenmerken van de optische prestaties van het instrument en de concentratie van de bacteriële oplossing (tabel 2) . Video detectie van cellen op 105, 104, 103, en 100 cellen/mL wordt gedemonstreerd in real time via un-gereconstrueerde hologrammen. Wederopbouw van amplitude en fase beelden is aangetoond door middel van een open-source softwarepakket.

De resultaten dienen de mogelijkheid om te detecteren van levende en dode bacteriën op een zeer laag niveau door DHM op te geven. Het aantal bacteriën geteld moeten in overeenstemming zijn met de resultaten die zijn verkregen met behulp van de Petroff-Hauser tellen kamer en plaat graven. Standaard statistische methoden geven informatie over de nauwkeurigheid van de verschillende detectiemethoden bij verschillende bacteriële concentraties.
<p class="jove_content" fo:keep-together.withi...

Digitale holografische microscopie (DHM) is een volumetrische techniek waarmee imaging monsters die 50-100 X dikker dan helderveld microscopie bij vergelijkbare resolutie, met scherpstellen uitgevoerd na verwerking. Hier DHM wordt gebruikt voor het identificeren, tellen, en bijhouden van micro-organismen bij zeer lage dichtheden en vergeleken met metingen van de optische dichtheid, kiemgetal, en directe.

Kwantificeren van micro-organismen in lage concentraties, met behulp van digitale holografische microscopie (DHM)

Accurately detecting and counting sparse bacterial samples has many applications in the food, beverage, and pharmaceutical processing industries, in ...

Het algemene doel van dit experiment is om de detectie van micro-organismen op zeer lage niveaus te demonstreren met behulp van digitale holografische microscopie. Deze techniek is gevoeliger dan traditionele lichtmicroscopie en biedt realtime informatie over bacteriële gedragingen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen op biologische en kosmologische gebieden, zoals het zoeken naar pathogene organismen in water of leven binnen ons zonnestelsel op ijzige manen.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat DHM een volumetrische techniek is, wat betekent dat we driedimensionale informatie over ons monster onmiddellijk kunnen vastleggen zonder dat we fysiek opnieuw hoeven te focussen. De implicaties van deze techniek strekken zich uit naar de diagnose van infecties in de bloedbaan of het hersenvocht vanwege het vermogen om lage bacterieconcentraties te detecteren. Om met deze procedure te beginnen, neem op de dag van het experiment een spectrofotometrische meting van de bacteriële mastercultuur die naar verwachting in het bereik van 0,6 tot 0,7 ligt.Neem vervolgens een monster van de mastercultuur en tel de cellen direct met behulp van een Petroff-Hausse

quantifying-microorganisms-at-low-concentrations-using-digital

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

De driedimensionale locaties van zwak-verstrooiende objecten kan uniek worden geïdentificeerd middels inline digitale holografische microscopie (Dihm), die een geringe wijziging betreft een standaard microscoop. De software gebruikt een eenvoudige weergave heuristische combinatie met Rayleigh-Sommerfeld back-overdracht naar de driedimensionale positie en geometrie van een microscopische fase-object verkregen.

Digitale Inline Holographic Microscopy (Dihm) van zwak-verstrooiing onderwerpen

We beschrijven het gebruik van een standaard optisch microscoop om kwantitatieve metingen van cellulaire massa, volume en dichtheid uit te voeren door een combinatie van lichtveld en differentiële interferentiecontrast beeldvorming.

Kwantitatieve Optische Microscopie: Meting van Cellulaire biofysische eigenschappen met een standaard optische microscoop

Hier beschrijven we een fenotypische test die van toepassing is op de high-throughput/high-content schermen van small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemische verbinding en Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. Deze methode is gebaseerd op de detectie van fluorescerend gelabelde Mycobacterium tuberculosis in fluorescerend gelabelde gastheercel met behulp van geautomatiseerde confocale microscopie.

Een microscopische fenotypische test voor de kwantificering van intracellulaire mycobacteriën aangepast voor screening met hoge doorvoer/hoge inhoud

Hier presenteren we een uitgebreid protocol om de beschikbaarheid van organische en anorganische voedingsstoffen en de abundantie en structuur van microbiële en virale gemeenschappen in afgelegen mariene omgevingen te beoordelen.

Het ontrafelen van de Unseen Spelers in de Oceaan - A Field Guide to Water chemie en Mariene Microbiologie

We presenteren een compact reflectie digitale holografische systeem (CDHM) voor inspectie en karakterisering van MEMS. Een lens-less ontwerp met behulp van een divergerende ingang golf verstrekken van natuurlijke geometrische vergroting wordt aangetoond. Zowel statische als dynamische studies worden gepresenteerd.

Compact Lens-less Digitale Holografische Microscoop voor MEMS Inspectie en karakterisering

Accurate beoordeling van ontstekingsremmende effecten is van het grootste belang voor de evaluatie van potentiële nieuwe geneesmiddelen voor de behandeling van inflammatoire darmziekte. Digitale holografische microscopie biedt beoordeling van ontsteking in muis- en menselijke colonweefselmonsters evenals geautomatiseerde multimodale evaluatie van epitheel wondgenezing in vitro.

Multimodaal Quantitative Fase Imaging met de Digitale Holografische Microscopie Beoordeelt Nauwkeurig darmontsteking en epitheliale wondheling

Wij bieden eenvoudige en robuuste protocollen voor het verwerken van biopsiemateriaal van verschillende soorten, embryo's van biomedische modelorganismen en monsters van andere organische weefsels om de digitale volumegegevensopwekking mogelijk te maken met de hoge resolutie episcopische microscopie methode.

Episcopische Microscopie met hoge resolutie (HREM) - Eenvoudige en robuuste protocollen voor het verwerken en visualiseren van organische materialen

Lens-vrije videomicroscopie ons in staat stelt om te controleren van celculturen direct in de incubator. Hier beschrijven we het volledige protocol gebruikt voor het verwerven en analyseren van een 2.7 dag lang verwerving van gekweekte HeLa cellen, wat leidt tot een dataset van 2.2 x 106 metingen van individuele cel morfologie en 10584 celcyclus tracks.

Lens-gratis videomicroscopie voor de dynamiek en de kwantitatieve analyse van aanhangend celkweek

3D single-molecuul lokalisatie microscopie wordt gebruikt om de ruimtelijke posities en bewegings trajecten van fluorescently gelabelde eiwitten in levende bacteriële cellen te sonde. Het experimentele en data-analyse protocol dat hierin wordt beschreven, bepaalt het heersende diffusieve gedrag van cytosolische eiwitten op basis van gegroepeerde enkelvoudige molecuul trajecten.

Single-molecule tracking microscopie-een hulpmiddel voor het bepalen van de Diffusieve toestanden van cytosolische moleculen

Differentiële dynamische microscopie (DDM) combineert kenmerken van dynamische lichtverstrooiing en microscopie. Hier wordt het proces van het gebruik van DDM om gereconstitueerde cytoskeletnetwerken te karakteriseren door de subdiffusieve en gekooide dynamiek van deeltjes in vimentinenetwerken en de ballistische beweging van actieve myosine-gedreven actine-microtubulecomposieten te kwantificeren.

Kwantificeren van cytoskeletdynamica met behulp van differentiële dynamische microscopie

Leer digitale holografische microscopie voor het detecteren van micro-organismen in lage concentraties. Deze volumetrische techniek biedt real-time driedimensionale beeldvorming met hogere gevoeligheid dan traditionele microscopie.

Kwantificeren van micro-organismen in lage concentraties, met behulp van digitale holografische microscopie (DHM)

Meer video's verkennen