Een semi-High-throughput imaging methode en data visualisatie Toolkit om C. elegans embryonale ontwikkeling te analyseren

C.elegans embryogenese duurt ongeveer 13 uur, en wordt meestal gecontroleerd door het filmen van een embryo tegelijk. Ons protocol maakt echter de gelijktijdige 3D time lapse imaging van 80 tot 100 embryo's mogelijk. De mogelijkheid om gegevens te verzamelen voor grote aantallen ontwikkelende C.elegans embryo's opent een nieuwe reeks experimenten, waaronder kwantitatieve analyse van ontwikkelingsgebeurtenissen en grootschalige schermen.

Dit protocol kan eenvoudig worden aangepast om verschillende ontwikkelingsprocessen vast te leggen of om embryo's die elke combinatie van markers in interessant weefsel uitdrukken, in beeld te brengen. Het is een uitdaging om de embryo's goed te verspreiden in de putten. Ze moeten dicht bij elkaar zijn om het vangen van meerdere embryo's per veld mogelijk te maken zonder samen te klonteren in verschillende Z-vlakken.

We raden aan om twee onderzoekers te gebruiken voor naast elkaar dissectie, op ijs, en het blokkeren van ongebruikte putten. We zullen ook een aantal handige trucs demonstreren voor het snel opzetten van een goed geënsceneerde 384-put plaat. Begin met het afdichten van een 384-put plaat met glazen bodem met PCR-kleeffolie om ongebruikte putten te maskeren.

Gebruik een scheermes of scalpel om de folie weg te snijden om een deel van de putten voor gebruik bloot te leggen. Voeg 70 microliter vers bereide TMHC in elke put en houd de plaat op ijs. Sluit de buitenste twee rijen van de plaat uit om randeffecten te voorkomen.

Voor snelle monstervoorbereiding wordt side-by-side dissectie door twee onderzoekers aanbevolen. Wanneer alle van de oplossing is verguld, gebruik maken van fijne pincet en een dissectie microscoop om ongeveer 10 aangetrokken volwassenen over te dragen in 150 microliters van ijskoude TMHC oplossing binnen een depressie dia per aandoening. Met behulp van de pincet en een scalpel ontleed je de wormen om de embryo's los te laten en een getrokken capillaire pipet in een mondspirator te laden.

Gebruik de mondpipet om alle twee tot acht-cel fase embryo's over te brengen in individuele putten van de voorbereide plaat en de plaat te onderzoeken om te bevestigen dat er geen aggregaten aanwezig zijn in de putten. Wanneer alle embryo's zijn verzameld, regelen de monsters door centrifugatie en gebruik een ethanol gedrenkt doek om eventuele residu te verwijderen uit de bodem van de plaat. Plaats de plaat in de plaathouder van een confocale microscoop uitgerust met een temperatuurgestuurde omgeving en gebruik de 10X doelstelling om een pre-scan van elke put uit te voeren om velden met geschikte embryo's te identificeren.

Schakel aan het einde van de scan over naar de 60X-doelstelling, pas het brandpuntsvlak op elk punt aan op één tot vier velden per put en verwerf 18 Z-secties met twee micrometerintervallen per 20 minuten gedurende 10 uur. Wanneer alle beelden zijn verworven, voert u een lage, hele goed brightfield-scan uit, ongeveer 20 tot 24 uur na het begin van de nachtbeeldvorming om de embryonale letaliteit te beoordelen. Voor geautomatiseerd bijsnijden met embryoCropUI uitvoerbaar, download eerst het programma van Zenodo en de testfiles.

zip om te bepalen of het programma goed functioneert op het platform. Eenmaal gedownload, unzip en navigeren om de embryoCropUI uitvoerbare bestand te vinden en dubbelklik om het programma te starten. Selecteer open om het eerste specifieke gezichtsveld 4D te laden om bij te snijden.

Wanneer u een TIFF-serie met meerdere dimensies bijsnijdt, wordt alleen de eerste afbeelding in de reeks in de map geladen. Wanneer alle afbeeldingen zijn geladen, geeft u de beeldvormingsparameters op, selecteert u achtergrondaftrekkende en dempingscorrectie en stelt u de volgorde van de afbeeldingsverzameling en de micron per pixel in. Selecteer vervolgens uitvoeren, wordt een nieuwe submap met het label bijsnijden gemaakt in hetzelfde pad als de niet-bijgesneden map en worden de bijgesneden versies op deze locatie opgeslagen.

Voor visualisatie u de open en gecombineerde MSV2 ImageJ-plug-in en grafische gebruikersinterface-instructies Zenodorepov2 downloaden. docx van Zenodo en open de plugin in IMageJ. Zoek lijnen drie en vier en voer de locatie in waar de afbeeldingsmappen na het bijsnijden worden opgeslagen.

De namen van de afbeeldingsmap van de te verwerken voorwaarden en de unieke alfanumerieke id voor elk experiment 's nachts. Wanneer alle gegevens zijn ingevoerd, klikt u op Uitvoeren. Er verschijnt een venster waarmee een prompt wordt gestart om naar de buitenste map te navigeren met de bijgesneden afbeeldingsmappen.

Eenmaal geselecteerd verschijnt er een ander venster dat de beeldparameters kan specificatie mogelijk maken. Klik goed. Het samengestelde bestand zal beginnen te monteren.

Wanneer de compositie is gegenereerd, controleert u de bestanden die zijn geopend. Wanneer afgebeeld in combinatie aangepaste reporter stammen bieden informatieve uitlezingen voor de meeste grote ontwikkelingsgebeurtenissen. Inclusief sulfaatspecificatie, dorsale intercalatie, epidermale behuizing, rek en neurogenese.

24 uur na injectie is een optimaal tijdspunt voor beeldvorming. Vanaf dit moment zijn de uitputting van het moedereiwit en de remming van zygotische genexpressie beide effectief die verschillende, zeer reproduceerbare handtekeningfenotypen opleveren over een breed spectrum van genen die betrokken zijn bij sulfaatspecificatie en morfogenese. Het is belangrijk om geduldig te zijn tijdens de dissectie en embryo selectie stappen.

Het minimaliseren van de klonterende en het selecteren van de juiste brandpuntsvlakken zijn ook essentieel voor het waarborgen van gegevens van hoge kwaliteit. Ons protocol kan worden uitgevoerd met een verscheidenheid aan fluorescerende marker stammen en in combinatie met RNAi of mutanten. Onze verwerkingstools zorgen voor gestroomlijnde, geautomatiseerde of handmatige gegevensanalyse.

Met behulp van de stammen, methoden en tools beschreven hier onze groep voerde een RNAi-gebaseerde hoge inhoud scherm gericht op ongeveer 2.000 genen die nodig zijn voor embryonale ontwikkeling. Semi-hoge doorvoermethoden waren essentieel voor dit project.