Kwantificeren van cytoskeletdynamica met behulp van differentiële dynamische microscopie

Ons protocol kan de dynamiek in veel systemen kwantificeren met behulp van een reeks optische microscopietechnieken. We benadrukken hoe deze methode in het bijzonder kan helpen bij het karakteriseren van de dynamiek van gereconstitueerde cytoskeletnetwerken. Het belangrijkste voordeel van het gebruik van ons softwarepakket Differential Dynamic Microscopy is dat het goed gedocumenteerd is, meerdere voorbeeldanalysebestanden heeft en gemakkelijk kan worden aangepast om verschillende soorten dynamiek te bestuderen.

Ons softwarepakket kan worden gebruikt om de dynamiek te kwantificeren, niet alleen in gereconstitueerde cytoskeletnetwerken, maar ook in andere zachte en biologisch relevante materialen. Op basis van de tijd- en lengteschalen om te onderzoeken, verkrijgen beeldsequenties van meer dan 1.000 frames met behulp van microscoopbesturingssoftware, zoals Micro-Manager. Maak in de map voorbeelden in de PyDDM-coderepository een kopie van het parameterbestand met de naam example_parameter_file.yml.

Open dit EML-bestand met een teksteditor zoals Kladblok + of de teksteditor in JupyterLab. Geef in het gekopieerde EML-bestand de gegevensmap en bestandsnaam op die overeenkomen met de te analyseren afbeeldingsvolgorde. Geef in het gedeelte metagegevens de pixelgrootte en framesnelheid op.

Selecteer in de sectie analyseparameter de parameters voor de berekening van de DDM-matrix, zoals het aantal verschillende vertragingstijden en de langste vertragingstijd. Geef details over de aanpassing van de DDM-matrix of de tussenliggende verstrooiingsfunctie in de sectie fittingparameter, zoals de naam van het model en de modelparameter, de eerste schatting, de ondergrens en de bovengrens. Initialiseer een instantie van de DDM-analyseklasse door de metagegevens in de analyseparameters op te geven door de bestandsnaam van het EML-bestand door te geven met het volledige bestandspad naar DDM-analyse.

U kunt ook de metagegevens en parameters doorgeven als een Python-woordenboekgegevensstructuur. Voer de functie uit om de DDM-matrix te berekenen. Inspecteer de geretourneerde gegevens met de bijbehorende variabelen en metagegevens, die zijn opgeslagen als een gegevensset in het Xarray-pakket.

Inspecteer vervolgens de plots en figuren, die zijn opgeslagen als een PDF-bestand en de gegevensmap. Een van deze plots toont de standaardmethode voor hoe de achtergrond wordt geschat. Wijzig indien nodig de methode waarin de achtergrond wordt geschat met behulp van de parameterachtergrondmethode in het EML-bestand of als optioneel trefwoordargument in de functie DDM-matrix berekenen.

Initialiseer een instantie van de klasse DDM fit door de bestandsnaam van het EML-bestand met de metagegevens van de afbeelding en aanpassingsparameters door te geven. Maak een lijst van de beschikbare modellen door de functie print fitting modellen uit te voeren. Geef het model op dat moet worden gebruikt in het EML-parameterbestand of met behulp van de functie reload fit-model op naam.

Stel voor elke parameter in het gekozen model de initiële gissingen en grenzen in als deze verschillen van de waarden die in het EML-bestand zijn opgegeven met behulp van de functies parameter initial guess en set parameter bounds. Voer de fit uit met de functie fit. Genereer plots voor het inspecteren van de pasvormen in de q-afhankelijkheid van de fit-parameters met het functiefit-rapport.

Controleer de uitvoer inclusief de figuur met twee bij twee subplots die de DDM-matrix of ISF op vier q-waarden weergeven, samen met de pasvorm. Gebruik de klasse bladeren DDM past in de Jupyter Notebook omgeving om de DDM matrix of ISF samen met de beste pasvorm op een interactieve manier te plotten. Als u op een punt in de vervaltijd versus golfnummerplot klikt, worden de gegevens en de pasvorm weergegeven.

Controleer de resultaten van de fit die is opgeslagen in een Xarray-dataset en gebruik de functie twee netCDF of python's ingebouwde pickle-module om deze gegevensstructuur op schijf op te slaan. DDM-analyse werd uitgevoerd op de brightfield-beeldreeks van 0,6 micron kralen in een vimentinenetwerk en confocale microscoopbeelden van een actief actine-microtubule composietnetwerk met spectraal verschillende fluorescerende labels. Intermediaire verstrooiingsfuncties werden uitgezet als functie van vertragingstijd op verschillende golfnummers en een netwerk met een vimentineconcentratie van 19 micromolair en 34 micromolair.

Het lange vertragingstijdplateau van de functie bij een waarde ruim boven nul duidt op niet-activiteit. De vervaltijd tau uitgezet als functie van q voor twee netwerken met verschillende vimentineconcentraties vertoont subdiffusieve of beperkte beweging. De niet-godiciteitsparameters c uitgezet als functie van q in het kwadraat voor het netwerk met 34 en 49 micromolelar vimentine toonden aan dat de log van c evenredig was met q in het kwadraat zoals verwacht voor beperkte beweging.

De gemiddelde kwadraatverplaatsing versus vertragingstijdplots toonden aan dat de waarden bepaald uit DDM goed overeenkwamen met die gevonden door het volgen van enkele deeltjes. Voor het meer geconcentreerde netwerk plateaut de waarde bij langere vertragingstijden. DDM-matrix versus vertragingstijd voor een actief actine-microtubule-composietnetwerk toonde aan dat de DDM-matrix voor een bepaalde q-waarde een plateau had bij lage vertragingstijden en vervolgens verder steeg bij grote vertragingstijden.

De karakteristieke vervaltijden tau van de fits naar de DDM-matrix laten zien dat de relatie tussen tau en q ballistische beweging aangeeft. Na de ontwikkeling van dit PyDDM-softwarepakket hebben we het gebruikt om de anisotrope en tijdsafhankelijke dynamiek van actieve cytoskeletnetwerken en andere systemen te onderzoeken.