Name: Visuele en microscopische evaluatie van Streptomyces Developmental mutanten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Leer fenotypische karakterisering van Streptomyces voor microbiologisch onderzoek met behulp van Streptomyces coelicolor. Deze toegankelijke methoden helpen beginnende onderzoekers bij het visualiseren en analyseren van bacteriële mutanten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs wil erkennen Otterbein University voor Undergraduate Student onderzoeksbeurzen en Student Research Fund Awards GVK en SGK; de Otterbein Professor Gilbert E. Mills Memorial begiftigd Sabbatical programma Award en het departement biologie en aardwetenschappen faculteit Research and Scholarship Award naar JAB begiftigd. De Bert en Jane hoorn begiftigd Student Fonds voor onderzoek in de wetenschappen werd toegekend aan GVK en SGK. De auteurs wil ook graag mijn dankbaarheid uitspreken dat Duquesne University gefinancierd Undergraduate programma onderzoeksbeurzen voor GVK en SGK. Voormalige Juniata College undergraduate onderzoek studenten, Ryan Johnson en Lindsey Draper bijgedragen de microscopie beelden voor figuren 2 en 3, respectievelijk.

1. Prepareer instrumenten, cultuurmedia, oplossingen en petrischalen
<ol><li>Autoclaaf tandenstokers in een 50 mL-bekerglas, bedekt met aluminiumfolie te houden steriele.</li>
	<li>Steriliseren van alle droge goederen die zullen worden gebruikt (tips, stokken, glaswerk, enz.) in een autoclaaf. Opmerking: Let op! Volg alle aanwijzingen van de veiligheid voor de autoclaaf model gebruikt. Autoclaven vormen een risico voor explosies, en brandwonden van stoom en contact met hete oppervlakken, materialen en media. Bekijk voor de autoclaaf veiligheid, "Het juiste gebruik van autoclaven"34.</li>
	<li>
Bereiden de MS agar (Mannitol soja meel (SFM))14 culturen groeien.
	<ol>
<li>Voeg toe 5 g van sojameel en 5 g agar in de maatkolf van 1 L.</li>
		<li>Los 5 g mannitol in 250 mL leidingwater en afzien in de kolf, met de soja meel en agar.</li>
		<li>Voeg een schuim plug en de folie aan de opening van de kolf en de autoclaaf bij 121 ° C, 15 psi voor minstens 30 min. Let op: Dit medium kookt makkelijk over. Gebruik een kolf die ten minste viermaal het werkelijke volume van MS agar worden gesteriliseerde met autoclaaf kan houden. Een standaard snelkookpan kan worden gebruikt in plaats van een autoclaaf met soortgelijke overwegingen van veiligheid. Anderzijds kan een magnetron worden gebruikt voor het steriliseren van media en materialen als toegang tot een autoclaaf niet mogelijk35,,36 is. Middelbare school docenten willen kunnen ook samenwerken met de lokale hogescholen of universiteiten tot gesteriliseerde met autoclaaf leveringen.</li>
		<li>Cool media tot comfortabel genoeg om te behandelen. Wees voorzichtig om niet te lang koel, omdat agar bij temperaturen lager dan 50 ° C. stolt</li>
		<li>Giet MS agar uit de kolf in steriele petrischalen totdat de onderkant van elke petrischaal ongeveer de helft is volle (ongeveer 25 mL media per petrischaal). Laat stollen voordat u agar platen. Agar platen worden opgeslagen in een plastic zak op kamertemperatuur totdat het nodig is. Opmerking: Agar platen kunnen ook worden opgeslagen in een koelkast, vooral als antibiotica nodig zijn in de media.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. streak Streptomyces op borden voor vermeerdering
<ol><li>Streak Streptomyces stammen op MS agar platen aan één kolonies met behulp van een standaardmethode, zoals het kwadrant strijk methode zoals in Sanders, 201237. Opmerking: Een inoculating lus of steriele tandenstokers kunnen worden gebruikt. Optioneel: Andere media worden vaak gebruikt voor Streptomyces -soorten, zoals R2YE en minimale media14.</li>
	<li>Incubeer de platen bij 30 ° C.</li>
	<li>Restreak platen door het plukken van een één kolonie elke 4-6 dagen. Als kolonies leeftijd ze gevoelig voor willekeurige mutatie.</li>
</ol>3. Maak Glycerol Mycelial voorraden voor bacteriële opslag
Opmerking: Mycelial voorraden kunnen worden gemaakt voor alle Streptomyces stammen, met inbegrip van de whi en bld stammen en andere ontwikkelingsstoornissen mutanten die nu niet kunnen voltooien sporevorming.
<ol><li>Maceraat 15 – 20 kolonies in 200 – 500 µL 20% glycerol met behulp van een steriele houten deuvel-applicator.</li>
	<li>De gier van gemacereerde kolonies overbrengen in een vriezer cultuur tube 1,5 mL, met behulp van een micropipet of steriele overdracht pipet. Opmerking: De grondbeginselen van micropipet gebruik vallen elders38.</li>
	<li>Voeg genoeg 20% glycerol zodat het eindvolume 1 mL en meng voorzichtig. Winkel monsters bij-80 ° C. Opmerking: Let op! Gebruik Cryogene Veligheid handschoenen en een laboratoriumjas te beschermen van de huid tegen contact met extreme koude. U kunt ook mogen een vriezer van-20 ° C worden gebruikt met potentiële vermindering van lange termijn opslagtijd. Vermijd buitensporige bevriezen en ontdooien om uit te breiden van de levensvatbaarheid.</li>
</ol>4. Maak Glycerol Spore voorraden voor stammen staat sporevorming
Opmerking: Spore voorraden zijn voorkeur voor de levensvatbaarheid op lange termijn, maar zijn alleen haalbaar voor stammen die in staat is van de voltooiing van de sporevorming zijn.
<ol><li>
100 µL van gemacereerde materiaal (uit stap 3.1) op een agarplaat te verkrijgen van een confluente gazon van groei37verspreid. Opmerking: Spread beplating wordt weergegeven in Sanders37 (wijziging: een draaitafel is niet verplicht.). De plaat kan worden omgezet met één hand tijdens het gebruik van de andere hand de spreider verplaatsen in een zachte heen en weer beweging in de agarmedia.<ol>
<li>Pipetteer 100 µL van gemacereerde mycelium naar het midden van een MS agarplaat.</li>
		<li>Steriliseren een glas of metaal verspreiding gereedschap door gedeeltelijk ondergedompeld in 70% ethanol en passeren de spreider eens langzaam door een vlam Bunsenbrander om sneller de verdamping van de ethanol. Let op: Ethanol is zeer ontvlambaar. Laat niet de vlammende spreider plaats in ethanol en laat de vlammende daling van ethanol te vallen in de ethanol schotel. Ook gebruiken een steriele wegwerp wattenstaafje te verspreiden van de bacteriën op de plaat, die geen ethanol of vlam vereist.</li>
		<li>Draai van de MS-agar plaat met de ene hand, terwijl het gebruiken van een rug en weer beweging om te enten van de plaat met de steriele spreider.</li>
		<li>Incubeer gedurende 5-7 dagen bij 30 ° C, totdat de spanning goed sporevorm is. Opmerking: Incubatie tijden zullen variëren afhankelijk van het soort en de stam.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voeg toe 2 mL steriele zoutoplossing (0,8% NaCl) naar het midden van een confluente gazon van Streptomyces cellen dat sporevorming heeft ondergaan.</li>
	<li>Sporen van de oogst door wrijven zachtjes het oppervlak van het mycelium met een steriele enten lus (of een wattenstaafje), langzaam richting de rand van het gazon.</li>
	<li>Pipetteer de zoute bevat sporen in een conische tube van 15 mL. Vortex krachtig te breken spore ketens in afzonderlijke cellen.</li>
	<li>Centrifugeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten bij ongeveer 2.500 x g.</li>
	<li>Pipetteer het supernatant en negeren. De spore-pellet verspreiden door krachtige draaikolk agitatie in de kleine hoeveelheid resterende vloeistof.</li>
	<li>Resuspendeer de sporen in 1 mL 20% glycerol door het tekenen van de oplossing op en neer met een pipet.</li>
	<li>De voorraad van de spore glycerol overbrengen in een tube van 1,5 mL vriezer. Winkel bij-80 ° C. Let op: Gebruik Cryogene Veligheid handschoenen en een laboratoriumjas te beschermen van de huid tegen contact met extreme koude. U kunt ook kan een vriezer van-20 ° C worden gebruikt met potentiële vermindering van de levensvatbaarheid op lange termijn opslagtijd. Vermijd buitensporige bevriezen en ontdooien om uit te breiden van de levensvatbaarheid.</li>
</ol>5. Voer mutagenese
<ol><li>Mutagenese op basis van de gewenste resultaten waarnaar wordt verwezen in de Inleiding en onlangs herzien door Baltz, 201639uitvoeren Opmerking: Sommige experimenten fenotypering vergt niet mutagenese, zoals de bedoeling om te identificeren van nieuwe soorten uit de omgeving. Methoden van willekeurige mutagenese omvatten het gebruik van een transposon8,9,10,11,12,13, UV-straling of chemicaliën14. Plaats-geleide mutagenese15,16,17,18,19,20 technieken kunnen worden gebruikt om te maken van specifieke puntmutaties, verwijderingen, of andere soorten mutaties.</li>
</ol>6. vergelijk en opnemen van de visuele verschijning
<ol><li>Neem nota van de morfologie van de kolonie voor elke mutant in vergelijking met de wild-type ouderstam na strepen van alle stammen zoals in stap 2. Vergelijk het nieuwe isolaat met die van een goed bestudeerde soorten, zoals S. coelicolor en S. venezuelae, wanneer de karakterisering van nieuwe Streptomyces -soorten. Opmerking kenmerken (Figuur 1) zoals de basisvorm, oppervlakte van kolonie (fuzzy, kaal, gerimpeld, etc.), dekking, hoogte, en de pigmentatie (onderscheid worden gemaakt tussen de vegetatieve mycelium, luchtfoto mycelium en/of het omringende medium).</li>
	<li>Label een MS-agar plaat en streep wild-type en gemuteerde stammen in wedge patronen (Figuur 1). Wees voorzichtig dat geen spanning een andere stam raakt Voorkom kruisbesmetting. Noteer de datum en de tijd die stammen zijn streaked op het bord. Incubeer de platen bij 30 ° C.</li>
	<li>Plaats gegroeid petrischalen op gekleurde of witboek te homogeniseren van de achtergrond. Schrijven op het papier de stam naam, datum, incubatietemperatuur en tijd van de eerste plaat strepen. Neem digitale afbeelding(en) van de plaat met de laatste informatie over de achtergrond van het papier zo geschreven dat verwarring wordt geminimaliseerd. Opmerking: Het schrijven kan worden bijgesneden vanaf de foto op een later tijdstip als het is om te worden gebruikt voor de voorbereiding van de figuur.</li>
</ol>7. het uitvoeren van fase-Contrast microscopie
<ol><li>Steriliseer de pincet door wassen in 70% ethanol en vervolgens passeren een vlam Bunsenbrander te verdampen de ethanol. Laat afkoelen.</li>
	<li>Steriliseren coverslips door wassen in 70% ethanol en dan het toestaan van hen om te drogen in een steriele petrischaal.</li>
	<li>
Bereiden een dekglaasje aan oplichting van de bacteriële groei worden onderzocht.
	<ol>
<li>Een steriele dekglaasje aan halen met een steriel pincet en plaats het dekglaasje aan op een MS agarplaat waar bacteriegroei is dicht. Druk op op de achterkant van het dekglaasje aan voorzichtig met een pincet om voldoende overdracht van bacteriële sporen en luchtfoto mycelium.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Het dekglaasje aan van de plaat halen en plaats deze zodat de zijde met het materiaal van de cel is naar de richting van het oppervlak van een microscoopglaasje, met een daling van 15 µL 50% glycerol bereid in water voor montage. Luchtbellen te verminderen door het plaatsen van het dekglaasje aan in een hoek van 45° aan de dia en laat het vallen op de 50% glycerol.</li>
	<li>(Optioneel) Zegel met duidelijke nail polish voor behoud van de dia.</li>
	<li>
Het uitvoeren van fase-contrast microscopie zoals beschreven door Frohlich40 op verschillende tijdstippen tijdens de levenscyclus. Opmerking: Herhaalde imaging zorgt voor een meer volledige analyse en de mogelijkheid om te detecteren van vertragingen in de ontwikkeling. Onafhankelijk Herhaal de opmerkingen om ervoor te zorgen nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid.<ol>
<li>Plaats de voorbereide dia in het werkgebied van de Microscoop en voeg een druppel immersie-olie naar het midden van de cover slip. Draai de 100 X fase doelstelling in plaats en het torentje van de condensor ingesteld op de juiste instelling voor "overeenkomende" fase. Focus van het beeld met behulp van alleen de fijne instelknop zodra het objectief in contact met de olie is.</li>
		<li>Onderzoeken van verschillende gezichtsveld te onderscheiden merkbaar en consistent verschillen tussen de gemuteerde stammen en de wild-type, zoals de mogelijkheid om te formulier sporen, spore-grootte en vorm en totale aantal sporen (Zie Figuur 2). Opmerking: Alternatieven voor fase contrast microscopie omvatten differentiële interferentie contrast (DIC) microscopie40 en eenvoudige kleuring technieken voor gebruik met helder veld microscopen41, zoals kristalviolet kleuring.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. Voer fluorescentie microscopie
<ol><li>Pincet door wassen in 70% ethanol en vervolgens uit te voeren door middel van een bunsenbrander vlam steriliseren.</li>
	<li>Een steriele dekglaasje aan pikken met steriel pincet en plaats op een MS agarplaat waar bacteriële groei duidelijk is. De achterkant van het dekglaasje aan zachtjes aanraken met de pincet om voldoende overdracht van bacteriële sporen en luchtfoto door samensmelting van filamenten.</li>
	<li>Het dekglaasje aan van de plaat halen en plaats deze zodat de zijde met het materiaal van de cel boven ligt, op cardstock voor gemak in de manipulatie van het dekglaasje aan.</li>
	<li>Overstroming van het dekglaasje aan met ijskoude methanol (~ 300 µL voor een 20 x 20 mm2 dekglaasje aan) en laat het volledig droge lucht. Let op: Methanol is een mutagene stof. Vermijd direct contact met de huid.</li>
	<li>Spoel het dekglaasje aan driemaal met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)42 door zachtjes verstrekking en het verwijderen van de oplossing.</li>
	<li>Voeg 15 µL van 100 μg/ml Propidium jodide en/of 10 μg/mL tarwe-kiem-Agglutinin geconjugeerd met fluoresceïne isothiocyanaat (FITC-WGA) in 50% glycerol aangebracht in een gelabelde microscoopglaasje. Opmerking: Propidium jodide vlekken DNA rode locatie te detecteren chromosomale DNA terwijl WGA-FITC de celwand groene vlekken.</li>
	<li>Omkeren dekglaasje aan bedrukte zijde naar beneden op de daling van fluorescerende vlek op het glasplaatje. (Optioneel) zegel met duidelijke nagellak voor behoud van dia.  De kleurstoffen zijn lichtgevoelig, Incubeer gedurende 15 minuten in een verduisterde of schemerige kamer.</li>
	<li>Observeren van de dia's onder een 100 X-objectief met een fase-contrast of DIC Microscoop uitgerust met epifluorescence excitatie kubussen voor propidium jodide ('Texas Red' Filter ingesteld of 535/617 nm excitatie/emissie maxima) en FITC (FITC filteren instellen of 490/525 nm excitatie/emissie-maxima).</li>
	<li>Plaats de dia op het podium en de focus met behulp van de knoppen van de grove en fijne aanpassing.</li>
	<li>Observeer de fluorescentie zoals elders43.</li>
	<li>Gebruik een gratis image analyse softwarepakket dat bij de identificatie van sporen met lagere intensiteit van de fluorescentie44 helpen kan.</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier presenteren we protocollen voor beginnende Streptomyces onderzoekers om uit te voeren studies door de benodigde stappen voor het uitdragen van stammen en voorbereiding van voorraden voor langdurige opslag. Vervolgens beschrijven we de protocollen voor visuele en microscopische karakterisering van Streptomyces stammen. Enkele typische eerste stappen in fenotypering developmental mutanten zijn: 1) visueel onderzoek van de mutant kolonies in vergelijking met wild type kolonies op de drager van de agar; 2) fase contrast microscopie; en 3) fluorescentie microscopie van sporogenic luchtfoto schimmeldraden. Gebaseerd op het fenotype weergegeven in deze drie stappen, kan een verscheidenheid van technieken worden gebruikt om te verder onderscheiden het fenotype van een bepaalde spanning.
Eerste fenotypering experimenten worden gewoonlijk gebruikt om te karakteriseren van nieuwe soorten, het identificeren van mutanten van belang gedeeltelijk karakteriseren van mutanten en beginnen te onderscheiden van de typische rol van een bepaald gen op basis van het fenotype van een geïdentificeerde mutant. Al zijn de hier beschreven methoden gebruikt in het universitair onderwijs laboratoria te identificeren en te karakteriseren van een grote verscheidenheid van Streptomyces mutanten, met inbegrip van die met gebreken in celdeling48,49, 50 , 51 , 52 , 53 , 54, sporevorming55,56, luchtfoto mycelium vorming57,58, antibiotica productie59, tweede boodschapper signalering47en chromosoom segregatie 60. deze technieken zijn de essentiële eerste stappen om het bepalen van het fenotype van mutanten in het algemeen en het onthullen van een grote hoeveelheid belangrijke informatie over de functies van genen van belang. Het kan gemakkelijk worden uitgebreid tot andere soorten van Streptomyces methodenen al zijn gebruikt om te beschrijven van stammen van S. griseus, S. venezuelae, S. schurften vele andere Streptomyceten. De video protocollen die hier beschreven worden verwacht om te dienen als een belangrijke bron voor nieuwe onderzoekers invoeren van Streptomyces onderzoeksgebieden, zoals op het gebied van Geneesmiddelenontwikkeling. Het gaat hierbij om de nieuwe instructeurs die werken aan de bestrijding van de crisis van de resistentie tegen antibiotica en opleiden van de talloze aantallen nieuwe undergraduate student onderzoekers toetreden tot de inspanningen van crowdsourcing van de kleine wereld-initiatief.
De hier beschreven technieken kunnen gemakkelijk aangepast worden aan college en high school gebruik in de klas naast onderzoekslaboratoria, met behulp van de wijzigingen beschreven in de video en tekst. Studenten in een eerste jaar microscopie module op een kleine liberal arts college konden strijk stammen, digitale foto's nemen van stammen geteeld op agarmedia, en het uitvoeren van fase-contrast en fluorescentie microscopie, wat in de indiening van uitmondde een portfolio van meerdere panelen cijfers aan het einde van de module 3 week, 15 h-lab werk vertegenwoordigen. Ongeveer 160 eerstejaarsstudenten waren verantwoordelijk voor de eerste fenotypering van 320 roman transposon mutanten. Undergraduate onderzoek studenten aan drie instellingen deelgenomen aan de eerste fenotypering voor extra mutanten en de daaropvolgende karakterisering van veel van de stammen. De uitgebreide gegevens die zijn verkregen in een relatief korte periode van tijd, illustreren de waarde van de hier beschreven protocollen. Honderden extra mutanten zijn opgeslagen als glycerol mycelial voorraden voor toekomstige karakterisering.
Na de eerste experimenten hier beschreven, kan een verscheidenheid van methoden worden gebruikt om uit te breiden van de kwaliteit van de informatie met betrekking tot de stammen van belang. Als de mutatie niet bekend is, moet een genotypering-methode worden gebruikt om te bepalen het type en/of de locatie van de mutatie. Bijvoorbeeld, willekeurige transposon mutagenese van het wild-type chromosoom6,7,8,9,10,11,12,13 resulteert in kolonies die eerste fenotypische schermen zoals die beschreven hierboven moeten ondergaan. Vervolgens moet de locatie van het transposon worden vastgesteld met behulp van een techniek zoals inverse polymerase kettingreactie (iPCR)61. Bepaling van het genotype van de pas ontdekte mutanten is een belangrijke stap na eerste karakterisering.
Sommige veelgebruikte geavanceerde methoden voor de analyse van de latere fenotypering die kunnen worden vermeld in de klas of onderzocht door middel van verder onderzoek omvatten groen fluorescente proteïne (GFP) tagging om te bepalen van lokalisatie patronen voor de proteïne van belang, gen expressie analyses uitgevoerd, zoals real time kwantitatieve PCR (qPCR) en wereldwijde gen expressiepatronen van wild-type versus mutant via RNA Sequencing (RNA-seq). Fenotypering vaardigheden zijn eveneens vereist voor genetische complementatie analyse. In een experiment complementatie is de wild-type kopie van een gen in een gemuteerde stam om te bepalen of het toegevoegde allel van de verlies-van-functie van het gemuteerde allel compenseren kan binnengebracht. Het vergelijken van het fenotype van de aangevuld stam met die van de oorspronkelijke mutant zowel de ouderlijke, is wild-type stam vereist.

Streptomyceten zijn gram-positieve bacteriën, draadvormige bodem bacteriën bekend om hun vermogen om te produceren een aantal secundaire metabolieten, met inbegrip van meer dan tweederde van de verkrijgbare antibiotica, zo goed als anti-tumor, anti-HIV-virus en anti-parasitaire drugs 1. S. coelicolor is het meest genetisch gekarakteriseerd lid van het geslacht2,3 en is van de soort gebruikt in de hier beschreven methoden. S. coelicolor heeft een complexe levenscyclus, die begint met de ontkieming van een enkele spore, tot een uitgebreide, vertakkende vegetatieve mycelium die groeit uit tot het medium van de agar. Aangezien de levenscyclus te werk gaat, zijn luchtfoto door samensmelting van filamenten die breken de oppervlaktespanning van het substraat mycelium en ten slotte zijn onderverdeeld in lange ketens van cellen die uiteindelijk in volwassen, grijs-gepigmenteerde sporen omgezet zijn gevormd. Verspreiding van deze nieuw gevormde sporen vormt het begin van de volgende levenscyclus4.
Vanwege het complexe patroon van differentiatie dient S. coelicolor als een uitstekend model voor de studie van bacteriële ontwikkeling. Historisch, mutaties resulteren in blokken voor twee grote stadia van ontwikkeling en produceren verschillende visuele fenotypen. De (kale) mutants bld worden geblokkeerd voor luchtfoto mycelium vorming en het ontbreken van een fuzzy luchtfoto mycelium meegeven van een "kale" kolonie uiterlijk geven. Mutanten in spore vorming geremd en rijping worden aangeduid als whi (wit) mutanten omdat ze meestal niet produceren wild-achtige velden van het grijze spore pigment en de antenne mycelium blijft wit. Andere interessante mutanten zijn geremd in antibiotica productie, celdeling, chromosoom segregatie of andere belangrijke processen4,5.
Ondanks de ontdekking van vele developmental genen in Streptomyces -soorten zijn er veel meer geloofde bestaan op basis van het gebrek aan verzadiging van mutant schermen. Onze laboratoria blijven om nieuwe ontwikkelings genen met behulp van een mini transposon-systeem dat we hebben opgebouwd te identificeren. Roman gemuteerde stammen geïsoleerd in willekeurige mutagenese experimenten met onze transposon ondergaan fenotypische screening om te identificeren van de mogelijke rol van elke nieuwe gen ontdekt6,7. De methoden voor bacteriële fenotypering beschreven hier zijn relevant voor Streptomyces mutanten geïsoleerd door transposon mutagenese8,9,10,11,12, 13 en andere willekeurige methoden, zoals chemische en ultra violet (UV) mutagenese14, evenals de gestuurde bouw van mutaties als gene standaardknop te definiëren met behulp van recombineering15,16 of CRISPR-Cas9 (geclusterd regelmatig Interspaced korte palindromische herhaalt) genoom technologie17,18,19 en puntmutaties20bewerken.
Antibiotica-resistentie bij ziekteverwekkers naarmate steeds meer voorkomende, wordt de behoefte aan nieuwe antibiotica steeds urgenter21,22. De "Kleine wereld-initiatief" (of SWI) is een effectieve wetenschap, technologie, techniek en wiskunde (STEM) leren23 en onderzoek strategie24 ter bestrijding van resistentie tegen antibiotica via de crowdsourcing van studenten, en meer onlangs middelbare scholieren. Ondersteund cursussen werk omvat het identificeren van nieuwe bodem-microben die produceren van nieuwe antibiotica (http://www.smallworldinitiative.org). Het is van mening dat een belangrijke bron van onontdekte antibiotica blijven zal Streptomyces -soorten gevonden in een brede waaier van bodem en water habitats25,26,27,28, 29,31. Onlangs, ons laboratorium en het werk van anderen hebben ontdekt en gekenmerkt signalering genen in Streptomyces -soorten die regelen morfologie en ontwikkeling, met inbegrip van antibiotica productie7,32, 33. Veranderingen in de expressie van genen die deze resulteren in een verandering in de hoeveelheid en de timing van antibiotica geproduceerd. Geschoolde fenotypering van nieuwe soorten en nieuwe antibioticum-producerende mutanten blijft belangrijk. Naarmate nieuwe instructeurs en hun leerlingen belangrijke leverden op het gebied van Geneesmiddelenontwikkeling, is opleiding in bacteriële fenotypering noodzakelijk voor het welslagen van deze beginnende individuen. Bovendien zijn deze experimenten hanteerbare voor middelbare school stam of universiteit microbiologie onderwijs laboratoria. Zij vertegenwoordigen een demonstratie van microbiële genetische basisprincipes van een onderwijs-lab instellen.

<table><tbody><tr><td>50% Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Immersion Oil (Type DF)</td><td>Cragille&nbsp;</td><td>16482</td><td></td></tr><tr><td>Lens Paper</td><td>Fisherbrand</td><td>11-995</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Water</td><td>GeneMate</td><td>G-3250-1L</td><td></td></tr><tr><td>100% Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Propidium Iodide</td><td>Invitrogen</td><td>P1304MP</td><td></td></tr><tr><td>Toothpicks (flat)</td><td>Target</td><td>081-22-1957</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Tips (10 mL)</td><td>GeneMate</td><td>P-1240-10</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Tips (200 mL)</td><td>GeneMate</td><td>P-1240-200Y</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Tips (1,250 mL)</td><td>GeneMate</td><td>P-1240-1250</td><td></td></tr><tr><td>Wooden Applicators 6''</td><td>Solon Care</td><td>070809</td><td></td></tr><tr><td>Cotton Swabs</td><td>Fisherbrand</td><td>23-400-124</td><td></td></tr><tr><td>Soy Flour&nbsp;</td><td>Bob's Red Mill&nbsp;</td><td>1516C164</td><td></td></tr><tr><td>D-Mannitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4125-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1296-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol 100%</td><td>VWR amresco life science&nbsp;</td><td>0854-1L</td><td></td></tr><tr><td>0.8% NaCl (Saline)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLBB9000V</td><td></td></tr><tr><td>1.2 mL freezer tube</td><td>NEST</td><td>606101</td><td></td></tr><tr><td>Ultra low (-80 &deg;C) freezer</td><td>SO-LOW</td><td>U85-18</td><td></td></tr><tr><td>Cryo Safety Gloves</td><td>Bel-Art</td><td>H13201</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5856-500EA</td><td></td></tr><tr><td>Cover slips #1.5</td><td>Thomas Scientific</td><td>64-0721</td><td></td></tr><tr><td>Slides</td><td>Carolina</td><td>63-2010</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>Tuttnauer</td><td>2540E</td><td></td></tr><tr><td>Phase-Contrast Microscope&nbsp;</td><td>Olympus</td><td>BX40</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Carolina Biological</td><td>624504</td><td></td></tr><tr><td>Bunsen Burner</td><td>Carolina Biological</td><td>706706</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860-1L-R</td><td></td></tr><tr><td>PBS (phosphate buffer saline)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417-50TAB</td><td></td></tr><tr><td>WGA-FITC</td><td>Biotium</td><td>29022-1</td><td></td></tr><tr><td>Clear nail polish</td><td>OPI</td><td>22001009000</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>Free Software</td><td></td></tr><tr><td>100 mL beaker</td><td>Pyrex USA</td><td>1000-T</td><td></td></tr><tr><td>1 L beaker</td><td>Carolina Biological</td><td>721253</td><td></td></tr><tr><td>1 L flask</td><td>Fisherbrand</td><td>S63274</td><td></td></tr><tr><td>250 mL flask</td><td>Pyrex USA</td><td>4980</td><td></td></tr><tr><td>100 mL graduated cylinder</td><td>Carolina Biological</td><td>721788</td><td></td></tr><tr><td>500 mL graduated cylinder&nbsp;</td><td>Carolina Biological</td><td>721792</td><td></td></tr><tr><td>Stir Bar</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-271825</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Camera for Microscope</td><td>Olympus</td><td>DP72</td><td></td></tr><tr><td>Nitrile Examination Gloves (Med)</td><td>Bio Excell</td><td>71011002</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Mixer</td><td>Carolina Biological</td><td>701077</td><td></td></tr></tbody></table>

visuele en microscopische evaluatie van streptomyces developmental mutanten

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Streptomyceten zijn draadvormige bodem bacteriën behorend tot het phylum Straalzwammen die zijn gevonden over de hele wereld en produceren een breed scala van antibiotica en andere secundaire metabolieten. Streptomyces coelicolor is een goed gekarakteriseerd, niet-pathogene soorten die is vatbaar voor allerlei analyses in het lab. De fenotypering methoden beschreven hier maken gebruik van S. coelicolor als een model streptomycete; de methoden zijn echter voor alle leden van dit geslacht, evenals sommige nauw verwante Actinomyceten. Fenotypering moet karakteriseren van nieuwe soorten Streptomyces geïdentificeerd in het milieu, en het is ook een belangrijke eerste stap in karakterisering van nieuwe geïsoleerde gemuteerde stammen van Streptomyces. Vaardigheid in fenotypering is belangrijk voor de vele nieuwe onderzoekers die komen op het gebied van Streptomyces onderzoek, waarin de studie van bacteriële ontwikkeling, celdeling, chromosoom segregatie en tweede messenger signalering. De recente crowdsourcing antibiotica ontdekkingstocht door het isolement van de nieuwe bodem-microben heeft geleid tot een toegenomen behoefte aan opleiding in fenotypering voor instructeurs nieuwe op het gebied van Streptomyces onderzoek en hun hogeschool of middelbare school studenten. Dit manuscript worden methoden beschreven voor bacteriële stam verspreiding, opslag en karakterisatie door middel van visuele en microscopisch onderzoek. Na het lezen van dit artikel, moet de nieuwe onderzoekers (Microbiologie Onderwijs laboratoria en burger wetenschappers) kunnen manipuleren van Streptomyces stammen en visuele karakterisering experimenten beginnen.

Eerste fenotypering experimenten nodig zijn voor het karakteriseren van nieuwe soorten en stammen en kunnen worden gebruikt als een gratis benadering de fylogenie en DNA-DNA hybridisatie experimenten die worden gebruikt voor het karakteriseren van nieuwe soorten. Streptomyces mutanten die voortvloeien uit willekeurige mutagenese methoden zoals chemische, UV, of transposon mutagenese worden normaal gesproken aangeduid door directe, visuele schermen op agar platen. Koloniën van Streptomyces worden onderzocht op wijzigingen in fenotype in vergelijking met de wild-type, ouderlijke stam. Bijvoorbeeld, een lichter gekleurde luchtfoto mycelium kan duiden op een lager niveau van grijze pigment veroorzaakt door een defect van de sporevorming, of het ontbreken van een vage uitstraling is een indicatie van een blok in luchtfoto mycelium vorming (Figuur 1). Vele Streptomyceten produceren gepigmenteerde antibiotica in vegetatieve mycelium of omliggende agar. S. coelicolor produceert twee gepigmenteerde antibiotica evenals twee niet-gepigmenteerde ones. Actinorhodin is een antibioticum blauw-gepigmenteerde en undecylprodigiosin is een rood-gepigmenteerde antibiotica45. Stammen die eerste visuele kolonie schermen hebben ondergaan worden vervolgens doorgegeven door strepen voor enkele kolonies.
Naar aanleiding van visuele identificatie van potentieel interessante mutanten, stammen zijn onderworpen aan microscopisch onderzoek. Fase contrast microscopie is vooral geschikt voor de behandeling van Streptomyces mutanten voor ontwikkelingsstoornissen gebreken, met behulp van de wild-type stam als een besturingselement (Figuur 2). Wild type S. coelicolor kolonies produceren meestal een luchtfoto mycelium door ongeveer twee dagen van de groei bij 30 ° C op MS agar en lange ketens van sporen door drie dagen van de groei. De levenscyclus zal de voortgang iets langzamer of sneller op andere soorten media. Het is noodzakelijk dat de mutanten onder dezelfde voorwaarden als het wild type groei worden geanalyseerd wanneer de conclusies over de ontwikkelingstoxiciteit gebreken en vertragingen. Kale mutanten kunnen produceren sporen na langdurige groei op agarmedia. Een klasse van mutanten genoemd witte mutanten kunnen ofwel worden uitgesteld voor spore vorming, geven een vermindering in de overvloed aan sporen geproduceerd, produceren sporen met vorm en/of grootte defecten of gewoon produceren lagere niveaus van de volwassen, grijze spore pigment46 . Andere mutanten die tot nu toe onderzocht kunnen worden vertraagd of versneld in de progressie van de levenscyclus zoals de mutanten getroffen voor de accumulatie van signalering van moleculen (b.v., cyclische-di-GMP47).
Een eenvoudige opvolger van de techniek van de lichte microscopie van hierboven beschreven is fluorescentie microscopie propidium jodide vlek chromosomale DNA nucleoids en fluorescently geëtiketteerde tarwekiemen agglutinin gebruiken om de celwand van de sporevorming septa vlek. Sporen ontbreekt een chromosoom zullen verstoken van de rode propidium jodide kleuring, terwijl de sporen die minder DNA bevatten dan gebruikelijke kan worden geïdentificeerd als ze lijken te zijn gedaald kleuring (Figuur 3). Tarwekiemen agglutinin kan worden gebruikt om de celwand vlek en verschillen in de celwand kleuring patronen (d.w.z., celdeling gebreken) kunnen worden waargenomen. In Figuur 4 het wild-type stam van S. venezuelae, een soort die onlangs wordt gebruikt als een ander model heeft streptomycete vanwege de snellere levenscyclus en de mogelijkheid om te sporulate in vloeibare45, zijn gekleurd met WGA-FITC ophelderen de ladder-achtige array van divisie septa die meestal vroeg tijdens sporevorming gezien.
De eerste fenotypering strategieën hier beschreven moeten leiden tot het volgende: 1) identificatie van gemuteerde stammen van belang voor verdere studie; 2) verworven kennis over de onlangs vastgestelde mutant en de potentiële rol van het gen dat gemuteerd is geweest; 3) het formuleren van een volgende reeks van experimentele vervolgstappen die kan worden gebruikt om de rol van het gen in kwestie verder te verduidelijken. In het geval van een nieuw geïdentificeerde streptomycete uit de omgeving krijgt de onderzoeker kennis van de potentiële nieuwe soorten t.o.v. al gekenmerkt soorten Streptomyces.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57373/57373fig1.jpg"> Figuur 1: Foto van een representatieve agarplaat demonstreren macroscopische kolonie fenotypes van S. coelicolor. De agarplaat toont de fuzzy, grijze uiterlijk van de antenne mycelium voor wild-type S. coelicolor stam MT1110 (WT) in vergelijking met verschillende willekeurige transposon insertiemutanten met ontwikkelingsstoornissen fenotypen. Mutanten ontbreken ofwel een luchtfoto mycelium [kale (bld)] of een luchtfoto mycelium met verminderde spore pigmentatie [white (whi)]. Transposon mutanten werden gegenereerd met behulp van mini-Tn5 voor invoegpositie mutagenese6,7. De stammen werden geteeld op MS agar voor 5 dagen bij 30 ° C. De diameter van de petrischaal, 100 mm.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57373/57373fig2.jpg"> Figuur 2: Fase contrast microfoto tonen een vertegenwoordiger luchtfoto gloeidraad voor S. coelicolor witte mutant stammen met willekeurige transposon invoeging mutaties. (A) getoond is een representatieve wild type antenne gloeidraad die heeft ondergaan synchrone, regelmatig regelafstand celdelingen, produceren gelijkmatig gevormde en sporen (MT1110) formaat. (B--F) De overige panelen tonen de enorm verschillende microscopische fenotypes van verschillende witte mutanten die geïsoleerd via willekeurige transposon mutagenese werden. Paneel B toont een luchtfoto gloeidraad die geen sporevorming heeft ondergaan, maar in plaats daarvan heeft geproduceerd uitpuilende gebieden binnen de gloeidraad. Lange pijlen in C, Den F geven aan abnormaal grote sporen die karakteristiek voor mutanten, MIC42, MIC43 en TH49 zijn. De korte pijl in deelvenster D geeft een voorbeeld van een compartiment lysed spore. Paneel E toont de gedeeltelijk vernauwde kleinere compartimenten die kenmerkend voor de ketens van de spore geproduceerd door de mutant TH10 zijn. De stammen werden geteeld op MS agar voor 5 dagen bij 30 ° C. De mutanten zijn niets te maken met die worden weergegeven in Figuur 1. Een wild type spore is ongeveer 1.1 µm op de lengteas. Schaal bar = 2 µm. <a href="/files/ftp_upload/57373/57373fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57373/57373fig3v2.jpg"> Figuur 3: Vertegenwoordiger microfoto weergegeven: S. coelicolor mutant chromosoom segregatie fenotypen. (A) A diagram vertegenwoordiging toont de typische wild-type, regelmatig regelafstand kleuring uitstraling voor een keten van sporen (elke spore bevat chromosomale DNA) in vergelijking met de intermitterende kleuring patroon voor een mutant waarin een chromosoom segregatie defect. (B) elk paar panelen toont de dezelfde spore keten waargenomen door differentiële interferentie Contrast (DIC) beeld aan de linkerkant en een beeld van de jodide gebeitste fluorescentie propidium wordt weergegeven aan de rechterkant. Het fenotype van de wild-type (a, b) wordt vergeleken met twee willekeurige transposon insertiemutanten (c, d en e, f). Pijlen geven aan sporen verstoken van DNA. De stammen werden geteeld op MS agar voor 5 dagen bij 30 ° C. De mutanten die weergegeven zijn niets te maken met die in Figuur 1 en Figuur 2. Schaal bar = 1 µm. <a href="/files/ftp_upload/57373/57373fig3v2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57373/57373fig4v3.jpg"> Figuur 4: Fluorescentie opname van S. venezuelae wild-type stam gekleurd met WGA-FITC. (A) A diagram van een luchtfoto gloeidraad verschijnt glad met geen inspringingen en geen zichtbare tekenen van sporevorming met fase contrast microscopie in vergelijking met de ladder-achtige matrix van de celwand kleuring die aangeeft van een vroeg stadium van de sporevorming heeft begonnen in dat dezelfde gloeidraad met WGA-FITC onder fluorescentie microscopie. (B) microfoto van wild-type S. venezuelae. (een) glad luchtfoto filamenten staan onder kettingen van sporen. (b) binnen het mycelium weergegeven in het deelvenster, een luchtfoto gloeidraad in een vroeg stadium van ontwikkeling bezit een ladder-achtige serie van afzetting van de celwand. Pijlen geven aan de vorming van regelmatig regelafstand van cross-muren gekleurd door WGA-FITC die synchroon te ontwikkelen binnen een enkele antenne gloeidraad als het ontwikkelingsachterstand-geassocieerde sporevorming ondergaat. De spanning werd gekweekt op MYM ( Y-Oosten extract,Maltose, Malt extract) MYM agar voor 38 h bij 30 ° C. Schaal bar = 2 µm. <a href="/files/ftp_upload/57373/57373fig4v3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Hier presenteren we protocollen voor beginnende onderzoekers om te starten fenotypering voor het farmacologisch belangrijke bacteriële genus Streptomyces.

Visuele en microscopische evaluatie van Streptomyces Developmental mutanten

Streptomycetes are filamentous soil bacteria belonging to the phylum Actinobacteria that are found throughout the world and produce a wide array of ...

Het algemene doel van de volgende technieken is om beginnende onderzoekers te trainen om te werken met Streptomyces en andere verwante soorten in het onderwijslaboratorium van de universiteit en op de middelbare school. Fenotypische observatie is belangrijk voor de vele onderzoekers die het gebied van Streptomyces-onderzoek betreden. Deze video beschrijft methoden voor bacteriële propagatie, opslag en visuele en microscopische onderzoeking.De hier beschreven fenotyperingmethoden gebruiken Streptomyces coelicolor als model. De methoden zijn echter toepasbaar op alle leden van het grote geslacht en nauw verwante Actinomyces. Het grote voordeel van deze technieken is dat ze zijn ontworpen om toegankelijk te zijn voor beginnende onderzoekers in een middelbare schoolklas of onderzoekslaboratorium voor bachelorstudenten, evenals ervaren laboratoriumpersoneel.Na het bekijken van deze video en het lezen van het bijbehorende protocol, zouden nieuwe onderzoekers in staat moeten zijn om hun Streptomyces-stammen te manipuleren, ze goed op te slaan en te beginnen met visuele karakteriseringsexperimenten. De procedures worden gedemonstreerd door Garret Kandell en Sean Kirk, onderzoeksstudenten aan de universiteit uit mijn laboratorium aan de Otterbein University. Om te beginnen, gebruikt u een standaardmethode, zoals de kwadrantstreepstrookmethode die in Saunders 2012 wordt gedemonstreerd, om Streptomyces-stammen op MS-agarplaten te strijken en in enkele kolonies te kweken.Elke vier tot zes dagen, neem een enkele kolonie en strijk deze opnieuw op een nieuwe plaat. Naarmate de kolonies ouder worden, worden ze vatbaar voor willekeurige mutaties. Na het uitvoeren van mutagenese volgens het tekstprotocol, let op de koloniemorfologie voor elke mutant in vergelijking met de wilde type ouderstam.Wanneer u nieuwe Streptomyces-soorten karakteriseert, vergelijkt u de nieuwe isolaat met die van een goed bestudeerde soort en let u op de basisvorm, het oppervlak van de kolonie, de ondoorzichtigheid, de elevatie en de pigmentatie. Label een MS-agarplaat en strijk wilde type en mutante stammen in wigpatronen. Zorg ervoor dat geen enkele stam een andere aanraakt om kruisbesmetting te voorkomen.Noteer de datum en tijd dat de stammen op de plaat worden gestreken. Bewaar vervolgens de platen bij 30 graden Celsius. Onthoud dat het uiterst belangrijk is om uw Streptomyces-monster altijd te beschermen tegen besmetting.Gebruik uw beste steriele techniek voor alle stappen bij het openen van platen en buisjes voor de minste hoeveelheid tijd mogelijk. Plaats geteelde petrischalen op gekleurd of wit papier om de achtergrond te homogeniseren. Schrijf op het papier de stamnaam, datum, incubatietemperatuur en tijd vanaf het eerste strijken van de plaat.Maak digitale foto's van de plaat met de staminformatie geschreven op de papierachtergrond, zodat verwarring minimaal is. Steriliseer pincetten door ze in 70% ethanol te wassen en ze vervolgens door een Bunsenbrandervlammetje te halen om de ethanol te laten verdampen. Steriliseer dekglasjes door ze in 70% ethanol te wassen en ze vervolgens te laten drogen in een steriele petrischaal.Vervolgens, om een ​​dekglaslift van bacteriële groei voor te bereiden, gebruikt u steriele pincetten om een ​​steriele dekglas op te nemen en plaatst u het dekglas op een MS-agarplaat waar de bacteriële groei dicht is. Gebruik pincetten om zachtjes op de achterkant van het dekglas te drukken om voldoende overdracht van bacteriële sporen en luchtmycelium te garanderen. Neem het dekglas van de plaat en plaats het onder een hoek van 45 graden met het cellenmateriaal naar het oppervlak van een microscoopglas met een druppel van 15 microliter 50% glycerol.Laat het dekglas op het glycerol vallen, wat luchtbellen zal verminderen. Om fasecontrastmicroscopie uit te voeren op verschillende tijdsintervallen, plaatst u de voorbereide glijbaan op het microscoopplatform en voegt u een druppel immersieolie toe aan het midden van het dekglas. Draai het 100x faseobjectief op zijn plaats en stel de condensatortoren in op de juiste bijbehorende fase-instelling.Zodra het objectieflens in contact komt met de olie, gebruikt u alleen de fijne afstelknop om het beeld te focussen. Bekijk verschillende gezichtsvelden om merkbare en consistente verschillen tussen mutante stammen en de wilde type te onderscheiden. Bijvoorbeeld het vermogen om sporen te vormen, sporengrootte en -vorm en het totale aantal sporen.Gebruik steriele pincetten om een ​​dekglaslift van een MS-agarplaat te bereiden zoals eerder waar bacteriële groei duidelijk is, lichtjes de achterkant van het dekglas aanraken met de pincetten om voldoende overdracht van bacteriële sporen en luchtfilamenten te garanderen. Neem het dekglas van de plaat en plaats het op hard karton zodat de zijde met celmateriaal omhoog gericht is voor gemak en manipulatie van het dekglas. Overspoel het dekglas met ijskoud methanol en laat het vijf minuten staan.Gebruik PBS om het dekglas twee keer te wassen door de oplossing voorzichtig te doseren en te verwijderen. Voeg 15 microliter van een oplossing van 10 microgram per milliliter propidiumjodide toe en/of 10 microgram per milliliter WGA-FITC aan een glijbaan. Plaats het dekglas met de zijde naar beneden op een druppel fluorescerende vlek.Bewaar de monsters in een donkere of zwak verlichte kamer gedurende 15 minuten. Voorraden van de fluorescerende vlekken en vlekmonsters moeten worden beschermd tegen licht. Het wordt aanbevolen dat onderzoekers gebruik maken van omstandigheden met weinig licht tijdens het voorbereiden van monsters en een donkere doos gebruiken om monsters te bewaren zodra ze zijn voorbereid.Bekijk de glijbanen onder een objectieflens van 100x met behulp van een fasecontrast- of DIC-microscoop uitgerust met epifluorescentie-exciterende kubussen voor propidiumjodide en FITC. Analyseer de beelden volgens het tekstprotocol. Hier getoond zijn voorbeelden van Streptomyces-mutanten die het resultaat zijn van transposonmutagenese.Een lichtere kleur luchtmycelium kan wij

visual-microscopic-evaluation-streptomyces-developmental

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Gendeletie en eiwit overexpressie zijn gemeenschappelijke methoden voor het bestuderen van functies van eiwitten. In dit artikel beschrijven we een protocol voor de analyse van fenotype ontwikkeling als een functie van de proteïne concentratie op de bevolking en de single-cell niveau...

Analyse van de ontwikkeling van een morfologische fenotype als een functie van de eiwitconcentratie in gist

Source: Bennett, J. A., et al. Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates the cultivation and phenotypic comparison of wild-type and mutant Streptomyces coelicolor strains. It outlines procedures for minimizing spontaneous mutations, preventing cross-contamination, and promoting bacterial growth through proper plating techniques. Finally, the video highlights visual differences in colony morphology to illustrate the...

Phenotypic Comparison of Wild-Type and Mutant Strains of Streptomyces coelicolor

Source: Bennett, J. A. et al. Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates the use of phase-contrast microscopy to examine phenotypic differences between wild-type and mutant Streptomyces coelicolor. It outlines the steps involved in preparing and imaging aerial filaments to detect developmental defects in spore formation.

Phase-Contrast Microscopy for Evaluating Developmental Mutants in Streptomyces

Streptomyces worden gekenmerkt door een complexe levenscyclus die experimenteel uitdagend is gebleken om te bestuderen met cellulair-biologische methoden. Hier presenteren we een protocol om fluorescentie time-lapse microscopie van de volledige levenscyclus uit te voeren door Streptomyces venezuelae te laten groeien in een microfluïdisch apparaat.

Fluorescentie Time-lapse beeldvorming van de volledige<em&gt; S. venezuelae</em&gt; Life Cycle Met behulp van een microfluïdische apparaat

Afbeelden van de morfogenese van insecten embryo met licht-sheet based fluorescentiemicroscopie is state of the art worden. Dit protocol beschrijft en vergelijkt drie montagetechnieken geschikt voor Tribolium castaneum embryo, worden twee nieuwe op maat gemaakte transgene lijnen geschikt voor levende imaging bespreekt essentiële kwaliteitscontroles en geeft de huidige experimentele beperkingen.

Light-Sheet gebaseerd fluorescentiemicroscopie van de levens- of gefixeerd en gekleurd<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; Embryo&#39;s

De nematode Caenorhabditis elegans is een uitstekend model te ontleden gastheer-pathogeen interacties. Hier beschreven is een protocol te infecteren de worm met leden van de mitis groep streptokokken en activering van de oxidatieve stressrespons tegen H2O2 geproduceerd door deze groep van organismen te bepalen.

Studeren oxidatieve Stress veroorzaakt door de streptokokken groep Mitis in Caenorhabditis elegans

Germinant receptor eiwitten cluster in 'germinosomes' in het binnenste membraan van sporen van Bacillus subtilis . We beschrijven een protocol met behulp van super resolutie microscopie en TL verslaggever eiwitten om te visualiseren van germinosomes. Het protocol geeft ook spore binnenste membraan domeinen die zijn bij voorkeur gekleurd met de membraan kleurstof FM4-64.

Visualisatie van Germinosomes en het binnenste membraan in sporen van Bacillus subtilis

Dit werk beschrijft een semi-High-throughput protocol dat gelijktijdige 3D time-lapse beeldvorming van embryogenese in 80 – 100 C. elegans embryo's in een enkele nachtelijke run toestaat. Daarnaast worden tools voorbeeld verwerking en visualisatie meegeleverd om de gegevensanalyse te stroomlijnen. De combinatie van deze methoden met aangepaste reporter stammen maakt gedetailleerde controle van embryogenese.

Een semi-High-throughput imaging methode en data visualisatie Toolkit om C. elegans embryonale ontwikkeling te analyseren

Dit is een veelgebruikte methode voor C. elegans gonad-dissectie gevolgd door vriesscheur, die kiembaanmonsters produceert voor immunofluorescentie via antilichaamkleuring, of voor eenvoudige DAPI-kleuring om DNA te visualiseren. Dit protocol is succesvol geweest voor studenten in een onderzoekslaboratorium en in een op cursussen gebaseerde niet-gegradueerde onderzoekservaring.

C. elegans Gonad dissectie en freeze crack voor immunofluorescentie en DAPI-kleuring

Dit manuscript beschrijft een methode voor het screenen van middelgrote Candida albicans mutante bibliotheken op morfogenese fenotypes tijdens actieve infectie in een zoogdier gastheer met behulp van niet-invasieve confocale microscopie.

Gebruik van in vivo beeldvorming om te screenen op morfogenese fenotypes in Candida albicans mutante stammen tijdens actieve infectie bij een zoogdiergastheer

Leer fenotypische karakterisering van Streptomyces voor microbiologisch onderzoek met behulp van Streptomyces coelicolor. Deze toegankelijke methoden helpen beginnende onderzoekers bij het visualiseren en analyseren van bacteriële mutanten.

Visuele en microscopische evaluatie van Streptomyces Developmental mutanten

Meer video's verkennen