Single-molecule tracking microscopie-een hulpmiddel voor het bepalen van de Diffusieve toestanden van cytosolische moleculen

3D single-molecule tracking kan de subcellulaire lokalisaties en bewegingsgedrag van individuele eiwitten bepalen. Het observeren van de beweging van een eiwit in een levende cel geeft belangrijke inzichten over de interactie met bindende partners in zijn eigen omgeving. De hier gepresenteerde methode biedt een algemeen kader voor het analyseren van trackinggegevens van één molecuul om de verspreidingstoestanden van biologische moleculen op te lossen.

Het kan worden toegepast op zowel 2D- als 3D-trajecten die beperkt zijn tot willekeurig gevormde celvolumes. Na het storten van fluorescerende kraal in een vooraf voorbereid agarosepad zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol, plaats het op een microscoopdeksel en zet u de afdekbrief vast aan de houder van het microscoopmonster. De monsterhouder wordt vervolgens op een omgekeerde fluorescentiemicroscoop gemonteerd.

Initialiseer vervolgens de grafische gebruikersinterface van de microscoop;hier wordt op maat geschreven software in MATLAB gebruikt voor instrumentcontrole. Initialiseer de camerasoftware HCImage Live. Stel op het tabblad Vastleggen onder de sectie Camerabesturingselement de belichtingstijd in op 0,03 seconden en klik vervolgens op Live om een live-feed van de camera te starten.

Klik op de juiste knop Laser openen op de GUI-interface om de laser te deblokkeren en de tl-kralen op het agarosepad op te wekken. Bekijk de fluorescentie emissie op de camera met behulp van live-stream-modus. Pas de X- en Y-posities van de microscoopfase aan door op de XY-Position-pijlen onder het gedeelte Micro-Positioning Stage van de gebruikersinterface te klikken om ten minste één fluorescerende kraal in het midden van het gezichtsveld te plaatsen.

Wijzig indien nodig de stapgrootte door op het vervolgkeuzevak onder de pijlen te klikken. Pas vervolgens de Z-positie van de microscoopfase aan door op de Z-Position pijlen te klikken onder de sectie Nano-Positioning Stage. Stel de oriëntatie van de dubbele helix point-spread-functie van de fluorescerende kraal verticaal.

Deze verticale richting wordt gedefinieerd als het uitgangspunt in de Z-kalibratie. Scan 30 stappen boven en onder de startende Z-positie in stappen van 50 nanometer. Neem 10 frames op bij elke stap met een belichtingstijd van 0,03 seconden.

Om de geautomatiseerde gegevensverwerving te starten, klikt u op Ga onder Z-Kalibratie. Centrifuge een milliliter van warmte-geschokte Yersinia enterocolitica cultuur op 5,000 keer de zwaartekracht gedurende drie minuten bij kamertemperatuur verwijder dan de cultuur en gooi de supernatant. Was de pellet drie keer met een milliliter M2G-media.

Na de laatste spoeling, resuspend de pelleted bacteriën in 250 microliters van M2G media. Voeg vervolgens fluorescerende kralen toe om te gebruiken als fiduciale markers. De fluorescerende kraaloplossing moet worden toegevoegd, zodat er slechts één tot twee kralen per gezichtsveld zijn wanneer deze in de microscoop wordt bekeken.

Meng voorzichtig de suspensie door vortexing te scheiden geaggregeerde cellen en plaat 1,5 microliter van de suspensie op een 1,5 tot 2% agarose pad gemaakt met M2G, dan omkeren van de pad en plaats het op een ozon-gereinigde microscoop deksel slip. Voeg een druppel onderdompelingsolie toe aan de microscoopdoelstelling en plaats de monsterhouder op het microscoopstadium en zet deze op zijn plaats. Initialiseer de grafische gebruikersinterface om de camera, monsterfase en excitatielasers van de microscoop te bedienen en initialiseer vervolgens de camerasoftware.

Stel op het tabblad Vastleggen onder de sectie Camerabesturingselement de belichtingstijd in op 0,025 seconden en klik vervolgens op Live om een live-feed van de camera te starten. Pas de X- en Y-posities van de microscoopfase aan door op de XY-Position pijlen onder de sectie Micro-Positioning Stage te klikken om rond het monster te scannen en een gezichtsveld te vinden met een passend dichte populatie bacteriële cellen. Om de gegevensdoorvoer te maximaliseren, moet de celdichtheid op de afdekslip zo hoog mogelijk zijn zonder dat de cellen elkaar overlappen of aanraken.

Het gezichtsveld moet ook ten minste één fluorescerende kraal als fiduciale markering bevatten, zodat de verschuiving van het stadium kan worden gemeten terwijl de gegevens worden verkregen. Pas vervolgens de Z-positie van de microscoopfase aan door op de Z-Position pijlen onder de sectie Nano-Positioning Stage te klikken, zodat de dubbel-helix point-spread-functie lobben van de fluorescerende kralen verticaal zijn. Ga vervolgens naar Reeks en selecteer Scaninstellingen.

Wijzig het aantal frames in 20.000. Kies vervolgens een map met opslaan-bestemming door op de knop te klikken met drie puntjes. Klik tot slot op Start om maximaal 20.000 cameraframes te verzamelen met een korte belichtingstijd van 0,025 seconden.

Wanneer u klaar bent, blokkeert u de laserverlichting door op de juiste knop Laser sluiten in de grafische gebruikersinterface te klikken. Verzamel vervolgens 200 frames donkere beelden met dezelfde belichtingstijd. Schakel het vakje naast Thorlabs LED in en klik vervolgens op Spiegel omhoog schakelen.Dit zal het LED-licht boven het monster inschakelen en de microscoop van de fluorescentieroute naar het fasecontrastpad schakelen.

Initialiseer de software voor gegevenswerving op het fasecontrasttraject en druk op de knop Live Display starten/stoppen om een live feed van de camera te bekijken. Klik vervolgens op Vastleggen en gaan om de afbeelding op te slaan om een fasecontrastafbeelding van de cellen in het huidige gezichtsveld te verzamelen. Plaats de fluorescerende kraal voor gebruik als fiduciale marker.

Vind en pas alle lokalisaties en alle cameraframes aan met behulp van de sjabloondrempels zoals beschreven in het tekstprotocol. Klik onder de sectie DHPSF SM van de Easy-DHPSF GUI lokaliseren op Uitvoeren om signalen met één molecuul aan te passen en klik vervolgens op OK op de volgende pop-upvensters om de standaardinstellingen te behouden. De software vindt fluorescentiesignalen met één molecuul die lijken op de dubbele helix-point-spread-functie en vervolgens proberen ze te passen met behulp van een dubbel-Gaussian model.

Als het script wordt uitgevoerd, ziet de gebruiker een weergave van de ruwe beeldgegevens en een gereconstrueerd beeld van de met succes gemonteerde signalen van één molecuul. Met behulp van op maat geschreven software in MATLAB, beginnen met het handmatig selecteren van vijf controlepuntparen in het pop-upvenster door ruwweg te schatten en te klikken op de celpolen van dezelfde vijf cellen in zowel de single-molecule lokalisatie gegevens en cel contouren. Verwijder cellen met minder dan 10 lokalisaties en verwijder cellen die gedeeltelijk buiten het gezichtsveld zijn geplaatst en verwijder eventuele extra ongewenste cellen in het pop-upvenster door in hun celcontour te klikken.

Ten slotte wijzen lokalisaties die zich binnen de rand van het overzicht van een cel bevinden, toe aan die cel. Verwijder alle lokalisaties die zich niet in een celoverzicht bevinden. Een kritische factor voor de succesvolle toepassing van dit protocol is ervoor te zorgen dat de signalen van één molecuul goed van elkaar gescheiden zijn.

Als er meer dan één fluorescerend molecuul in een cel tegelijkertijd is, kan lokalisatie ten onrechte worden toegewezen aan de baan van een ander molecuul. Dit protocol werkt om het koppelingsprobleem te elimineren door trajecten waarvoor twee of meer lokalisaties tegelijkertijd in dezelfde cel aanwezig zijn, te verwijderen. Als signalen met één molecuul te dicht zijn, wordt een grote hoeveelheid van deze gegevens automatisch weggegooid tijdens de verwerking.

Afhankelijk van de expressieniveaus van de fluorescerende fusie-eiwitten kunnen ongeveer 200 tot 3,000 lokalisaties per cel worden gegenereerd. Deze lokalisaties kunnen tussen de 10 en 150 trajecten opleveren. Een groot aantal trajecten zijn nodig om goed bemonsterde distributies te produceren.

Hier is het histogram van schijnbare diffusiecoëfficiënten voor bijna 80, 000 single-molecule trajecten van de Yersinia enterocolitica Type 3 secretie eiwit YscQ gelabeld met fluorescerende eiwit eYFP. YscQ bindt zich aan membraaninjectisomen wat resulteert in een fractie van moleculen, ongeveer 24%die niet diffuus zijn, zoals blijkt uit de in het zwart weergegeven verdeling. De resterende YscQ moleculen vrij diffuus in de cytosol.

Tijdens de hier beschreven methode wordt vastgesteld dat niet-gebonden YscQ-moleculen bestaan in ten minste drie verschillende diffusieve toestanden. Deze conclusie werd getrokken door de verdeling van de schijnbare diffusiecoëfficiënten te voorzien van een bibliotheek van gesimuleerde distributies met bekende diffusiecoëfficiënten. Bij een poging om meerdere diffusive staten op te lossen, moeten enkele duizenden single-molecule trajecten worden verzameld om ervoor te zorgen dat de schijnbare diffusiecoëfficiënt verdelingen zeer goed worden bemonsterd.

Single-molecule tracking kan worden uitgevoerd in wild type cellen of in genetische schrapping mutanten om te bepalen of specifieke diffusieve toestanden manifesteren alleen wanneer een moleculaire binding partner aanwezig is. Door het oplossen van de diffusieve toestanden van cytosolische eiwitten en eiwitcomplexen met behulp van 3D single-molecule tracking, onderzoekers kunnen bepalen waar, wanneer en hoe oligomeric eiwit complexen vormen in levende cellen. Werken met krachtige laserbronnen en levende menselijke ziekteverwekkers kan zeer gevaarlijk zijn.

Er moeten altijd passende laserveiligheids- en bioveiligheidsprotocollen worden gevolgd.