Name: Integreren van Imaging Stroom Cytometry en profilering te evalueren veranderde endocytotische CD1d handel Transcriptomic (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Leer imaging flow cytometry en transcriptoomprofilering om endocytotische functiestoornissen in vervuilingsblootgestelde humane dendritische cellen te evalueren. Deze methode koppelt genexpressie aan eiwitfunctie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs bedanken Robert Giulitto (Hoxworth bloed midden) voor menselijke bloedmonsters en Dr. Liang Niu voor de normalisatie van de genexpressie leest. Wij danken ook financiële steun van de National Institute of Environmental Health Sciences (ES006096), centrum voor milieu genetica (CEG) proefproject (S.H.), National Institute of Allergy and Infectious Diseases (AI115358) (S.H.), Universiteit van Cincinnati University Research Council award (sh) en de Universiteit van Cincinnati College van geneeskunde Enhancement basisfinanciering (X. Z.).

Menselijke protocollen in deze studie werden goedgekeurd door de institutionele Review Board van de University of Cincinnati en alle methoden werden uitgevoerd volgens de relevante richtlijnen en verordeningen. Bloedmonsters van gezonde donoren waren van de Hoxworth bloed Center aan de University of Cincinnati Medical Center.
1. Transcriptomic profilering van verontreinigende stoffen-blootgesteld menselijke monocyt-afgeleide DCs
<ol><li>Totaal RNA extractie van BaP-blootgesteld DCs<ol>
<li>Onderscheiden van menselijke DCs met behulp van cytokines GM-CSF en IL-4, en bloot DCs aan BaP voor 4 dagen13.</li>
		<li>Sorteren van BaP-blootgesteld DCs met behulp van stroom cytometry op basis van de oppervlakte uitgedrukt markers (-Lineage HLA-DR+), waarvan het merendeel uit conventionele DCs bestaat (CD11c+CD1c+)13. Typisch, het sorteren van 10.000 DCs in kweekmedium dat 10% FBS, DCs Centrifugeer bij 600 x g- en 4 ° C voor 6 min, en onmiddellijk de bovendrijvende vloeistof verwijderen door aspiratie met behulp van een 1 mL pipet tip.</li>
		<li>Zodra het supernatant wordt verwijderd door aspiratie, lyse de cel pellet door 0.4 mL Lysis/bindende Buffer van het RNA isolatie kit voor opslag in-80 ° C vóór de RNA extractie toe te voegen.</li>
		<li>Gebruik de RNA isolatie kit met de totale RNA extractie protocol uitpakken van de totale RNA-14. Het meten van de RNA-integriteit met behulp van een Bioanalyzer15.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transcriptomic analyse van gesorteerde DCs (figuur 1A)<ol>
<li>De bibliotheek voorbereiden RNA-seq met behulp van een RNA bibliotheek voorbereiding kit. Kortom, het fragment van de geïsoleerde poly-A-RNA (~ 200 bp), omgekeerde transcriberen de fragmenten naar het 1e onderdeel van cDNA, en volg door het tweede onderdeel cDNA synthese aangeduid met dUTP.</li>
		<li>Dubbele streng cDNA aan de adapter met een stam-lusstructuur na zuivering van de kraal, eind-repareren en dA-tailing afbinden. Accijnzen de uracil-residuen in het 2e onderdeel van de lus van het cDNA en adapter met gebruiker (Uracil-specifieke excisie reagens) enzym te handhaven van de specificiteit van de strand en open de lus van de adapter voor PCR.<ol>
<li>13 cycli van PCR met behulp van universele en index-specifieke primers te verrijken de geïndexeerde bibliotheek uit te voeren. Opruimen van de bibliotheek en draaien op een hoge gevoeligheid van Bioanalyzer DNA-chip te controleren van de kwaliteit van de bibliotheek en het formaat van de distributie.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Gebruik een bibliotheek kwantificering kit en een real-time PCR-systeem gecombineerd met informatie over de bibliotheek voor het berekenen van bibliotheek concentratie via een standaard curve-methode.</li>
		<li>Proportioneel bundelen individueel geïndexeerde compatibel bibliotheken en aanpassen van de definitieve totale concentratie tot en met 15 pM. Het uitvoeren van bibliotheek cluster generatie en het volgnummer van de bibliotheek bij een instelling van één lezen 1 x 50 bp voor het genereren van 25 miljoen ~ leest per monster.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sequencing<ol>
<li>De volgorde en indexeren reagentia aan de SBS en PE reagens rekken, respectievelijk laden. Plaats de reagentia in een laboratorium-grade waterbad voor 1 h tot al het ijs is gesmolten en de reagentia in elke fles/buis goed zijn gemengd.</li>
		<li>Voorbereiden van de ICB-mix door de ontdooide enzym kleurstof en -20 ° C toe te voegen aan de fles en meng. Bereid een NaOH oplossing volgens de instructies van de sequencing. Plaats alle reagentia bij 4 ° C tot klaar voor gebruik.</li>
		<li>Tijdens de 1 h wachten periode, macht op de sequencer. Wacht voor het station van de DONOTEJECT weergegeven en de computer verbinding te maken met een netwerkstation.</li>
		<li>Start de sequencer controlesoftware.</li>
		<li>Bereiden van 2 L van onderhoud Wash oplossing 0,5% tween-20 en 0,03 bevat % ProClin 300 in laboratorium-grade water.</li>
		<li>In het SBS reagens rek, voeg toe ~ 100 mL onderhoud Wash oplossing aan elk van de 8 flessen en trechter schroefdeksels naar de flessen. In het PE reagens rek, Voeg ~ 12 mL onderhoud Wash oplossing aan elk van de tien 15 mL conische buisjes en negeren de caps.</li>
		<li>Laden van de twee rekken met de oplossing gevulde flessen/buizen naar de sequencer.</li>
		<li>De software van de controle van de sequencer, kies het onderhoud wassen; Volg de instructies op het scherm om het vloeibare systeem van sequencer schoon totdat het proces is voltooid.</li>
		<li>Nieuwe sessie starten in het "SEQUENCE" tabblad van de software; direct de uitvoergegevens naar een netwerkstation. Kies parameters voor één lezen 1 x 50 bp met enkele index multiplexed bibliotheken.</li>
		<li>Optioneel, log in op de BaseSpace volgorde Hub zodat de sequencing-status op afstand kan worden gecontroleerd via een computer of smartphone.</li>
		<li>Upload een monster blad voor demultiplexing en informeren van het reagens volgens de vereiste software.</li>
		<li>Laden van SBS en PE reagentia aan de sequencer. Prime het systeem met een gebruikte stroom cel (~ 15 min).</li>
		<li>Zodra de cluster-generatie is voltooid (~4.5 h), nemen de cel stroom, licht de stroom cel te spuiten met water en veeg het droog met behulp van lens papier. Licht de stroom cel spray met 95% ethanol en veeg het droog. Controleren tegen een licht om ervoor te zorgen dat het oppervlak schoon zonder vuil of zout residu is.</li>
		<li>Nadat de eerste stap is voltooid, de cel geclusterde stroom laden en start de sequencing. De sequentie analyse Viewer software zal automatisch worden gestart.</li>
		<li>Waken over de kwaliteit van de gegevens rangschikken via SAV met inbegrip van cluster dichtheid, leest pasfilter, cluster pass filter %, % ≥Q30, Legacy fase/profase %, QC, etc. die dit helpt om te begrijpen van de kwaliteit van de gegevens en het oplossen van problemen met indexeren.</li>
		<li>Wijzig de stroom cel pakking en uitvoeren van een onderhoud wassen nadat de sequencing is voltooid. De sequencer is klaar voor de volgende run.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bioinformatic analyse<ol>
<li>Bioinformatics RNA-seq data analyse13uit te voeren.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. pathway analyse van Transcriptomic profielen (figuur 1B)
<ol><li>Gebruik een edgeR Bioconductor te vergelijken van de graven van de intensiteit van resulterende gen expressie tussen BaP-blootgesteld en niet-blootgesteld DCs van drie donoren. Vervolgens identificeren differentially uitgedrukte genen tussen BaP-blootgesteld en niet-blootgesteld DCs gebaseerd op de absolute vouw verandering (> 2 plooien) en de valse ontdekking stem (FDR) - gecorrigeerde p- waarden (< 0,05).</li>
	<li>Te voorspellen de functionele clusters van differentially uitgedrukte genen, gebruik van het softwarepakket ToppCluster de veranderde genen tegen verschillende gegevensbanken, met inbegrip van KEGGEN en REACTOME zoeken en genereren van clustering gegevens. De hypergeometrische test van de ToppCluster wordt gebruikt om functionele verrijking via de gene lijst verrijking analyse16.</li>
	<li>Verdere inbreng de resultaten uit deze functie clusters Cytoscape17,18 versie 3.3.0, een over het algemeen gebruikte open source softwareplatform voor het visualiseren van complexe netwerken. Dus, de genen die betrokken zijn bij de verschillende clusters of paden, met inbegrip van endocytotische clusters en lipide metabolisme, worden weergegeven in een netwerk met aantekening van de kleur van de verandering van de gemiddelde vouw van gen expressie (figuur 1B)13.</li>
</ol>3. beeldvorming Stroom Cytometry van CD1d en Lamp1 Colocalization
<ol><li>Antilichaam labeling van BaP-blootgesteld DCs<ol>
<li>Bloot 0,5 x 106 menselijke DCs tot 5.94 mM BaP voor 4 dagen bij 37 ° C in 2 mL zuiver volledige Dulbecco van bewerkt Eagle's Medium. DCs oogsten door centrifugeren bij 400 x g gedurende 10 min. blok, wordt het gedifferentieerde DCs door cellen met blocker van menselijk serum en anti-menselijke Fc receptor antistoffen voor 10 min in ijs, met inbegrip van anti-menselijke CD16, CD32 en CD64 antilichamen aan het broeden.</li>
		<li>Incubeer briljante Violet 421-anti-CD1c (L161), phycoerythrin/cyanine kleurstof 7 (PE/Cy7) - anti - HLA-DR, en PE/Cy5-anti-CD11c met DCs gedurende 20 min. in ijs. Tabel 1 geeft deze lijst van antilichamen.</li>
		<li>Herstellen van DCs met 4% paraformaldehyde in PBS en permeabilize hen met Permeabilization was Buffer. Uitvoeren van de intracellulaire kleuring met een mengsel van PE-geëtiketteerden gezuiverde anti-menselijke CD1d (51.1) en de Alexa Fluor 647-geëtiketteerden anti-Lamp1 (CD107a) (H4A3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Imaging stroom cytometry meting (Figuur 2)<ol>
<li>Analyseer de gebeitst monsters met behulp van een beeldvormende stroom cytometer de stroom cytometry kern van Cincinnati Kinderziekenhuis met behulp van een 40 X doelstelling opleveren van 300 pixels voor een cel met ongeveer 10 mm diameter. Één pixel grootte is ongeveer 0,5 mm door 0,5 mm van het object.</li>
		<li>Verwerven van 10.000 cellulaire beelden op onpartijdige wijze volgens de instructie van de fabrikant.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. imaging Analyses van Stroom Cytometry beelden
<ol><li>Colocalization analyse met behulp van ideeën software (Figuur 2)<ol>
<li>Uitvoeren van schadevergoeding met één gebeitste ten opzichte van niet-gekleurd monsters door het instellen van de intensiteit van de fluorescentie van niet-gekleurd monsters onder de drempel, met inbegrip van niet-gekleurd BaP-blootgesteld DCs met BaP autofluorescence, net als in de routine stroom cytometry gegevens analyse.</li>
		<li>Gate gekleurd cellen te verkrijgen van de deelverzamelingen van HLA-DR+CD11c+CD1d+Lamp1+ cellen (figuur 2A) en Toon cellulaire afbeeldingen in de gated deelverzamelingen (figuur 2B).</li>
		<li>Cel afbeeldingen opslaan in een png-indeling op basis van twee technische inclusie criteria, de visuele aanwezigheid van sterke mede gebeitst signalen en subcellular localisatie van CD1d en Lamp1 eiwitten, voor de analyses van de colocalization met behulp van ImageJ-Fiji (figuur 2B).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Software ImageJ-Fiji gebruiken voor het uitvoeren van de analyse van de colocalization (Figuur 3).<ol>
<li>Bereid de bestanden voor de invoerafbeelding door de samenvoeging van de 100 beelden opgeslagen cel voor niet-blootgesteld en BaP-blootgesteld menselijke DCs, respectievelijk (figuur 3A).</li>
		<li>Analyseren van de CD1d (rood) en Lamp1 (groen) colocalization met behulp van een scatterplot.<ol>
<li>ImageJ-Fiji programma uitvoeren. Open het PNG-bestand met 100 beelden van de cel (figuur 3B en figuur 4A): "bestand | Open".</li>
			<li>De afbeelding met samengevoegde rode en groene kanalen splitsen in twee beelden met een rode of een groene kanaal: "afbeelding | Kleur | Kanalen splitsen".</li>
			<li>Tekenen van een scatterplot met behulp van de opdrachten "Analyze | Colocalization | Colocalization drempel". Sla de scatterplot met behulp van de "PrintScreen" -toets.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Berekenen van Mander colocalization coëfficiënten voor elke één cellulaire afbeelding (n = 100) (figuur 4B)<ol>
<li>Selecteer een afbeelding van de eencellige op het afbeeldingsbestand met kanalen splitsen met behulp van de "ovale" gereedschap.</li>
			<li>Gebruik de opdrachten "Analyze | Colocalization | Colocalization drempel". Selecteer "Kanaal 1" in het dialoogvenster regio van belang (ROI). Houd alle Berekeningsopties met inbegrip van "Mander van met behulp van drempels" voor elke cel afbeelding.</li>
			<li>Herhaal deze berekening voor alle 100 cel afbeeldingen.</li>
			<li>Opslaan en openen van de resultaten met behulp van een werkblad.</li>
			<li>Uitzetten van de gemiddelden en de standaardfouten voor "Thresholded Mander de coëfficiënten" (n = 100, 0 betekent geen colocalization en 1 betekent perfect colocalization). Van de Student t-test gebruiken voor het berekenen van de p -waarde voor de vergelijking tussen de groepen van het BaP-blootgesteld en niet-blootgesteld (figuur 4B).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Bereken het percentage van thresholded pixel intensiteit mede gelokaliseerd tussen CD1d en Lamp1 voor meerdere afbeeldingen van de cel (n = 100) (figuur 4C).<ol>
<li>Gebruik hetzelfde protocol analyse in 4.2.3 en bovendien selecteren de optie resultaat "% intensiteit boven drempel colocalized".</li>
			<li>Deze analyses samen met Mander van colocalization coëfficiënten uit te voeren.</li>
			<li>Ook de gemiddelde en standaardfouten voor % intensiteit colocalized tussen CD1d en Lamp1 worden uitgezet. Van de Student t-test gebruiken voor het berekenen van de p -waarde voor vergelijking tussen groepen van het BaP-blootgesteld en niet-blootgesteld (figuur 4C).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Roche, P. A., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+Processing+and+Presentation+Mechanisms+in+Myeloid+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+Spectrum%22%5BJournal%5D)">Antigen Processing and Presentation Mechanisms in Myeloid Cells.</a> Microbiology Spectrum. 4 (3), (2016).</li>
<li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MR1+uses+an+endocytic+pathway+to+activate+mucosal-associated+invariant+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">MR1 uses an endocytic pathway to activate mucosal-associated invariant T cells.</a> The Journal of experimental medicine. 205 (5), 1201-1211 (2008).</li>
<li>Nakamura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosomes+are+specialized+platforms+for+bacterial+sensing+and+NOD2+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Endosomes are specialized platforms for bacterial sensing and NOD2 signalling.</a> Nature. 509 (7499), 240-244 (2014).</li>
<li>Blum, J. S., Wearsch, P. A., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathways+of+antigen+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Pathways of antigen processing.</a> Annual review of immunology. 31, 443-473 (2013).</li>
<li>Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invariant+natural+killer+T+cells%3A+an+innate+activation+scheme+linked+to+diverse+effector+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions.</a> Nature reviews. Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).</li>
<li>Zajonc, D. M., Kronenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD1+mediated+T+cell+recognition+of+glycolipids%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+structural+biology%22%5BJournal%5D)">CD1 mediated T cell recognition of glycolipids.</a> Current opinion in structural biology. 17 (5), 521-529 (2007).</li>
<li>Cox, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+cellular+lipids+bound+to+human+CD1d+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Determination of cellular lipids bound to human CD1d molecules.</a> PloS one. 4 (5), e5325(2009).</li>
<li>Yuan, W., Kang, S. J., Evans, J. E., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+lipid+ligands+associated+with+human+CD1d+targeted+to+different+subcellular+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Natural lipid ligands associated with human CD1d targeted to different subcellular compartments.</a> Journal of immunology. 182 (8), 4784-4791 (2009).</li>
<li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+deoxyceramides+and+diacylglycerols+as+CD1b+scaffold+lipids+among+diverse+groove-blocking+lipids+of+the+human+CD1+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Discovery of deoxyceramides and diacylglycerols as CD1b scaffold lipids among diverse groove-blocking lipids of the human CD1 system.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (48), 19335-19340 (2011).</li>
<li>de Jong, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD1a-autoreactive+T+cells+recognize+natural+skin+oils+that+function+as+headless+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">CD1a-autoreactive T cells recognize natural skin oils that function as headless antigens.</a> Nature. 15 (2), 177-185 (2014).</li>
<li>Trombetta, E. S., Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology+of+antigen+processing+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Cell biology of antigen processing in vitro and in vivo.</a> Annual review of immunology. 23, 975-1028 (2005).</li>
<li>Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardizing+immunophenotyping+for+the+Human+Immunology+Project%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project.</a> Nature reviews. Immunology. 12 (3), 191-200 (2012).</li>
<li>Sharma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+endocytic+lipid+antigen+presentation+by+common+lipophilic+environmental+pollutants%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Inhibition of endocytic lipid antigen presentation by common lipophilic environmental pollutants.</a> Science Reports. 7 (1), 2085(2017).</li>
<li>Boom, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+simple+method+for+purification+of+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+clinical+microbiology%22%5BJournal%5D)">Rapid and simple method for purification of nucleic acids.</a> Journal of clinical microbiology. 28 (3), 495-503 (1990).</li>
<li>Nachamkin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agilent+2100+bioanalyzer+for+restriction+fragment+length+polymorphism+analysis+of+the+Campylobacter+jejuni+flagellin+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+clinical+microbiology%22%5BJournal%5D)">Agilent 2100 bioanalyzer for restriction fragment length polymorphism analysis of the Campylobacter jejuni flagellin gene.</a> Journal of clinical microbiology. 39 (2), 754-757 (2001).</li>
<li>Kaimal, V., Bardes, E. E., Tabar, S. C., Jegga, A. G., Aronow, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ToppCluster%3A+a+multiple+gene+list+feature+analyzer+for+comparative+enrichment+clustering+and+network-based+dissection+of+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">ToppCluster: a multiple gene list feature analyzer for comparative enrichment clustering and network-based dissection of biological systems.</a> Nucleic acids research. 38 (Web Server issue), W96-W102 (2010).</li>
<li>Bauer-Mehren, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+genomic+information+with+biological+networks+using+Cytoscape%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Integration of genomic information with biological networks using Cytoscape).</a> Methods in molecular biology. 1021, 37-61 (2013).</li>
<li>Cline, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+biological+networks+and+gene+expression+data+using+Cytoscape%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Integration of biological networks and gene expression data using Cytoscape.</a> Nature protocols. 2 (10), 2366-2382 (2007).</li>
<li>Huang, S., Moody, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor-unrestricted+T+cells+in+the+human+CD1+system%5BTitle%5D)+AND+%22Immunogenetics%22%5BJournal%5D)">Donor-unrestricted T cells in the human CD1 system.</a> Immunogenetics. 68 (8), 577-596 (2016).</li>
<li>Huang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Innate-Like+T+Cells+in+Tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Targeting Innate-Like T Cells in Tuberculosis.</a> Frontiers in immunology. 7, 594(2016).</li>
<li>Moody, D. B., Porcelli, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+pathways+of+CD1+antigen+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Intracellular pathways of CD1 antigen presentation.</a> Nature reviews. Immunology. 3 (1), 11-22 (2003).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Diard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stabilization+of+cooperative+virulence+by+the+expression+of+an+avirulent+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stabilization of cooperative virulence by the expression of an avirulent phenotype.</a> Nature. 494 (7437), 353-356 (2013).</li>
<li>Bader, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+proliferative+and+mature+beta-cells+in+the+islets+of+Langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of proliferative and mature beta-cells in the islets of Langerhans.</a> Nature. 535 (7612), 430-434 (2016).</li>
<li>Eliceiri, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+imaging+software+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Biological imaging software tools.</a> Nature. 9 (7), 697-710 (2012).</li>
<li>Costes, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+and+quantitative+measurement+of+protein-protein+colocalization+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Automatic and quantitative measurement of protein-protein colocalization in live cells.</a> Biophysical journal. 86 (6), 3993-4003 (2004).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen

Functionele bevestiging van een veranderd gen-traject is uitdagend, vanwege sterk beïnvloed genexpressie waarbij meerdere trajecten en de moeilijkheid om individuele en populational cellulaire activiteiten te integreren. Wij werkzaam imaging stroom cytometry specifiek test CD1d mensenhandel endocytotische compartimenten. Stroom cytometry Imaging integreert de populational meting van cellen en de afzonderlijke demonstratie van subcellular colocalization van meerdere eiwitten. Confocale microscopie heeft eerder verstrekte ...

Antigeen presentatie omvat normaliter intracellulaire eiwitten mensenhandel, die is vaak onderzocht met behulp van morfologische karakterisering en fenotypische profilering van antigeen presentatie van cellen1,2,3 . Om de voordelen van beeldvorming en fenotypering methoden te integreren, beschrijven we een imaging platform van de analyse op zowel eencellige als populatie aan te tonen een veranderd eiwit colocalization in menselijke dendritische cellen (DC's). In peptide-antigeen presentatie, grote histocompatibility complex (MHC) klasse I moleculen binden een korte peptide (8-10 residuen) in het endoplasmatisch reticulum te activeren van conventionele CD8+ T cellen, terwijl de MHC klasse II moleculen binden een relatief langere peptide (~ 20 residuen) in endocytotische compartimenten te activeren van conventionele CD4+ T cellen1,4. In tegenstelling, worden lipide-specifieke T-cellen geactiveerd door CD1 eiwitten met lipide antigenen geladen voornamelijk in endocytotische compartimenten5,6. Lipide antigeen presentatie bepaalt de levering van lipide metabolieten geproduceerd in8,9,10 , lipide metabolisme7,en het laden van functionele lipide metabolieten voor CD1 eiwitten in endocytotische compartimenten5,6. In dit verband zijn verschillende cellulaire factoren moduleren van lipide antigeen presentatie, met name in de milieublootstelling van lipofiele verontreinigende stoffen en immuun aandoeningen, cruciaal voor worden gedefinieerd. In deze studie, we gewend transcriptomic analyse, afbeelding profilering en cellulaire en populational imaging analyse van menselijke monocyt-afgeleide DCs bepalen de endocytotische eiwit mensenhandel bij te dragen aan lipide antigeen presentatie blootstelling van de verontreinigende stof. Zeker, dit gecombineerde platform kan worden toegepast op het bestuderen van eiwit subcellular mensenhandel en colocalization in verschillende biologische processen.
Eiwit subcellular localisatie bleek technisch, meestal met behulp van de confocal microscopie en statistisch geanalyseerd in een beperkt aantal gedetecteerde cellen1,,2,,3,11. Bovendien is cytometry van de stroom in grote lijnen toegepast op poort cel populaties met mede gebeitst signalen van meerdere eiwitten op een cellulair niveau12; echter, dit ontbreekt een gedetailleerde visualisatie van eiwit subcellular colocalization. Om uitgebreide en statistische analyses van percentage eiwit colocalization niveau van zowel de cellulaire en de bevolking, nemen we imaging profilering en analyse benaderingen om te bepalen van de kenmerken van eiwitten colocalization met biologische relevantie. Specifiek, we imaging stroom cytometry gebruiken voor het detecteren van de colocalization van CD1d en lysosomale-geassocieerde membraan eiwit 1 (Lamp1) eiwitten in deze studie. Kwantitatieve analyse van colocalized moleculen was eerder moeilijk op een populational schaal moet worden uitgevoerd. In deze studie aangepast we de ImageJ-Fiji-programma te onderzoeken het percentage eiwit colocalization met een groot aantal CO gekleurde cellen zowel populational als individuele cellulair niveau. Specifiek, we gemeten CO gelokaliseerde gebieden, intensiteit en populational grootte om de conclusie dat de CD1d proteïne was grotendeels bewaard in late endocytotische compartimenten van menselijke DCs blootstelling aan een lipofiele verontreinigende stof benzo [a] pyreen (BaP)13 te steunen . Deze gecombineerde cellulaire en bevolking imaging analyse zeer reproduceerbaar, uitgebreide en statistisch significante resultaten van CD1d-Lamp1 colocalization relevant zijn voor geremde lipide antigeen presentatie opgeleverd.
Transcriptome van BaP-blootgesteld menselijke DCs voorstander groot van de hypothese dat endocytotische lipide metabolisme en CD1d endocytotische handel in BaP blootstelling werden aangetast. Om te testen deze hypothese, pasten we imaging stroom cytometry om het profiel van de beelden van DC bevolking die samen met meerdere eiwitten met inbegrip van CD1d en endocytotische markeringen DC markeringen werden gekleurd. Ten slotte, mede gekleurde cellen zijn statistisch geanalyseerd om aan te tonen van het percentage van de intensiteit en gebieden van CD1d en Lamp1 colocalization.

<table><tbody><tr><td>Transcriptomics</td><td>Illumina</td><td>HiSeq 2500 v4</td><td>Illumina HiSeq-systeem</td></tr><tr><td>ImagingStream X</td><td>Millipore</td><td>100220</td><td>Imaging flow cytometry</td></tr><tr><td>mirVana miRNA Isolation Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>Totale RNA-extractie</td></tr><tr><td>Agilent RNA 6000 Pico Kit</td><td>Agilent</td><td></td><td>Totale RNA QC-analyse</td></tr><tr><td>Veriti 96-Well Fast Thermal Cycler</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>PCR, enzymreactie</td></tr><tr><td>NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module</td><td>New England Biolab</td><td></td><td>PolyA RNA-zuivering</td></tr><tr><td>Automated SMARTer Apollo system</td><td>Takara</td><td></td><td>PolyA RNA-zuivering</td></tr><tr><td>NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit voor Illumina</td><td>New England Biolab</td><td></td><td>Bibliotheekvoorbereiding</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP magnetische korrels</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>DNA-zuivering</td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent</td><td></td><td>Bibliotheek QC, grootteverdelingsanalyse</td></tr><tr><td>Agilent High Sensitivity DNA Kit</td><td>Agilent</td><td></td><td>Bibliotheek QC, grootteverdelingsanalyse</td></tr><tr><td>QuantStudio 5 Real-Time PCR System (Thermo Fisher)</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>Bibliotheekkwantificering</td></tr><tr><td>NEBNext Library Quant Kit</td><td>New England Biolab</td><td></td><td>Bibliotheekkwantificering</td></tr><tr><td>cBot</td><td>Illumina</td><td></td><td>Bibliotheek clustergeneratie</td></tr><tr><td>TruSeq SR Cluster Kit v3 - cBot &ndash; HS</td><td>Illumina</td><td></td><td>Bibliotheek clustergeneratie</td></tr><tr><td>HiSeq 1000</td><td>Illumina</td><td></td><td>Sequencing</td></tr><tr><td>TruSeq SBS Kit v3 - HS (50-cycli)</td><td>Illumina</td><td></td><td>Sequencing</td></tr><tr><td>Phycoerythrine/Cyanine 7 (PE/Cy7)</td><td>Bio Legend</td><td>L243</td><td></td></tr><tr><td>Phycoerythrine/Cyanine 5 (PE/Cy5)</td><td>Bio Legend</td><td>3.9</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant violet 421</td><td>Bio Legend</td><td>L161</td><td></td></tr><tr><td>PE-anti-muis IgG2b</td><td>Bio Legend</td><td>51.1</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 (AF647)</td><td>Bio Legend</td><td>CD107a(H4A3)</td><td></td></tr></tbody></table>

integreren van imaging stroom cytometry en profilering te evalueren veranderde endocytotische cd1d handel transcriptomic

Integrate Imaging Flow Cytometry and Transcriptomic Profiling to Evaluate Altered Endocytic CD1d Trafficking

Populational analyses van de morfologische en functionele wijziging van endocytotische eiwitten zijn uitdagend vanwege de vraag van Fotolader op een eencellige niveau en statistische beeldanalyse op een populational niveau. Om deze moeilijkheid te overwinnen, we gewend imaging stroom cytometry en transcriptomic (RNA-seq) profilering bepalen veranderde subcellular localisatie van het cluster van differentiatie 1d eiwit (CD1d) die zijn gekoppeld met verminderde endocytotische genexpressie in mens dendritische cellen (DC's), die werden blootgesteld aan de lipofiele common air pollutant benzo [a] pyreen. De colocalization van CD1d en endocytotische marker Lamp1 eiwitten uit duizenden cel beelden met imaging stroom cytometry werd geanalyseerd met behulp van ideeën en ImageJ-Fiji programma's. Talrijke cellulaire beelden met mede gekleurd CD1d en Lamp1 eiwitten waren gevisualiseerd na gating op CD1d+Lamp1+ DCs met behulp van ideeën. De verbeterde CD1d en Lamp1 colocalization bij BaP blootstelling werd verder aangetoond met behulp van thresholded scatterplots, getest met Mander de coëfficiënten voor co gelokaliseerde intensiteit, en uitgezet op basis van het percentage van de medefinanciering gelokaliseerde gebieden met behulp van ImageJ-Fiji. Onze gegevens geven een voordelige instrumentaal en bioinformatic aanpak voor het meten van eiwit colocalization zowel één als populational cellulaire niveau, ter ondersteuning van een verminderde functionele uitkomst van transcriptomic wijziging in verontreinigende stoffen blootgesteld mens DCs.

De lipofiele verontreinigende stof BaP verandert endocytotische gene clusters in menselijke DCs. mens monocyt-afgeleide DCs van elke donor (n = 3) werden geïncubeerd met BaP en gesorteerd voor conventionele DCs, die verder voor RNA extractie en transcriptomic analyse gebruikt werden zoals beschreven . Bij de normalisatie van de genexpressie, werden veranderde genen tussen groepen BaP-blootgesteld en niet-blootgesteld geclusterd volgens de functionele correlatie van differentially uitgedru...

Stroom cytometry Imaging biedt een ideale aanpak voor het detecteren van de morfologische en functionele wijziging van cellen op individuele en populational niveau. Verstoorde endocytotische functie voor lipide antigeen presentatie in verontreinigende stoffen blootgesteld menselijke dendritische cellen werd aangetoond met een gecombineerde transcriptomic profilering van genexpressie en morfologische demonstratie van eiwit mensenhandel.

Integreren van Imaging Stroom Cytometry en profilering te evalueren veranderde endocytotische CD1d handel Transcriptomic

Populational analyses of the morphological and functional alteration of endocytic proteins are challenging due to the demand of image capture at a single ...

Deze methoden integreren de volgende generatie sequencing en flow cytometrie beeldvorming analyse. Het kan helpen bij het beantwoorden van interessante vragen, zoals de vraag of sommige fenotypische veranderingen zijn implicate, in plaats van de transcriptoom, vooral in de blootstelling van verontreinigende stoffen omgeving. Het belangrijkste voordeel van deze eenvoudige methode voor ons is dat we het kunnen gebruiken om de colocalisatie van biologisch belangrijke eiwitten te meten, om de resultaten van de belangrijkste differentiële genexpressie op functioneel niveau te interpreteren.De implicaties van deze techniek breiden zich uit tot de diagnose van pathologische en toxicologische uitkomsten. Als een normale imager benadering, forsee heeft de mogelijkheid om genexpressie te verbinden met eiwitfunctie. Over het algemeen, individuen nieuw op deze methode zal worstelen vanwege de hoge technische eisen van de beeldvorming en transcriptomische analyse.Om de menselijke monocyt afgeleide dendritische cel bibliotheek sequentie, eerst laden de volgorde en indexering reagentia op de sequencing biosynthese en indexering reagent racks, respectievelijk, en plaats de rekken in een laboratori

integrate-imaging-flow-cytometry-transcriptomic-profiling-to-evaluate

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Het IP-FCM methode is gepresenteerd, die een gevoelige, robuust, biochemische evaluatie van de natieve eiwit-eiwit interacties mogelijk maakt, zonder dat genetische manipulatie of grote steekproeven.

IP-FCM: Immunoprecipitatie gedetecteerd door middel van flowcytometrie

Flowcytometrische analyse van Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie biedt een hoge doorvoer kwantitatieve methode om eiwit-eiwit interacties te bestuderen. Deze methodologie kan worden toegepast op mapping eiwitbindingsplaatsen en screenen factoren die eiwit-eiwit interactie te bepalen.

Flowcytometrische analyse van Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie: Een High Throughput kwantitatieve methode om eiwit-eiwit interactie Studie

De mechanismen die de interstitiële beweeglijkheid van CD4-effector-T-cellen regelen op plaatsen van ontsteking zijn relatief onbekend. Wij presenteren een niet-invasieve benadering visualiseren en manipuleren in vitro geprimed CD4 T-cellen in het ontstoken oor dermis, waardoor studie van het dynamisch gedrag van deze cellen in situ.

Beeldvorming CD4 T Cell interstitiële Migratie in de ontstoken Dermis

Microgliale fagocytose is essentieel voor het behoud van weefselhomeostase en onvoldoende fagocytosefunctietesten is betrokken bij pathologie. Echter, het beoordelen van microglia functie in vivo is technisch uitdagend. We hebben een eenvoudige maar robuuste techniek ontwikkeld voor het nauwkeurig bewaken en kwantificeren van de fagocytische potentieel van microglia in een fysiologische omgeving.

Het beoordelen van het netvlies Microgliale fagocytosefunctietesten<em&gt; In Vivo</em&gt; Met behulp van een flowcytometrie-gebaseerde test

We beschrijven hier een isolatiemethode om humane endocervicale intra-epitheliale lymfocyten te verkrijgen voor de analyse van intra-epitheliale gamma delta T-cellen. Dit protocol kan worden uitgebreid voor de zuivering van endocervicale gamma delta T-cellen door middel van magnetische kralen of door celsortering.

Isolatie en Flow cytometrische analyse van Human Endocervicale Gamma Delta T-cellen

Hier beschrijven we een complete workflow voor de kwalitatieve en kwantitatieve analyse van immuun synapsen tussen primaire menselijke T-cellen en cellen antigeen-presenteren. De methode is gebaseerd op imaging stroom cytometry, waarmee de verwerving en evaluatie van verscheidene duizend cel beelden binnen een relatief korte periode van tijd.

Kwalitatieve en kwantitatieve analyse van de immuun SYNAPS in het menselijke systeem met behulp van Imaging Stroom Cytometry

Een stroom cytometry gebaseerde cellulaire bindende test wordt beschreven die voornamelijk als een instrument voor screening gebruikt wordt ter identificatie van stoffen die een remmende werking van de binding van een fluorescently geëtiketteerde CXC chemokine ligand 12 (CXCL12) aan de CXC chemokine receptor 4 (CXCR4).

Een stroom Cytometry gebaseerde Assay te identificeren van verbindingen die Binding van Fluorescently-geëtiketteerden CXC Chemokine Ligand 12 aan CXC Chemokine Receptor 4 verstoren

Isolatie van cellen uit ontlede implantaten en hun karakterisering door middel van flowcytometrie kan aanzienlijk bijdragen aan het begrijpen van het patroon van immuunrespons tegen implantaten. Dit artikel beschrijft een nauwkeurige methode voor de isolatie van cellen uit ontlede implantaten en hun kleuring voor flowcytometrische analyse.

Flowcytometrie met hoge dimensionaliteit voor analyse van de immuunfunctie van ontlede implantaatweefsels

Dit protocol beschrijft een op flowcytometrie gebaseerde, high-throughput screeningsmethode om geneesmiddelen met kleine moleculen te identificeren die de activering van β2-integrine op menselijke neutrofielen remmen.

Een op flowcytometrie gebaseerde high-throughput techniek voor het screenen van integrineremmende geneesmiddelen

Calciuminflux, een maat voor T-celsignalering, is een effectieve manier om reacties op T-celreceptorstimulatie te analyseren. Dit protocol voor het multiplexen van Indo-1 met panelen van antilichamen gericht op celoppervlakmoleculen maakt gebruik van de zeer flexibele mogelijkheden van volledige spectrum flowcytometrie.

Analyse van T-celreceptor-geïnduceerde calciuminstroom in primaire muizen T-cellen door full spectrum flow cytometrie

Dit protocol combineert flowcytometrie en eencellige RNA-sequencing om microgliale celtoestanden in het cerebellum van vroege postnatale muizenhersenen te isoleren en te karakteriseren. Het maakt gebruik van enzymatische dissociatie, Percoll-centrifugatie en immunokleuring om de heterogeniteit van microglia's te onthullen en het begrip van hun rol in de ontwikkeling en ziekte van cerebellaire patiënten te verbeteren.

Flowcytometrie en eencellige analyse voor het karakteriseren van microglia-activering bij vroege postnatale hersenontwikkeling bij muizen

Leer imaging flow cytometry en transcriptoomprofilering om endocytotische functiestoornissen in vervuilingsblootgestelde humane dendritische cellen te evalueren. Deze methode koppelt genexpressie aan eiwitfunctie.

Integreren van Imaging Stroom Cytometry en profilering te evalueren veranderde endocytotische CD1d handel Transcriptomic

Meer video's verkennen