Gelijktijdige studie van de aanwerving van monocyt subpopulaties onder stroom In Vitro

Voor deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van ontsteking en immunologie. Bijvoorbeeld, wat zijn de moleculaire mechanisme van leukocyten hechting en trans-endotheel migratie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het onbeperkt gebruik van discriminatie tussen transmigratie en sterke toevoeging van monocyten aan endotheelmonolaag mogelijk maakt.

Hoewel deze methode informatie biedt over de rekrutering van monocyten op de stroom, kan deze ook worden aangepast aan andere cellen van de hematopoietische systemen zoals T-cellen, B-cellen of derivaten van subpopulatie daarvan. Na het wassen, etiket de menselijke navelstreng ader endotheelcellen of HUVEC met 30 microliter van 37 graden Celsius M199 medium aangevuld met een micromolar CMFDA gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius en 5%Kooldioxide. Aan het einde van de incubatie, was de cellen met 150 microliter van volledige M199 medium en broeden de cultuur in 150 microliters van verse complete M199 medium voor nog eens 30 minuten.

Vervang vervolgens de supernatant door 150 microliters van volledig M199-medium met de juiste experimentele supplementen en breng de diakamercultuur zes uur terug naar de couveuse. Verdun voor menselijke PAN monocyt isolatie een vers verzameld bloedmonster in PBS aangevuld met één millimolar EDTA met één-op-één verhouding en leg voorzichtig 20 ml van de bloedoplossing op 20 ml dichtheidsgradiëntmedium voor dichtheidsgradiëntscheiding door centrifugatie. Verzamel de middelste perifere bloed mononucleaire celplaatjeslaag in een nieuwe buis van 50 ml met 40 ml PBS aangevuld met 1 millimolar EDTA en breng het uiteindelijke volume op 50 ml met extra PBS-EDTA Na het tellen isoleren de monocyten met de PAN monocyte isolatiekit volgens de instructies van de fabrikant.

En was de cellen drie keer in M199 medium aangevuld met 0,5%Bovine Serum Albumin, of BSA, om eventuele sporen van EDTA te elimineren. De kwaliteit van monocytenisolatie is van cruciaal belang voor een robuuste transmigratie en hechtingsresultaat. Het is dus belangrijk om de aanbeveling van de fabrikant voor het isolement strikt te volgen.

Resuspend de pellet op een 6 keer 10 tot de 6 monocyten per ml concentratie in verse M199 medium aangevuld met 0,5%BSA en verdeel de cellen in een 200 microliter aliquot per microcentrifuge buis per wervingstest. Plaats vervolgens de cellen op 37 graden Celsius gedurende 20 minuten voor hun injectie in de flow kamer. Om het fluidic systeem voor te bereiden op de analyse, steek je eerst een mannelijke luer connector in het ene uiteinde van een 8 cm lang 3 mm dik stuk siliconenbuizen en sluit het andere uiteinde aan op een inline luer injectieset.

Sluit vervolgens de luerconnector aan op één uiteinde van een 40 cm lang 3 mm dik stuk siliconenbuis. Vervolgens, de 20 mm spuit aan het ene uiteinde van een 1 m lang 3mm dik stuk siliconen buizen en steek een mannelijke luer connector aan de andere kant. Steek vervolgens beide mannelijke luer connectors in een vrouwelijke luer lock koppeling en plaats het vrije uiteinde van de siliconen buizen in een reservoir van 37 graden Celsius M199 medium aangevuld met 0,5%BSA.

Trek de zuiger in om de slang te vullen met stroombuffer en zet de spuit vast op de spuitpomp. Stel vervolgens de pomp in op de opnamemodus en geef de stroomsnelheid op. Om de schuifkamer aan te sluiten, klemt u de siliconenbuis rond de vrouwelijke luerslotenkoppeling en koppelt u de twee luerconnectormannetjes los van de koppeling, zodat ze op het reservoir van de glijbaan kunnen worden aangesloten.

Luchtbellen verstoren niet alleen de beeldkwaliteit, maar veroorzaken ook capillaire pure stress aan de cellen, wat leidt tot celdood. Om luchtbellen te voorkomen, bevestigt u de juiste klemmen van de slang voordat u de luer in het reservoir plaatst. Verwijder vervolgens de klemmen om te bevestigen dat de verbinding niet lekt en plaats de glijbaan onder de microscoop.

Voor de beeldvorming van de monocyten werving onder stroom, voeg 5 microliter bloemscentie geconjugeerde anti-CD16 antilichaam en een geschikte nucleaire kleurstof aan elke aliquoted monocyten voor een 10 minuten incubatie bij kamertemperatuur en het verzamelen van de cellen met een korte centrifugatie. Resuspend de pellet in 250 microliters van de stroom buffer en start de spuit pomp. Voeg 30 microliter van één monocytensuspensie toe aan één kamer van de dia en selecteer de 40X-doelstelling op de confocale microscoop.

Activeer de juiste fluorescerende lasers en gebruik de kamer met de gelabelde monocyt om de aankoopparameters van de confocale microscoop in te stellen Vervolgens selecteert u drie gezichtsvelden binnen een straal van een halve centimeter voor confocale beeldvorming met meerdere posities en stelt u een Z-stapel in op het bereik van 10 tot 12 micrometer en de time lapse-acquisitie om elke minuut te lopen. Na drie minuten van beeldvorming, injecteren 200 microliter van monocyten via de inline luer injectie poort en beginnen met het imaging van de cellulaire interactie. Na ten minste 30 minuten stopt u de beeldvorming en de stroom en klemt u de slang zodat deze van de glijbaan kan worden losgekoppeld.

Als u de transmigratiesnelheid van de cellen wilt bepalen via de gestimuleerde HUVECs, opent u afbeelding J en telt u het totale aantal aanhangende monocyten in elk veld om het aantal cellen per vierkante millimeter te bepalen. Tel vervolgens het aantal transmigreerde monocyten die aanwezig zijn in het basale vlak onder de endotheelcellen, zoals geïdentificeerd door de aanwezigheid van een zwarte gatzone rond de kern. Een eenvoudige manier om de activeringsstatus van de HUVECs na stimulatie te controleren, is door hun verlenging onder ontstekingsstress te visualiseren.

Time lapse confocale beeldvorming maakt visualisatie van de monocyten op het apicale vlak waar hun fenotype kan worden beoordeeld. Migrerende cellen die transmigratie ondergaan, worden verplaatst naar de intercellulaire cel-naar-celverbinding voordat ze uit het apicale vlak verdwijnen en opnieuw in het basale vlak verschijnen. De kwantificering van de monocyte rekrutering in de loop van de tijd bevestigt dat monocyten adhesie wordt gevolgd door transmigratie.

De transmigratiesnelheid van CD16 positieve monocyt is laag wanneer de endotheelcel alleen met TNF alpha wordt gestimuleerd, maar toeneemt wanneer de endotheelcellen worden gestimuleerd met zowel TNF alfa als vasculaire endotheelgroeifactor of VEGFA. HUVEC stimulatie met TNF alpha en TNF alpha plus VEGFA induceert een toename van de hechting aan CD14 negatieve T, B en NK cellen, te vergelijken met CD14 positieve monocyten. Bovendien induceert HUVEC-stimulatie alleen transmigratie van de monocytenpopulatie, omdat T-, B- en NK-cellen niet transmigreren onder TNF-alfa- of TNF-alfa- plus VEGFA-stimulerende omstandigheden.

Om een optimale monocyte recruitment test uit te voeren, is het belangrijk dat u uw experiment van tevoren plant en op dezelfde dag doet. En als je de cellen zuivert, zorg er dan voor dat je microscoop op 37 graden is, zodat je de cellen niet op verschillende temperatuur overbrengt tijdens het experiment. Om deze procedure te leren, kunnen alle methoden zoals de profilering van HUVEC cytokine en chemokine expressie evenals chemotaxis studies worden uitgevoerd om aanvullende vragen over het moleculaire mechanisme dat de transmigratie en hechting van specifieke monocyten populatie te ondersteunen beantwoorden.