Synthese en karakterisering van 1,2-Dithiolane gemodificeerde zelfassemblerende Peptides

Naarmate structuren om de functionaliteit van supramoleculaire structuren te verhogen groeien, kan deze methode om 1, 2-dithiolane groepen te integreren met zelfassemblerende peptiden helpen om belangrijke vragen over de reactiviteit op supramoleculaire oppervlakken te beantwoorden. Het grote voordeel van deze techniek is dat de koppeling en deprotectie van de 1, 2-dithiolane precursor molecuul plaatsvindt op hars met slechts één enkele zuiveringsstap van het gemodificeerde peptide. Omdat de tijd die de assemblages nodig hebben om te rijpen tot hun uiteindelijke supramoleculaire structuren varieert, is visuele demonstratie van de karakteriseringsmethoden en resultaten voor de supramoleculaire assemblages cruciaal.

Om de dithiolane precursor te synthetiseren, los eerst één gram 3-broom-2-propionzuur op in ongeveer vier milliliter een-molare natriumhydroxide in een 50-milliliter ronde bodem reactiekolf bij 55 graden Celsius met roeren. Wanneer alle reagens is opgehangen in oplossing, verzegel de reactiekolf met een septum en plaats de kolf onder een stikstof atmosfeer. Voeg vervolgens 1,49 gram kaliumthioacetaat en drie milliliter twee-molare zwavelzuur toe aan vier milliliter gedeïoniseerd water om thioazijnzuur in situ te creëren.

Zuig de thioazijnzuur oplossing in een plastic, wegwerpbare 10-milliliter spuit en bevestig de spuit met een 18-gauge naald, prik vervolgens het septum met de naald om het mengsel druppelsgewijs aan de reactiekolf toe te voegen en de reactie door te laten gaan overnacht bij 55 graden Celsius. De volgende ochtend, bewaak de reactie door middel van dunne-laagchromatografie op silica gel 60 F254 platen met behulp van een mengsel van methanol en dichloormethaan en visualiseer de reactie voortgang door middel van bromocresol groen kleurstof. Wanneer de voltooide reactie is afgekoeld tot kamertemperatuur, zuur maak het mengsel met twee-molare zwavelzuur tot een pH van één.

Een gele olie zou zich moeten afscheiden uit de oplossing, extracteer vervolgens het product met drie 40-milliliter toevoegingen van koud chloroform en combineer de organische lagen voor droging over magnesiumsulfaat, verwijder het chloroform onder verminderde druk. Het product zou een gele olie moeten zijn met een totale opbrengst van 83%en kan worden gebruikt zonder verdere zuivering. Om de dithiolane precursor aan het N-terminus van het peptide op hars te koppelen, voeg vier equivalenten van dithiolane precursor toe aan vijf milliliter dimethylformamide, vier equivalenten van HBTU en 10 equivalenten van DIPEA.

Laat de koppelingsmixture 10 minuten preactiveren bij kamertemperatuur voordat u het monster toevoegt aan de fritted spuit met het N-terminus-hars. Schud de koppelingsreactie gedurende twee uur, gevolgd door drie vijf-milliliter wasbeurten in vers dimethylformamide en herhaal de koppelingsreactie en overnacht schudden. Na de tweede koppeling, was de hars met drie vijf-milliliter dimethylformamide wasbeurten gevolgd door drie vijf-milliliter dichloormethaan hars wasbeurten en breng de droge hars over naar een 10-milliliter microgolf reactiebuis.

Vervolgens, om de thioacetaatgroep van het N-terminus dithiolane precursor te deprotecteren, voeg twee milliliter dimethylformamide toe aan de buis. Laat de hars zwellen, voeg een kleine magnetische roerder toe aan het vat en hersuspendeer de hars met lage snelheid magnetische roering. Na 15 minuten, voeg twee milliliter geconcentreerde ammoniumhydroxide toe aan de buis, dek het reactievat af met een siliconen septum en plaats het vat in een microgolfreactor gedurende 45 minuten bij 75 graden Celsius met roeren.

Wanneer de microgolfreactie voltooid is, breng de hars over in een schone, wegwerpbare, fritted spuit en was de hars met twee vijf-milliliter dimethylformamide en twee vijf-milliliter methanol wasbeurten. Na de laatste wasbeurt, voeg vijf milliliter cleaving cocktail toe aan de hars bevattende spuit voor een 1 1/2 uur incubatie met zacht schudden bij kamertemperatuur. Om één milliliter ruw peptide voor hoge prestatie vloeistof chromatografie of HPLC zuivering voor te bereiden, voeg 400 microliter geconcentreerd peptide stock in acetonitrijl toe aan 600 microliter water aangevuld met 0,1% trifluorazijnzuur en filter de oplossing door een 22-micrometer spuit filter in een HPLC vat.

Gebruik een C18 semi-preparatieve kolom met een stroomsnelheid van drie milliliter per minuut over een lineair gradient van 15 tot 55% acetonitrijl in 20 minuten met de UV-detectors ingesteld op 222 nanometer en 330 nanometer om het peptide te zuiveren. Verzamel vervolgens en combineer de pieken van belang. Voor peptide product bevestiging door matrix-ondersteunde laser desorptie/ionisatie tijd van vlucht of MALDI-TOF massa spectrometrie, meng 0,5 microliter van de verzamelde piek op een matrix-ondersteunde laser desorptie/ionisatie plaat bevattende 0,5 microliter van 2, 5-dihydroxybenzoëzuur matrix.

Los één milligram van het gelyofiliseerd peptide poeder op in een mengsel van 20% acetonitrijl en 10-millimolair HEPES in een 1,5-milliliter microcentrifugebuis om een zelfassemblerende oplossing voor te bereiden, vervolgens draai de assemblage oplossing en laat het monster bij kamertemperatuur assembleren. Wanneer de peptide assemblage rijpt, droog acht tot tien microliters van de assemblage oplossing als een dunne film op de geattenueerde totale reflectie diamant kristal en bewaak het verdwijnen van een grote en brede water piek van 1640 tot 1631 inverse centimeters terwijl de droge film vormt. Verzamel achtergrond en infrarood spectra van 1500 tot 1800 inverse centimeters met een gemiddelde van 50 scans met een resolutie van twee inverse centimeters, trek de achtergrond scans af voorafgaand aan elke monsterscan.

De infrarood signatuur voor beta blad assemblage moet worden waargenomen als een scherpe piek tussen 1625 en 1635 inverse centimeters. Wanneer de peptide monsters rijpen tot beta-blad-rijke supramoleculaire structuren, laad tien microliters van de peptide assemblage oplossing op het oppervlak van een transmissie elektronenmicroscoop koolstof rooster en laat de assemblages een tot twee minuten adsorberen op