Visuele en microscopische evaluatie van Streptomyces Developmental mutanten
September 12th, 2018
Hier presenteren we protocollen voor beginnende onderzoekers om te starten fenotypering voor het farmacologisch belangrijke bacteriële genus Streptomyces.
Het algemene doel van de volgende technieken is om beginnende onderzoekers te trainen om te werken met Streptomyces en andere verwante soorten in het onderwijslaboratorium van de universiteit en op de middelbare school. Fenotypische observatie is belangrijk voor de vele onderzoekers die het gebied van Streptomyces-onderzoek betreden. Deze video beschrijft methoden voor bacteriële propagatie, opslag en visuele en microscopische onderzoeking.
De hier beschreven fenotyperingmethoden gebruiken Streptomyces coelicolor als model. De methoden zijn echter toepasbaar op alle leden van het grote geslacht en nauw verwante Actinomyces. Het grote voordeel van deze technieken is dat ze zijn ontworpen om toegankelijk te zijn voor beginnende onderzoekers in een middelbare schoolklas of onderzoekslaboratorium voor bachelorstudenten, evenals ervaren laboratoriumpersoneel.
Na het bekijken van deze video en het lezen van het bijbehorende protocol, zouden nieuwe onderzoekers in staat moeten zijn om hun Streptomyces-stammen te manipuleren, ze goed op te slaan en te beginnen met visuele karakteriseringsexperimenten. De procedures worden gedemonstreerd door Garret Kandell en Sean Kirk, onderzoeksstudenten aan de universiteit uit mijn laboratorium aan de Otterbein University. Om te beginnen, gebruikt u een standaardmethode, zoals de kwadrantstreepstrookmethode die in Saunders 2012 wordt gedemonstreerd, om Streptomyces-stammen op MS-agarplaten te strijken en in enkele kolonies te kweken.
Elke vier tot zes dagen, neem een enkele kolonie en strijk deze opnieuw op een nieuwe plaat. Naarmate de kolonies ouder worden, worden ze vatbaar voor willekeurige mutaties. Na het uitvoeren van mutagenese volgens het tekstprotocol, let op de koloniemorfologie voor elke mutant in vergelijking met de wilde type ouderstam.
Wanneer u nieuwe Streptomyces-soorten karakteriseert, vergelijkt u de nieuwe isolaat met die van een goed bestudeerde soort en let u op de basisvorm, het oppervlak van de kolonie, de ondoorzichtigheid, de elevatie en de pigmentatie. Label een MS-agarplaat en strijk wilde type en mutante stammen in wigpatronen. Zorg ervoor dat geen enkele stam een andere aanraakt om kruisbesmetting te voorkomen.
Noteer de datum en tijd dat de stammen op de plaat worden gestreken. Bewaar vervolgens de platen bij 30 graden Celsius. Onthoud dat het uiterst belangrijk is om uw Streptomyces-monster altijd te beschermen tegen besmetting.
Gebruik uw beste steriele techniek voor alle stappen bij het openen van platen en buisjes voor de minste hoeveelheid tijd mogelijk. Plaats geteelde petrischalen op gekleurd of wit papier om de achtergrond te homogeniseren. Schrijf op het papier de stamnaam, datum, incubatietemperatuur en tijd vanaf het eerste strijken van de plaat.
Maak digitale foto's van de plaat met de staminformatie geschreven op de papierachtergrond, zodat verwarring minimaal is. Steriliseer pincetten door ze in 70% ethanol te wassen en ze vervolgens door een Bunsenbrandervlammetje te halen om de ethanol te laten verdampen. Steriliseer dekglasjes door ze in 70% ethanol te wassen en ze vervolgens te laten drogen in een steriele petrischaal.
Vervolgens, om een dekglaslift van bacteriële groei voor te bereiden, gebruikt u steriele pincetten om een steriele dekglas op te nemen en plaatst u het dekglas op een MS-agarplaat waar de bacteriële groei dicht is. Gebruik pincetten om zachtjes op de achterkant van het dekglas te drukken om voldoende overdracht van bacteriële sporen en luchtmycelium te garanderen. Neem het dekglas van de plaat en plaats het onder een hoek van 45 graden met het cellenmateriaal naar het oppervlak van een microscoopglas met een druppel van 15 microliter 50% glycerol.
Laat het dekglas op het glycerol vallen, wat luchtbellen zal verminderen. Om fasecontrastmicroscopie uit te voeren op verschillende tijdsintervallen, plaatst u de voorbereide glijbaan op het microscoopplatform en voegt u een druppel immersieolie toe aan het midden van het dekglas. Draai het 100x faseobjectief op zijn plaats en stel de condensatortoren in op de juiste bijbehorende fase-instelling.
Zodra het objectieflens in contact komt met de olie, gebruikt u alleen de fijne afstelknop om het beeld te focussen. Bekijk verschillende gezichtsvelden om merkbare en consistente verschillen tussen mutante stammen en de wilde type te onderscheiden. Bijvoorbeeld het vermogen om sporen te vormen, sporengrootte en -vorm en het totale aantal sporen.
Gebruik steriele pincetten om een dekglaslift van een MS-agarplaat te bereiden zoals eerder waar bacteriële groei duidelijk is, lichtjes de achterkant van het dekglas aanraken met de pincetten om voldoende overdracht van bacteriële sporen en luchtfilamenten te garanderen. Neem het dekglas van de plaat en plaats het op hard karton zodat de zijde met celmateriaal omhoog gericht is voor gemak en manipulatie van het dekglas. Overspoel het dekglas met ijskoud methanol en laat het vijf minuten staan.
Gebruik PBS om het dekglas twee keer te wassen door de oplossing voorzichtig te doseren en te verwijderen. Voeg 15 microliter van een oplossing van 10 microgram per milliliter propidiumjodide toe en/of 10 microgram per milliliter WGA-FITC aan een glijbaan. Plaats het dekglas met de zijde naar beneden op een druppel fluorescerende vlek.
Bewaar de monsters in een donkere of zwak verlichte kamer gedurende 15 minuten. Voorraden van de fluorescerende vlekken en vlekmonsters moeten worden beschermd tegen licht. Het wordt aanbevolen dat onderzoekers gebruik maken van omstandigheden met weinig licht tijdens het voorbereiden van monsters en een donkere doos gebruiken om monsters te bewaren zodra ze zijn voorbereid.
Bekijk de glijbanen onder een objectieflens van 100x met behulp van een fasecontrast- of DIC-microscoop uitgerust met epifluorescentie-exciterende kubussen voor propidiumjodide en FITC. Analyseer de beelden volgens het tekstprotocol. Hier getoond zijn voorbeelden van Streptomyces-mutanten die het resultaat zijn van transposonmutagenese.
Een lichtere kleur luchtmycelium kan wij
Overzicht
Dit artikel presenteert protocollen die zijn ontworpen voor beginnende onderzoekers om fenotypering van het bacteriële geslacht Streptomyces te initiëren. Het benadrukt het belang van fenotypische observatie in Streptomyces-onderzoek en biedt methoden voor bacteriële propagatie en onderzoek.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Microbiologie
- Genetica
- Laboratoriumtechnieken
Achtergrond
- Streptomyces is een farmacologisch significant bacterieel geslacht.
- Fenotypering is cruciaal voor onderzoekers die dit veld betreden.
- Methoden zijn toepasbaar in zowel educatieve als onderzoeksomgevingen.
- Streptomyces coelicolor dient als modelorganisme.
Doel van het onderzoek
- Om beginnende onderzoekers te trainen in het omgaan met Streptomyces.
- Om toegankelijke technieken te bieden voor bacteriële manipulatie en karakterisering.
- Om visuele onderzoeking van bacteriestammen te vergemakkelijken.
Gebruikte methoden
- Quadrant streak-methode voor het kweken van Streptomyces-stammen.
- Microscopisch onderzoek van bacteriële groei.
- Gebruik van fluorescente kleuringstechnieken.
- Fasencontrastmicroscopie voor gedetailleerde observatie.
Belangrijkste resultaten
- Gedemonstreerde procedures voor correcte stammanipulatie en -opslag.
- Geïdentificeerde morfologische verschillen tussen wild type en mutante stammen.
- Richtlijnen verschaft voor het voorkomen van besmetting tijdens experimenten.
- De impact van mutagenese op Streptomyces-kenmerken weergegeven.
Conclusies
- Toegankelijke protocollen kunnen de training van beginnende onderzoekers verbeteren.
- Visuele karakterisering is essentieel voor het begrijpen van Streptomyces-biologie.
- Juiste technieken zorgen voor betrouwbare resultaten in bacteriologisch onderzoek.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Visual and microscopic phenotyping of Streptomyces developmental mutants provides foundational data for early-stage target validation and mechanistic de-risking in antibiotic discovery. Standardized characterization of mutant strains supports predictive confidence in linking genotype to phenotype, which is critical for prioritizing biosynthetic pathways and functional targets. These methods enable reproducible, scalable workflows that underpin portfolio decisions in natural product R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic interrogation of gene function through observable phenotypic changes.
- Supports biological de-risking by distinguishing developmental defects from wild-type characteristics.
- Facilitates functional target validation by correlating genetic mutations with developmental outcomes.
- Provides a reproducible framework for triaging candidate strains in natural product pipelines.
Screening & Assay Development
- Establishes validated visual and microscopic criteria for mutant selection in screening campaigns.
- Standardizes phenotypic endpoints for reproducibility across research teams and timepoints.
- Enables quantitative assessment of colony morphology, sporulation, and pigmentation for downstream assays.
- Prepares characterized strains for integration into high-throughput or secondary screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns phenotypic data with biosynthetic pathway analysis for translational continuity.
- Supports risk-adjusted advancement of strains with desirable developmental profiles.
- Provides mechanistic insight into gene function relevant to secondary metabolite production.
- Facilitates the identification of translational biomarkers linked to developmental phenotypes when supported by further analysis.
Pipeline & Workflow Integration
Phenotypic evaluation of Streptomyces mutants is positioned at the interface of early discovery and lead identification, providing critical data for hypothesis testing and pathway prioritization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven investigation of gene function and developmental pathways.
- Screening: Delivers standardized, reproducible phenotypic endpoints for mutant selection.
- Analytics: Enables quantitative comparison of morphological and microscopic features across strains.
- Translational Research: Lays the groundwork for linking developmental phenotypes to biosynthetic output.
- Enterprise Reuse: Provides a scalable, adaptable protocol for ongoing strain characterization and portfolio expansion.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in genotype-phenotype relationships and target validation.
- Operational Value: Promotes standardization, reproducibility, and scalability in strain characterization workflows.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in natural product pipelines.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of strains and biosynthetic pathways for further development.
Implementation Considerations
- Requires proficiency in sterile technique and basic microbiological methods.
- Needs access to phase contrast or DIC microscopy and fluorescence imaging infrastructure.
- Demands cross-team standardization of phenotypic scoring and documentation practices.
- Adaptable to a range of Streptomyces species and related actinomycetes with minor protocol adjustments.
- Dependent on consistent environmental and incubation conditions to ensure reproducibility.
