Structurele Studies van macromoleculen in oplossing met behulp van kleine Angle X-Ray Scattering

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van biochemie, zoals grootte, vorm en conformatieveranderingen van biomoleculen en hun complexen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat experimenten kunnen worden uitgevoerd onder fysiologisch relevante bufferomstandigheden in een omgeving waar biomoleculen stabiel zijn. SAXS is een gratis techniek voor vele andere biofysische en structurele biologie methoden.

Het combineren van SAXS met deze methoden kan ons helpen bij het ontwikkelen van op structuur gebaseerde therapieën. Hoewel deze methode inzicht kan geven in biomoleculaire complexen, kan het ook worden toegepast op andere systemen, zoals het bestuderen van nanodeeltjes en verlening van geneesmiddelen. Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn bij deze methode het moeilijk hebben omdat het lijkt op een overweldigend en ingewikkeld proces, om van ruwe verstrooiingsgegevens naar structuren met lage resolutie te gaan.

Visuele demonstratie van deze methode is van cruciaal belang als de pijplijn van gegevensanalyse om structurele modellen te verkrijgen van ruwe gegevens is moeilijk te leren, omdat het gaat om het gebruik van veel verschillende pakketten van software. Er zijn een paar softwarepakketten die nuttig zijn voor SAXS-gegevensanalyse. Deze omvatten SCATTER, BioXTAS RAW en de ATSAS suite.

In deze video geven we een overzicht van de algemene stappen die moeten worden genomen bij het analyseren van ruwe SAXS-gegevens, met behulp van de ATSAS-programmasuite. Installeer en laad de ATSAS-programmasuite om te beginnen. Open het PRIMUS/Qt-programma en ga naar de optie Menu openen.

Selecteer hier maximaal 13 gegevensbestanden van belang. De gegevensbestanden moeten zich in de ASCII-indeling hebben, waarbij de eerste kolom de s-vectoras is en de tweede kolom de intensiteit. Herhaal deze stap voor de alleen gegevens van de buffer en voeg deze gegevens in een tweede menu Extra in.

Navigeer vervolgens naar het venster Gegevensverwerking en selecteer Aftrekken. Dit genereert een afgetrokken verstrooiingscurve, die alleen de verstrooiing van het macromolecuul van belang vertegenwoordigt. Als u Guinier-analyse wilt uitvoeren, begint u met een afgetrokken spreidingscurve voor buffer die is geladen in PRIMUS/Qt.

Klik vervolgens op Radius of Gyration, die de Primus Guinier Wizard zal openen. Op dit punt wordt een plot weergegeven met het natuurlijke logboek van de intensiteit versus verstrooiingshoeken in het kwadraat. Als u een voorlopige straal van gyration wilt verkrijgen, zoekt u het venster Opdrachtprompt en gebruikt u de functie Autorg.

Na het duwen van Autorg, klik op de bovengrens een, dan naar beneden een om het programma te dwingen om de statistische metingen bij te werken. U ook meerdere bestanden tegelijk invoeren door op dezelfde open prompt te klikken en meerdere namen van gegevensbestanden te selecteren door ze op dezelfde manier te markeren als eerder beschreven. Klik om de Kratky-analyse te starten om de naam van het gegevensbestand te selecteren.

Hiermee worden de gegevens in het venster uitgezet. Selecteer Plot en selecteer vervolgens Plot. Klik vervolgens onder de plotknop op Kratky Plot.

Als gevolg hiervan tonen bolvormige eiwitten een GALC-ean-piek terwijl ongevouwen eiwitten een plateau weergeven in plaats van een piek en lijken op een hyperbolische plot zoals hier getoond. Laad buffer afgetrokken gegevens voor elke concentratie in PRIMUS/Qt nogmaals. En klik onder het tabblad Verwerking op Schalen en inspecteren van elke curve en het i-schaalnummer, dat correleert met de verdunningen die zijn gemaakt van het oorspronkelijke monster.

Na inspectie voegt u de gegevens samen door op de knop Samenvoegen in het venster Verwerking te klikken. Als u het verspreidingsclot voor afstand wilt genereren, laadt u de samengevoegde gegevenscurven in PRIMUS/Qt en klikt u op Afstandsverdeling op het tabblad Analyse. Pas het gegevensbereik van de samengevoegde gegevens aan om significante ruis aan de staart van de ruwe gegevens te voorkomen.

Laat ook gegevenspunten weg dicht bij de beamstop in het lage-q-gebied door de lagere bereikwaarde te selecteren en het aantal te verhogen. Om de Dmax te bepalen, begin met een bereik van vijf keer de straal van gyration verkregen uit de Guinier-analyse. Verlaag deze waarde vervolgens geleidelijk totdat het afstandsverdelingsperceel niet abrupt naar nul op de y-as zakt en geen lange staart heeft voordat het nul nadert.

Controleer of de experimentele straal van gyration versus intensiteit plot, die is afgeleid van de Guinier benadering en de afstand verdeling straal van gyration versus intensiteit nummers vergelijkbaar zijn. Hier wordt de intensiteit van strooilicht weergegeven uitgezet tegen verstrooiingshoek, wat zowel de kwaliteit van de biomoleculen nidogen-1, laminine gamma-1 en hun complex, evenals hun vorm suggereert. De elektronenpaar afstand verdeling bepaald uit de verstrooiing gegevens suggereert dat de biomoleculen hebben een langwerpige vorm en de Kratky plot suggereert dat de eiwitten zijn in een gevouwen toestand, als de gegevens de neiging om plateau, of zelfs toenemen in de grotere q-range en gebrek aan een bel curve vorm.

Daarnaast wijzen de percelen Guinier, die gegevens bij lage verstrooiingshoek gebruikt, het lineaire gebied voor bepaling van de straal van gyration aan, die hier voor nidogen-1, laminine gamma-1 en hun complex wordt getoond. Om eiwit-eiwitcomplexen te bestuderen, werd MONSA gebruikt om de lage resolutiestructuur van het gehele nidogen-1 laminine gamma-1 complex te verkrijgen, wat suggereert dat alleen het C-terminale gebied van beide eiwitten deelnemen aan bemiddelende interacties, terwijl de rest van de domeinen ver van elkaar verwijderd zijn. Vergeet niet dat het werken met Synchrotron straling kan zeer gevaarlijk zijn en voorzorgsmaatregelen en veiligheid geschetst door elke verschillende beamline moet altijd worden genomen tijdens het uitvoeren van de eerste gegevensverzameling.