Uitgebreide Protocol bij monster en proces beenmerg voor het meten van meetbare residuele ziekte en leukemische cellen van de stam in Acute myeloïde leukemie
5 maart 2018
Detectie van minimale of meetbare residuele ziekte (MRD) is een belangrijke voorspellende biomarker voor risico-evaluatie te verfijnen en het voorspellen van herval in acute myeloïde leukemie (AML). Deze uitgebreide richtlijnen en aanbevelingen met de best practices voor consistente en accurate identificatie en opsporing van MRD, kan steun bij het maken van effectieve AML behandelingsbeslissingen.
Het algemene doel van dit protocol is om een nauwkeurige test uit te voeren van beenmergmonsters van patiënten met acute myeloïde leukemie op meetbare resterende ziekte, inclusief de kwantificering van leukemie-stamcellen. Deze methode kan een nauwkeurige beoordeling geven van meetbare resterende ziekte in beenmergmonsters van patiënten met acute myeloïde leukemie. Het belangrijkste voordeel van deze aanpak is dat een nauwe opvolging van het protocol zeer reproduceerbare, hoogwaardige resultaten oplevert.
De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot klinische besluitvorming, aangezien deze kan worden gebruikt als een uitlezing van de reactie van patiënten op behandeling. Het demonstreren van de procedures zullen worden uitgevoerd door Jeroen Janssen, hematoloog, Gerrit Sijm, technicus van het diagnostische hematologielaboratorium en Jennifer Scheick en Sander Snel, technici van het MRD-team. Met de patiënt in de laterale decubituspositie, markeer de superieure posterieure iliacale werveluitsteeksel met een pen en desinfecteer de huid van het beoogde biopsiegebied met 0,5 tot 1% chloorhexidine in ethanol in een uitwaartse cirkelvormige beweging.
Na toediening van een lokaal anestheticum, pak een 15-gauge 2,8-inch naald met het proximale uiteinde in de palm en de wijsvinger tegen de zijkant van de metalen schacht van de naald nabij de punt voor controle. Gebruik zachte maar stevige druk om de naald te introduceren met een snelle afwisselende pronerende supineerende beweging door de verdoofde huid naar de iliacale werveluitsteeksel. Wanneer de naald in contact komt met het posterieure iliacale werveluitsteeksel, verwijder de stilette en bevestig een lege 10-milliliter spuit op de naald.
Trek voorzichtig de zuiger terug om negatieve druk in de spuit te creëren totdat er maximaal 10 milliliter beenmergspicula is verzameld. Neem niet meer dan 10 ml beenmerg per aspiratie om hemodilutie te voorkomen. Verwijder de spuit en plaats de stilette terug op de naald.
Vervolgens wordt ongeveer twee milliliter van het beenmerg in een horlogeglas geïnjecteerd en ervoor gezorgd dat er voldoende monster wordt getrokken om in een heparine-gecoate acht-milliliterbuis te worden geïnjecteerd en de buis onmiddellijk te keren. Om stolselvorming te voorkomen, is het belangrijk om de anticoagulansbevattende buis zo snel mogelijk te investeren zodra het beenmerg is toegevoegd. Voor optimale morfologische beoordeling, gebruik een plastic spatel om spicules van het asperges in het horlogeglas over te brengen naar een glasplaatje, en schuif voorzichtig een andere glasplaatje op het beenmerg.
Na het drogen, kleuren de spicules met May-Grunwald Giemsa voor analyse door middel van lichtmicroscopie. Plaats de beenmergbuis in een plastic houder en plaats de houder in een plastic container met een omgevingsgelpakket en een voltooide aanvraagformulier. Voordat het beenmerg wordt geanalyseerd door middel van flowcytometrie, start de flowcytometer en open de flowcytometrieanalysesoftware om een nieuw experiment te creëren met een forward scatter versus side scatter dot plot.
Voor beoordeling van de grootte en granulatie van de cellen, laad ongelabelde gelyseerde perifere bloedcellen van een gezonde donor en selecteer de functie Acquire Cells. Gate de lymfocyten en pas de voorwaartse en zijwaartse scatterspanningen aan om de juiste gemiddelde doelwaarden voor de gated celpopulatie te bereiken. Vervolgens verwerf gegevens voor minimaal 10.000 gebeurtenissen.
Om de doelfluorescentiekanaalfotovermenigvuldigerbuisspanningen in te stellen, gebruik eerst acht-piek regenboogparelkettingcalibratiedeeltjes volgens de instructies van de fabrikant om 10.000 gebeurtenissen bij een lage stroomsnelheid te verwerven. Gate de enkele pareltjes in de voorwaartse versus zijwaartse scatter dot plot, gevolgd door het gat de 7e piek in de FITC-PE dot plot. Gate de resulterende parelkettingpopulaties voor elk fluorforeen.
Ga door met het verwerven van de acht-piek regenboogparelkettingoplossing en pas aan en verfijn de PMT-spanningen in alle fluorescentiekanalen aan om de doel-MFI-waarden te bereiken volgens de instructies van de fabrikant. Gebruik Record om gegevens van ongeveer 2.000 gebeurtenissen te verzamelen en controleer de MFI voor de 7e piekpareltjes. Voeg vervolgens een voldoende volume van elk experimenteel flourochrome geconjugeerd antilichaam toe om de pareltjes in de overeenkomstige fluorescentiebuizen te kleuren minus één controle en vortex de buizen grondig.
Maak een nieuw leeg experiment met dezelfde compensatieparameters, zorg ervoor dat de voorwaartse scatterdrempel is ingesteld op 5.000 en de compensatiewaarden van alle flourochromen zijn nul. Om de compensatiecontroles te maken, selecteer de functie Create Compensation Control en laad de ongekleurde controlebuis. Pas de P1-gate rond de enkele parelpopulatie aan en bevestig dat de P1-gate alleen enkele pareltjes bevat.
Klik met de rechtermuisknop op de P1-gate en selecteer Toepassen op alle compensatiecontroles. Neem vervolgens gegevens op voor alle enkel gelabelde fluorescentiebuizen en bevestig dat de P2-gate de positieve populatie op elke fluorescentiehistogram omvat. Om de cellen te kleuren voor flowcytometrische analyse, vervoer het beenmerg naar het laboratorium, controleer het aanvraagformulier om het patiëntstudienummer en de geboortedatum te verifiëren en bepaal wat er moet worden gekleurd.
Voor MRD gebruiken we een kleuringspaneel bestaande uit vier buizen. Hier demonstreren we de kleuring van het LSC-paneel dat uit één buis bestaat. Na celtelling, breng het juiste volume beenmerg over in een nieuwe 15-milliliterbuis.
Voeg lysisbuffer toe bij 10 keer het experimentele celvolume om de rode bloedcellen te lyzeren. Draai de buis om te mengen en incubeer de cellen gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Aan het einde van de lyseperiode, pellet de cellen door centrifugatie.
Resuspendeer de cellen in 15 milliliter wasbuffer bij kamertemperatuur en oogst de celpellet opnieuw door centrifugatie. Pipet ondertussen de juiste hoeveelheid antilichaamcocktailoplossing in vijf-milliliter FACS-buizen. Hier is het paneel voor de stamceelbuis getoond.
Resuspendeer de pellet in was
Overzicht
Dit artikel schetst een protocol voor het nauwkeurig testen van beenmergmonsters van acute myeloïde leukemie (AML) patiënten om meetbare restziekte (MRD) te detecteren. De methode benadrukt reproduceerbaarheid en resultaten van hoge kwaliteit, die cruciaal zijn voor klinische besluitvorming met betrekking tot AML behandeling.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Hematologie
- Oncologie
- Klinische diagnostiek
Achtergrond
- MRD is een belangrijk prognostisch biomerker in AML.
- Accurate detectie van MRD kan risicobeoordeling verfijnen.
- Richtlijnen voor MRD detectie kunnen behandelingsbeslissingen helpen.
- Beenmergmonstering is cruciaal voor het beoordelen van MRD.
Doel van de studie
- Om een betrouwbaar protocol te bieden voor MRD detectie bij AML patiënten.
- Om leukemie stamcellen in beenmergmonsters te kwantificeren.
- Om klinische besluitvorming op basis van MRD beoordeling te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Beenmergaspiratie met een 15-gauge naald.
- Flowcytometrie voor het analyseren van celpopulaties.
- Kleurprocedures voor celidentificatie.
- Gebruik van specifieke antilichamen voor detectie van leukemie stamcellen.
Belangrijkste resultaten
- Het protocol levert zeer reproduceerbare resultaten op.
- Accurate kwantificering van MRD kan worden bereikt.
- Flowcytometrie biedt gedetailleerde inzichten in celpopulaties.
- Effectieve monitoring van patiëntrespons op behandeling.
Conclusies
- Consistente MRD detectie is vitaal voor AML management.
- Het geschetste protocol kan behandelingsresultaten verbeteren.
- Verdere validatie van de methode wordt aangemoedigd.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Accurate quantification of measurable residual disease (MRD) and leukemic stem cells (LSC) in acute myeloid leukemia (AML) bone marrow samples is critical for predictive risk assessment and therapeutic decision-making in discovery and translational pipelines. Standardized, reproducible MRD and LSC measurement enables robust biomarker-driven stratification, supporting risk-adjusted portfolio advancement and reducing late-stage biological uncertainty. Harmonized protocols for bone marrow sampling and flow cytometry analysis strengthen cross-study comparability and enterprise-level data integration.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional validation of disease-relevant cell populations through precise MRD and LSC quantification.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing residual leukemic cells post-treatment.
- Facilitates predictive confidence in target engagement and pathway modulation.
Screening & Assay Development
- Provides validated flow cytometry gating strategies for reproducible detection of rare cell populations.
- Standardizes sample processing and staining panels for scalable assay deployment.
- Delivers quantitative outputs essential for downstream compound evaluation and screening readiness.
Translational & Preclinical Research
- Aligns MRD and LSC measurement with translational biomarker strategies for clinical outcome prediction.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation by linking cellular phenotypes to molecular aberrancies.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on robust residual disease assessment.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates from early discovery through translational research, providing a standardized workflow for MRD and LSC quantification in AML bone marrow samples.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and biological de-risking by enabling detection of residual leukemic and stem cell populations.
- Screening: Ensures assay reproducibility and quantitative readouts through harmonized flow cytometry procedures.
- Analytics: Delivers high-fidelity measurements and gating strategies for comparative analysis across patient samples and studies.
- Translational Research: Connects cellular and molecular data to clinical risk stratification and biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, standardized protocol for MRD and LSC assessment across research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in AML research.
- Operational Value: Promotes standardization, reproducibility, and scalability in sample processing and analysis.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of AML therapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires specialized expertise in bone marrow sampling and multi-color flow cytometry analysis.
- Demands access to calibrated flow cytometers, validated antibody panels, and robust analytical software.
- Necessitates cross-team standardization of sample handling, gating strategies, and data interpretation.
- Adaptation may be needed for different AML subtypes or evolving immunophenotypic markers.
- Sample quality and hemodilution risk must be managed to ensure reliable MRD and LSC quantification.
