Integreren van Imaging Stroom Cytometry en profilering te evalueren veranderde endocytotische CD1d handel Transcriptomic

Deze methoden integreren de volgende generatie sequencing en flow cytometrie beeldvorming analyse. Het kan helpen bij het beantwoorden van interessante vragen, zoals de vraag of sommige fenotypische veranderingen zijn implicate, in plaats van de transcriptoom, vooral in de blootstelling van verontreinigende stoffen omgeving. Het belangrijkste voordeel van deze eenvoudige methode voor ons is dat we het kunnen gebruiken om de colocalisatie van biologisch belangrijke eiwitten te meten, om de resultaten van de belangrijkste differentiële genexpressie op functioneel niveau te interpreteren.

De implicaties van deze techniek breiden zich uit tot de diagnose van pathologische en toxicologische uitkomsten. Als een normale imager benadering, forsee heeft de mogelijkheid om genexpressie te verbinden met eiwitfunctie. Over het algemeen, individuen nieuw op deze methode zal worstelen vanwege de hoge technische eisen van de beeldvorming en transcriptomische analyse.

Om de menselijke monocyt afgeleide dendritische cel bibliotheek sequentie, eerst laden de volgorde en indexering reagentia op de sequencing biosynthese en indexering reagent racks, respectievelijk, en plaats de rekken in een laboratorium kwaliteit water bad voor een uur, totdat al het ijs is gesmolten, en de reagentia zijn grondig gemengd. Terwijl de reagentia ontdooien, de macht op de sequencer, het aansluiten van de computer op een netwerk station wanneer de Do Not Eject drive verschijnt, en start de sequencer control software. Voeg vervolgens ongeveer 100 milliliter onderhoudswasoplossing toe aan elk van de flessen in het sequencing biosynthese reagensrek en schroef een trechter op elke fles.

Voeg ongeveer 12 milliliter onderhoudswasoplossing toe aan elke 15 milliliter conische buis in het indexerende reagensrek en gooi de doppen weg. Laad vervolgens beide rekken op de sequencer. Selecteer Maintenance Wash in de sequencer control software en volg de instructies voor het reinigen van het sequencer vloeistofsysteem.

Gebruik een zaklamp om de stroomcel visueel te inspecteren op bellen die door de rijstroken gaan, om ervoor te zorgen dat er geen lekkage is. Wanneer de wasvolgorde is voltooid, opent u het tabblad Reeks en start u een nieuwe run, waarbij de uitvoergegevens naar een netwerkstation worden geleid. Upload een voorbeeldblad voor demultiplexing en voer de juiste reagensgegevens in.

Gebruik een gebruikte stroomcel om het systeem te primen, met de sequencing reagentia. Zodra de clustergeneratie is voltooid, verwijdert u de stroomcel. En licht besproeien de cel met water.

Veeg de stroomcel droog met lenspapier, gevolgd door een lichte spray met 95% ethanol. Nadat u de stroomcel weer droog hebt afgeveegd, controleert u het oppervlak van de stroomcel tegen het licht om er zeker van te zijn dat deze schoon is, zonder vuil of zoutresten. Wanneer de eerste stap is voltooid, laadt u de geclusterde stroomcel en begint u met de volgorde.

De sequence analysis viewer software wordt automatisch gestart. Ongeveer 26 uur later, controleer de volgorde van gegevens kwaliteit via de hoge volgorde controle software, en sequencing analyse view software om de kwaliteit van de gegevens te beoordelen, en voor eventuele problemen oplossen. Vervolgens, wanneer de reeks klaar is, verander de stroomcelpakking en voer een onderhoudswas uit voordat de volgende run begint.

Na de stroom cytometrische beeldvorming van de verontreinigende blootgestelde dendritische cellen, open ImageJ Fiji, en voeg de 100 opgeslagen celbeelden voor de niet-blootgestelde en verontreinigende blootgestelde menselijke dendritische cel monster groepen in individuele bestanden volgens de behandelingsgroep. Als u CD1d en Lamp1-colocalisatie binnen de twee populaties wilt analyseren, opent u de 100 samengevoegde celafbeelding met 100 verontreinigende stoffen en selecteert u Afbeeldings-, Kleur- en Gesplitste kanalen om de afbeelding op te splitsen in twee afzonderlijke afbeeldingen met één fluorofofoof per kanaal. Als u een spreidingsplot van de gekoloniseerde pixels wilt maken, selecteert u Analyseren, Colocaliseren en Colocalisatiedrempel en drukt u op Afdrukscherm om de spreidingsplot op te slaan.

Als u de colocalisatiecoëfficiënt van de Mander voor elke ééncellulaire afbeelding wilt berekenen, gebruikt u het ovale selectiegereedschap om een afbeelding met één cel in het afbeeldingsbestand met de gesplitste kanalen te selecteren en selecteert u Opnieuw Analyseren, Colocalisatie en Colocalisatiedrempel. Selecteer vervolgens Kanaal 1 in het dialoogvenster dialoog voor het interessegebied en klik op OK. Wanneer de coëfficiënt is berekend voor alle 100 celafbeeldingen, importeert u de resultaten in een geschikte spreadsheet en herhaalt u de analyse voor het niet-belichte celmonster voor controle. Aan de hand van RNA-sequencing en transcriptomische gegevensanalyses werden verschillende belangrijke veranderde genclusters geïdentificeerd, waaronder lipidenmetabolisme en endocytische functies in de aan verontreinigende stoffen blootgestelde DC's.

Op individueel celbeeldniveau kunnen HLADR-positieve CD11c-positieve dendritische cellen worden afgesloten, volgens hun CD1d- en Lamp1-coexpressie. Controle niet-blootgestelde dendritische cellen tonen minimale CD1d en Lamp1 eiwitkolonisatie, wat wijst op een basaal niveau van CD1d endocytische handel, en een hoog niveau van oppervlakte-expressie onder fysiologische omstandigheden. Terwijl CD1d wordt bewaard in de late endocytische compartimenten van aan verontreinigende stoffen blootgestelde dendritische cellen, bevestigt het veranderde endocytische genprofielen in deze experimentele celpopulatie.

Na het samenvoegen van de afzonderlijke cellulaire afbeeldingen in één afbeeldingsbestand, kunnen de afzonderlijke afbeeldingen worden gesplitst op basis van hun fluorofofexpressie en kan de colocalisatie van de pixelintensiteit tussen de twee kanalen worden gevisualiseerd in een spreidingsplot. De mate van colocalisatie tussen de CD1d en Lamp1 eiwitten in de twee behandelingsgroepen kan vervolgens worden gekwantificeerd met behulp van Mander's coëfficiënten. Als de eiwitintensiteit hetergeen is tussen de gekoloniseerde en niet-gekocaliseerde gebieden, zal de gekocaliseerde intensiteit niet parallel lopen met de colocalized gebieden, daarom is het ook belangrijk om de colocalisatie van de twee eiwitten verder te beoordelen, op basis van de pixelintensiteit.

Eenmaal onder de knie, kan de beeldanalyse in twee uur worden voltooid en kan de RNA-sequencing-instelling in drie uur worden voltooid, als elke techniek goed wordt uitgevoerd. Tijdens het proberen van deze procedure, is het belangrijk om te onthouden om ervoor te zorgen dat alle reagentia goed zijn geladen in de juiste posities, en dat er geen lekkage in de sequencer. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals micro-RNA, exoom of mastcelsequencing, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden over respectievelijk globale microRNA-expressie, genmutatie of DNA-methylatie.

Dus na de ontwikkeling zal deze techniek onderzoekers helpen op het gebied van cellulaire beeldanalyse, en de volgende generatie sequencing om het effect van de milieuverontreinigende stof op genexpressie en eiwitfunctie te onderzoeken. Na het bekijken van deze video, moet u een goed begrip van hoe het opzetten van de volgende generatie sequencing, en de imager analyse van eiwit colocalisatie. Vergeet niet dat het werken met een giftige chemische stof in menselijke bloedmonsters zeer gevaarlijk kan zijn.

Voorzorgsmaatregelen zoals het gebruik van een chemische rookkap, en persoonlijke beschermingsmiddelen, moeten altijd worden genomen bij het uitvoeren van deze procedures.