Visuele en microscopische evaluatie van Streptomyces Developmental mutanten

Het algemene doel van de volgende technieken is om beginnende onderzoekers te trainen om te werken met Streptomyces en andere verwante soorten in het onderwijslaboratorium van de universiteit en op de middelbare school. Fenotypische observatie is belangrijk voor de vele onderzoekers die het gebied van Streptomyces-onderzoek betreden. Deze video beschrijft methoden voor bacteriële propagatie, opslag en visuele en microscopische onderzoeking.

De hier beschreven fenotyperingmethoden gebruiken Streptomyces coelicolor als model. De methoden zijn echter toepasbaar op alle leden van het grote geslacht en nauw verwante Actinomyces. Het grote voordeel van deze technieken is dat ze zijn ontworpen om toegankelijk te zijn voor beginnende onderzoekers in een middelbare schoolklas of onderzoekslaboratorium voor bachelorstudenten, evenals ervaren laboratoriumpersoneel.

Na het bekijken van deze video en het lezen van het bijbehorende protocol, zouden nieuwe onderzoekers in staat moeten zijn om hun Streptomyces-stammen te manipuleren, ze goed op te slaan en te beginnen met visuele karakteriseringsexperimenten. De procedures worden gedemonstreerd door Garret Kandell en Sean Kirk, onderzoeksstudenten aan de universiteit uit mijn laboratorium aan de Otterbein University. Om te beginnen, gebruikt u een standaardmethode, zoals de kwadrantstreepstrookmethode die in Saunders 2012 wordt gedemonstreerd, om Streptomyces-stammen op MS-agarplaten te strijken en in enkele kolonies te kweken.

Elke vier tot zes dagen, neem een enkele kolonie en strijk deze opnieuw op een nieuwe plaat. Naarmate de kolonies ouder worden, worden ze vatbaar voor willekeurige mutaties. Na het uitvoeren van mutagenese volgens het tekstprotocol, let op de koloniemorfologie voor elke mutant in vergelijking met de wilde type ouderstam.

Wanneer u nieuwe Streptomyces-soorten karakteriseert, vergelijkt u de nieuwe isolaat met die van een goed bestudeerde soort en let u op de basisvorm, het oppervlak van de kolonie, de ondoorzichtigheid, de elevatie en de pigmentatie. Label een MS-agarplaat en strijk wilde type en mutante stammen in wigpatronen. Zorg ervoor dat geen enkele stam een andere aanraakt om kruisbesmetting te voorkomen.

Noteer de datum en tijd dat de stammen op de plaat worden gestreken. Bewaar vervolgens de platen bij 30 graden Celsius. Onthoud dat het uiterst belangrijk is om uw Streptomyces-monster altijd te beschermen tegen besmetting.

Gebruik uw beste steriele techniek voor alle stappen bij het openen van platen en buisjes voor de minste hoeveelheid tijd mogelijk. Plaats geteelde petrischalen op gekleurd of wit papier om de achtergrond te homogeniseren. Schrijf op het papier de stamnaam, datum, incubatietemperatuur en tijd vanaf het eerste strijken van de plaat.

Maak digitale foto's van de plaat met de staminformatie geschreven op de papierachtergrond, zodat verwarring minimaal is. Steriliseer pincetten door ze in 70% ethanol te wassen en ze vervolgens door een Bunsenbrandervlammetje te halen om de ethanol te laten verdampen. Steriliseer dekglasjes door ze in 70% ethanol te wassen en ze vervolgens te laten drogen in een steriele petrischaal.

Vervolgens, om een ​​dekglaslift van bacteriële groei voor te bereiden, gebruikt u steriele pincetten om een ​​steriele dekglas op te nemen en plaatst u het dekglas op een MS-agarplaat waar de bacteriële groei dicht is. Gebruik pincetten om zachtjes op de achterkant van het dekglas te drukken om voldoende overdracht van bacteriële sporen en luchtmycelium te garanderen. Neem het dekglas van de plaat en plaats het onder een hoek van 45 graden met het cellenmateriaal naar het oppervlak van een microscoopglas met een druppel van 15 microliter 50% glycerol.

Laat het dekglas op het glycerol vallen, wat luchtbellen zal verminderen. Om fasecontrastmicroscopie uit te voeren op verschillende tijdsintervallen, plaatst u de voorbereide glijbaan op het microscoopplatform en voegt u een druppel immersieolie toe aan het midden van het dekglas. Draai het 100x faseobjectief op zijn plaats en stel de condensatortoren in op de juiste bijbehorende fase-instelling.

Zodra het objectieflens in contact komt met de olie, gebruikt u alleen de fijne afstelknop om het beeld te focussen. Bekijk verschillende gezichtsvelden om merkbare en consistente verschillen tussen mutante stammen en de wilde type te onderscheiden. Bijvoorbeeld het vermogen om sporen te vormen, sporengrootte en -vorm en het totale aantal sporen.

Gebruik steriele pincetten om een ​​dekglaslift van een MS-agarplaat te bereiden zoals eerder waar bacteriële groei duidelijk is, lichtjes de achterkant van het dekglas aanraken met de pincetten om voldoende overdracht van bacteriële sporen en luchtfilamenten te garanderen. Neem het dekglas van de plaat en plaats het op hard karton zodat de zijde met celmateriaal omhoog gericht is voor gemak en manipulatie van het dekglas. Overspoel het dekglas met ijskoud methanol en laat het vijf minuten staan.

Gebruik PBS om het dekglas twee keer te wassen door de oplossing voorzichtig te doseren en te verwijderen. Voeg 15 microliter van een oplossing van 10 microgram per milliliter propidiumjodide toe en/of 10 microgram per milliliter WGA-FITC aan een glijbaan. Plaats het dekglas met de zijde naar beneden op een druppel fluorescerende vlek.

Bewaar de monsters in een donkere of zwak verlichte kamer gedurende 15 minuten. Voorraden van de fluorescerende vlekken en vlekmonsters moeten worden beschermd tegen licht. Het wordt aanbevolen dat onderzoekers gebruik maken van omstandigheden met weinig licht tijdens het voorbereiden van monsters en een donkere doos gebruiken om monsters te bewaren zodra ze zijn voorbereid.

Bekijk de glijbanen onder een objectieflens van 100x met behulp van een fasecontrast- of DIC-microscoop uitgerust met epifluorescentie-exciterende kubussen voor propidiumjodide en FITC. Analyseer de beelden volgens het tekstprotocol. Hier getoond zijn voorbeelden van Streptomyces-mutanten die het resultaat zijn van transposonmutagenese.

Een lichtere kleur luchtmycelium kan wij