Name: Bouw van een meerdere lagen mesenchymale stamcellen blad met een 3D dynamische cultuur-systeem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Leer de constructie van meerdere lagen mesenchymale stamcellen met een 3D dynamisch cultuursysteem. Deze methode verbetert de voedingsvoorziening en behoudt stamceleigenschappen voor effectieve regeneratieve therapieën.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door de National Natural Science Foundation of China (subsidie nummer 31771064); de wetenschap en de technologie Planning Project van de provincie Guangdong (subsidie nummers 2013B010404030, 2014A010105029 en 2016A020214012); de wetenschap en de technologie Planning Project van Guangzhou (subsidie nummer 201607010063); en de Undergraduate innovatie en ondernemerschap trainingsprogramma (subsidie nummer 201610559028); de National Science Foundation voor jonge wetenschappers van China (verlenen nummer 31800819).

Alle stamcel en dierlijke experiment procedures werden uitgevoerd volgens de ethische richtsnoeren voor de nationale gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren en goedgekeurd door het Jinan Universiteit Animal Care en gebruik Comité (Guangzhou, China).
1. bereiding van de DPP steiger met de PLA2 Decellularization methode14
Opmerking: Zie figuur 1A voor een schematische voorstelling van de PLA-2 decellularization-methode.
<ol><li>100 mL 200 U/mL PLA2 oplossing voor te bereiden. Voeg 0,5 g natrium deoxycholate en 2 mL PLA2 in 198 mL van de bufferoplossing carbonaat. Deze oplossing moet binnen 24 uur na de bereiding worden gebruikt.</li>
	<li>De verse varkens hartzakje (FPP) verkrijgen bij het slachthuis en terug te keren naar het laboratorium binnen 1 uur. Opmerking: De FPP moet worden bewaard bij 4 ° C tijdens het vervoer. 1.2-1.10 stappen moeten worden uitgevoerd met continue schudden in een waterbad met thermostaat-gecontroleerde.</li>
	<li>Grondig wassen de FPP met 200 mL fosfaatbuffer (PBS) met 1% penicilline-streptomycine in een bekerglas van 500 mL op 10 ° Cfor 10 min. Herhaal deze stap 2 x.</li>
	<li>De FPP gesplitst in twee lagen en verwijderen van het vetweefsel met Tang en schaar. Opmerking: Houd de FPP NAT door toevoeging van 50 mL PBS iedere 20 minuten tijdens het verwijderen van het vetweefsel.</li>
	<li>Vorm de FPP in 10 x 10 cm2 stukken met een schaar. De FPP met 200 mL van de bufferoplossing carbonaat (CBS) met 1% penicilline-streptomycine in een bekerglas van 500 mL op 10 ° C voor 10 min. Herhaal deze stap 2 x wassen.</li>
	<li>De FPP overbrengen in zuiver water en geniet het bij 10° C gedurende 12 h.</li>
	<li>Geniet van de 10 x 10 cm2 monsters in 50 mL CBS met 200 U/mL PLA2 en 0,5% (w/v) natrium deoxycholate oplossing bij 37 ° C gedurende 6 uur.</li>
	<li>Wassen van de monsters met CBS met 1% penicilline-streptomycine bij 10 ° C gedurende 10 min. Herhaal deze stap 2 x.</li>
	<li>Geniet van elk monster in 50 mL CBS met 200 U/mL PLA2 en 0,5% (w/v) natrium deoxycholate oplossing bij 37 ° C gedurende 2 uur.</li>
	<li>Wassen de monsters met CBS met 1% penicilline-streptomycine bij 10 ° C gedurende 2 h. Herhaal deze stap voor 10 x ten minste. Leg de monsters op vlakke platen en droog ze tot constant gewicht in een constante temperatuur oven op 55 ° C. Opmerking: Het monster moet volledig worden gedroogd. Weeg het DPP monster elke 10 min en herhaal dat 3 x of totdat het gewicht niet meer verandert.</li>
	<li>Elk monster DPP vorm in een cirkel met diameter van 10.5 mm met een trephine. Pak elk DPP in een steriele verzegelde zak.</li>
	<li>Steriliseren de DPP monsters door gamma bestraling (25 kGy). De DPP monsters bij 4 ° C vóór gebruik opgeslagen. Opmerking: Alle monsters kunnen worden opgeslagen voor maximaal zes maanden bij 4 ° C.</li>
</ol>2. voorbereiding van de cel blad bouw
<ol><li>Autoclaaf alle instrumenten en weefsel vervoerder onderdelen bij 121 ° C voor 30 min, met inbegrip van 1,5 mL centrifugaal buizen, pincet, pincet, schaar, getande zwarte basen (onderdeel van de drager van de weefsel) en witte spanning ringen (onderdeel van de drager van de weefsel).</li>
	<li>20 mL 10% sacharoseoplossing kiem-vrije voor te bereiden. Gewicht 2 g van sacharose en los van de sucrose in 18 mL ultrazuiver water. Autoclaaf de 10% sacharoseoplossing bij 121 ° C gedurende 30 minuten of filter de oplossing met een 0,22 µm filter.</li>
	<li>Autoclaaf de dynamische perfusie systeemapparaten bij 121 ° C gedurende 30 minuten, met inbegrip van een gas uitwisseling van apparatuur, een 500 mL glazen fles, een perfusie cultuur container en het bindweefsel buizen.</li>
	<li>Bereiden de gesteriliseerde met autoclaaf instrumenten en weefsel vervoerder onderdelen. De zwarte basisartikel van de drager van weefsel in een cultuur schotel plaatsen</li>
	<li>Pak een gedroogde DPP-steiger en zet het in het midden van de zwarte basis. Een ring van wit spanning zetten de DPP-steiger en repareren in de drager van weefsel. Opmerking: Zorg ervoor de steiger is helemaal vast in het weefsel drager en er is geen kloof tussen de zwarte basis en de spanning van de witte ring. Als dat niet het geval is, scheiden de vervoerder weefsel en monteren van de steiger weer.</li>
	<li>Voeg 100 µL cultuurmedium op het schavot DPP voor rehydratie. Opmerking: Indien het schavot niet goed in het weefsel drager is vastgesteld, zal het kweekmedium infiltreren de cultuur schotel.</li>
	<li>Het schavot gebracht een incubator 37 ° C en laat ze weken 15 min.</li>
</ol>3. voorbereiding van de cellen van de cel blad bouw
Opmerking: Dit protocol is voor de cultuur van de cel met behulp van een schotel van 100 mm. Zie figuur 1B voor een schematische voorstelling van de bouw van de meerdere lagen celstructuur.
<ol><li>BMSCs13te isoleren. Opmerking: Deze methode is bedoeld voor de bouw van een meerdere lagen cellaag van MSC. BMSCs van de rat worden in dit protocol gebruikt. De BMSCs zijn geïsoleerd met behulp van de hele beenmerg aanhangend methode, en de BMSCs zijn uitgevouwen in vitro genoeg cel bedrag te verkrijgen.<ol>
<li>Autoclaaf de instrumenten bij 121 ° C gedurende 30 minuten, inclusief pincet, getande Tang en schaar. Bereid een 2 mL injectiespuit en BMSC kweekmedium (Dulbecco van gewijzigd Eagle's medium [DMEM], foetale runderserum 10%, 1% glutamine en 1% penicilline-streptomycine).</li>
		<li>De drie weken oude mannelijke Sprague-Dawley (SD) ratten door cervicale wervel dislocatie euthanaseren. Geniet van het dier in 100 mL 75% alcohol oplossing in een bekerglas gedurende 5 minuten.</li>
		<li>Neem het dier uit het bekerglas en plaats het gevoelig op de operatie tafel. Incise de huid op de rug van het dier met een schaar en pincet. Isoleren van de huid en spier weefsels om de dij dijbeen bloot te stellen.</li>
		<li>Isoleren van de dij dijbeen en zet het in 30 mL PBS in een centrifugebuis 50 mL. Plaats twee dij dijbeen in één buis. Vortex de centrifugebuis te grondig wassen van het weefsel. Herhaal deze stap 2 x.</li>
		<li>Snijd beide uiteinden van het dijbeen met een schaar en bloot de holte van het beenmerg.</li>
		<li>2 mL BMSC-kweekmedium gecombineerd met een injectiespuit. Plaats de naald in de holte van beenmerg en spoelen van het beenmerg met kweekmedium. Spoelen van elke twee dij dijbeen in één schotel van 100 mm cultuur.</li>
		<li>Voor elke 100 mm cultuur schotel, voeg toe 2 mL gestolde voedingsbodem in de cultuur-schotel. Zet de schotel van cultuur in de 37 ° C incubator en statische cultuur gedurende 72 uur.</li>
		<li>Neem de cultuur schotel uit de incubator. De bovendrijvende substantie vervangen door 6 mL verse kweekmedium.</li>
		<li>Primaire BMSCs onder een microscoop te observeren. Na dit, passage de BMSCs elke 5-7 d.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nemen de cellen uit de incubator. Observeren van de cellen onder een microscoop en kiezen van geschikte cellen voor cel blad bouw. Wanneer de BMSCs 80% - 90% samenvloeiing bereikt, kunnen de cellen als de geplaatste cellen worden gekozen.</li>
	<li>Verwijder het kweekmedium uit de cultuur-schotel. Voorzichtig wassen de cellen met 2 mL warme PBS. Verwijder alle PBS uit de cultuur-schotel en maak zeker niet vloeibaar blijft. Voeg 2 mL trypsine van 0,25% (of een andere dissociating oplossing) aan de schotel en Incubeer bij 37 ° C gedurende 3 minuten.</li>
	<li>Stop het trypsine effect door toevoeging van 2 mL gestolde voedingsbodem, en de cellen van de schotel voorzichtig te wassen. Breng de celsuspensie in een nieuwe centrifuge-tube van 15 mL. Centrifugate de cellen bij 225 x g gedurende 5 min.</li>
	<li>Verwijder het supernatant. Resuspendeer de cellen met 3 mL 10% (m/v) sacharoseoplossing. Opmerking: 10% (m/v) sacharoseoplossing wordt gebruikt om te wassen van de cellen met het oog op een uniforme cel-hydrogel mengsel in de volgende stappen.</li>
	<li>10 µL van de celsuspensie gecombineerd en tellen van het aantal cellen met een hemocytometer. Berekenen van het volume die nodig zijn voor de volgende stap. Voor één cellaag, worden drie miljoen BMSCs gebruikt.</li>
	<li>Pak drie miljoen cellen en ze vervolgens overbrengen naar een nieuwe centrifuge-tube van 15 mL. Centrifugeer de cellen bij 225 x g gedurende 5 min.</li>
	<li>Verwijder het supernatant. Resuspendeer de cellen met 1 mL 10% (m/v) sacharoseoplossing. Breng de celsuspensie in een centrifugebuis 1,5 mL. Opmerking: Met behulp van een centrifuge buis van 1,5 mL is gunstig voor het voorbereiden van het mengsel van cel-hydrogel.</li>
	<li>De cellen op 260 xg centrifugeren voor 5 min. volledig verwijderen van het supernatant en verkrijgen van het sediment van de cel.</li>
</ol>4. voorbereiding van de BMSCs en de RAD16-ik Peptide Hydrogel mengsel
Opmerking: Zie figuur 1B voor een schematische voorstelling van de bouw van de meerdere lagen celstructuur.
<ol><li>20 µL van 10% (m/v) sacharoseoplossing aan de centrifugaal tube van 1,5 mL toevoegen. Zachtjes resuspendeer de BMSCs en een uniforme suspensie te verkrijgen. Opmerking: Tijdens de resuspensie geen bubbels genereren.</li>
	<li>Voeg 20 µL van RAD16-ik peptide hydrogel aan de bovenkant van de schorsing. Roer voorzichtig de RAD16-ik peptide en cel ophanging met het uiteinde van de pipet. Wanneer de celsuspensie en hydrogel zijn vermengd, Pipetteer zacht het mengsel een paar keer.</li>
	<li>Neem de DPP-steiger uit het weefsel vervoerder en zachtjes gecombineerd het kweekmedium met een pipet tip. Opmerking: Zorg ervoor is volledig gerehydrateerd de DPP-steiger alvorens de cel-hydrogel mengsel toe te voegen.</li>
	<li>Het mengsel gecombineerd en gelijkmatig toe te voegen aan de DPP-steiger. Opmerking: Het totale volume van het mengsel zou ongeveer 40-50 µL. Het is aanbevolen om het mengsel 10 µL per keer toevoegen vanuit het midden naar de buitenkant van de steiger.</li>
	<li>Voeg 1 mL gestolde voedingsbodem aan de bodem van de drager van weefsel. Zet de cellaag in de incubator van de 37 ° C gedurende 5 minuten.</li>
	<li>Haal het vel van de cel uit de incubator. Zachtjes Voeg 4 mL gestolde voedingsbodem in de cultuur-schotel en dompel het blad van de cel. Zet de cellaag in de incubator van de 37 ° C gedurende 2 uur van statische cultuur.</li>
</ol>5. in Vitro cultuur van een 3D meerdere lagen cellaag met behulp van een systeem van dynamische cultuur
Opmerking: Zie Figuur 1 c voor een schematische voorstelling van de 3D dynamische systeem.
<ol><li>Het dynamische perfusie-systeem, inclusief een peristaltische pomp, gas uitwisseling apparatuur, een 500 mL glazen fles, een perfusie cultuur container en het bindweefsel buizen voor te bereiden. Monteer het dynamische perfusie-systeem zoals weergegeven in Figuur 2.</li>
	<li>Voeg 200 mL gestolde voedingsbodem aan de steriele fles. Plaats de cellaag in de kamer van de cultuur-container. Opmerking: Let op de richting van de bovenkant van het blad van de cel.</li>
	<li>Voeg 3 mL gestolde voedingsbodem in de container van de weefsels en sluiten van de container. Zet het dynamische perfusie-systeem in de incubator en start van de pomp. Het debiet van de peristaltische pomp vastgesteld op 8 mL/min. cultuur, wordt de cellaag in het dynamische perfusie-systeem gedurende 48 uur.</li>
</ol>6. het verkrijgen van de cellaag van meerdere lagen MSC
<ol><li>Autoclaaf de instrumenten en het weefsel vervoerder onderdelen bij 121 ° C gedurende 30 minuten, inclusief 1,5 mL centrifugaal buizen, pincet en getande pincet.</li>
	<li>Het input kanaal van de fles om te stoppen met de levering van kweekmedium aan de container uitlichten. Opmerking: Stop de peristaltische pomp wanneer de cultuur-container leeg is.</li>
	<li>Neem de cellaag van de cultuur-container en zet het in een cultuur schotel.</li>
	<li>Gebruik één verlostang om te immobiliseren van de vervoerder weefsel en gebruik een andere getande pincet te scheiden van de spanning van de witte ring van de zwarte basis. Ten slotte krijgen de meerdere lagen cellaag van de BMSCs.</li>
	<li>Voor korte behoud, kan elke cellaag worden overgedragen aan een centrifugaal tube van 1,5 mL met de pincet. De DPP-steiger moet worden gekoppeld aan de binnenwand van de centrifugaal buis, en de cellaag moet verspreid uit zo veel mogelijk in de centrifugebuis.</li>
	<li>Zachtjes toevoegen 1 mL gestolde voedingsbodem in de centrifuge buis om te dompelen de cellaag. Sluit de dop van de centrifugaal buis en slaan de cellaag bij 4 ° C. Opmerking: De cellaag moet worden getransplanteerd of zo spoedig mogelijk geanalyseerd. Het is aanbevolen om gebruik van de cellaag binnen 4 uur.</li>
</ol>

<ol><li>Miyahara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolayered+mesenchymal+stem+cells+repair+scarred+myocardium+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Monolayered mesenchymal stem cells repair scarred myocardium after myocardial infarction.</a> Nature Medicine. 12 (4), 459-465 (2006).</li>
<li>Narita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+cell-sheet+technique+eliminates+arrhythmogenicity+of+skeletal+myoblast-based+therapy+to+the+heart+with+enhanced+therapeutic+effects%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">The use of cell-sheet technique eliminates arrhythmogenicity of skeletal myoblast-based therapy to the heart with enhanced therapeutic effects.</a> International Journal of Cardiology. 168 (1), 261-269 (2013).</li>
<li>Narita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Use+of+Scaffold-free+Cell+Sheet+Technique+to+Refine+Mesenchymal+Stromal+Cell-based+Therapy+for+Heart+Failure%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">The Use of Scaffold-free Cell Sheet Technique to Refine Mesenchymal Stromal Cell-based Therapy for Heart Failure.</a> Molecular Therapy. 21 (4), 860-867 (2013).</li>
<li>Matsuo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficiently+Piled-Up+Cardiac+Tissue-Like+Sheets+With+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cells+Robustly+Promotes+Cell+Engraftment+and+Ameliorates+Cardiac+Dysfunction+After+Myocardial+Infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Efficiently Piled-Up Cardiac Tissue-Like Sheets With Pluripotent Stem Cell-Derived Cells Robustly Promotes Cell Engraftment and Ameliorates Cardiac Dysfunction After Myocardial Infarction.</a> Circulation. 128 (22), (2013).</li>
<li>Alshammary, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+cardiac+stem+cell+sheet+transplantation+on+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Surgery+Today%22%5BJournal%5D)">Impact of cardiac stem cell sheet transplantation on myocardial infarction.</a> Surgery Today. 43 (9), 970-976 (2013).</li>
<li>Chen, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+a+novel+PLGA+fiber%2Fcollagen+composite+web+as+a+scaffold+for+engineering+of+articular+cartilage+tissue+with+adjustable+thickness%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+A%22%5BJournal%5D)">The use of a novel PLGA fiber/collagen composite web as a scaffold for engineering of articular cartilage tissue with adjustable thickness.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 67a (4), 1170-1180 (2003).</li>
<li>Cerqueira, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Adipose+Stem+Cells+Cell+Sheet+Constructs+Impact+Epidermal+Morphogenesis+in+Full-Thickness+Excisional+Wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Human Adipose Stem Cells Cell Sheet Constructs Impact Epidermal Morphogenesis in Full-Thickness Excisional Wounds.</a> Biomacromolecules. 14 (11), 3997-4008 (2013).</li>
<li>Sasagawa, T., Shimizu, T., Sekiya, S., Yamato, M., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+angiogenic+potential+between+prevascular+and+non-prevascular+layered+adipose-derived+stem+cell-sheets+in+early+post-transplanted+period%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+A%22%5BJournal%5D)">Comparison of angiogenic potential between prevascular and non-prevascular layered adipose-derived stem cell-sheets in early post-transplanted period.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 102 (2), 358-365 (2014).</li>
<li>Ishii, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilayered+adipose-derived+regenerative+cell+sheets+created+by+a+novel+magnetite+tissue+engineering+method+for+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Multilayered adipose-derived regenerative cell sheets created by a novel magnetite tissue engineering method for myocardial infarction.</a> International Journal of Cardiology. 175 (3), 545-553 (2014).</li>
<li>Godier-Furnemont, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composite+scaffold+provides+a+cell+delivery+platform+for+cardiovascular+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Composite scaffold provides a cell delivery platform for cardiovascular repair.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7974-7979 (2011).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+nanofibrous+sheets+of+collagen%2Felastin%2Fpolycaprolactone+improve+cardiac+repair+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Electrospun nanofibrous sheets of collagen/elastin/polycaprolactone improve cardiac repair after myocardial infarction.</a> American Journal of Translational Research. 8 (4), 1678-1694 (2016).</li>
<li>Arana, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epicardial+delivery+of+collagen+patches+with+adipose-derived+stem+cells+in+rat+and+minipig+models+of+chronic+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Epicardial delivery of collagen patches with adipose-derived stem cells in rat and minipig models of chronic myocardial infarction.</a> Biomaterials. 35 (1), 143-151 (2014).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+high+bioactivity+multilayered+bone-marrow+mesenchymal+stem+cell+sheets+for+myocardial+infarction+using+a+3D-dynamic+system%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Preparation of high bioactivity multilayered bone-marrow mesenchymal stem cell sheets for myocardial infarction using a 3D-dynamic system.</a> Acta Biomaterialia. 72, 182-195 (2018).</li>
<li>Wu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+phospholipase+A%282%29+to+prepare+acellular+porcine+corneal+stroma+as+a+tissue+engineering+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The use of phospholipase A(2) to prepare acellular porcine corneal stroma as a tissue engineering scaffold.</a> Biomaterials. 30 (21), 3513-3522 (2009).</li>
<li>Degano, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+self-assembling+peptide+nanofiber+scaffolds+on+mouse+embryonic+fibroblast+implantation+and+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The effect of self-assembling peptide nanofiber scaffolds on mouse embryonic fibroblast implantation and proliferation.</a> Biomaterials. 30 (6), 1156-1165 (2009).</li>
<li>Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+stem+cell+niches+from+the+molecule+up+through+engineered+peptide+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Building stem cell niches from the molecule up through engineered peptide materials.</a> Neuroscience Letters. 519 (2), 138-146 (2012).</li>
<li>Cui, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+Mesenchymal+Stem+Cells+with+Self-Assembling+Polypeptide+Scaffolds+Is+Conducive+to+Treating+Myocardial+Infarction+in+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Tohoku+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Transplantation of Mesenchymal Stem Cells with Self-Assembling Polypeptide Scaffolds Is Conducive to Treating Myocardial Infarction in Rats.</a> Tohoku Journal of Experimental Medicine. 222 (4), 281-289 (2010).</li>
<li>Jun, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+Assembled+Bilayer+Cell+Sheets+of+Stem+Cells+and+Endothelial+Cells+Using+Thermosensitive+Hydrogels+for+Therapeutic+Angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Spatially Assembled Bilayer Cell Sheets of Stem Cells and Endothelial Cells Using Thermosensitive Hydrogels for Therapeutic Angiogenesis.</a> Advanced Healthcare Materials. 6 (9), (2017).</li>
<li>Chen, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porous+tissue+grafts+sandwiched+with+multilayered+mesenchymal+stromal+cell+sheets+induce+tissue+regeneration+for+cardiac+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Porous tissue grafts sandwiched with multilayered mesenchymal stromal cell sheets induce tissue regeneration for cardiac repair.</a> Cardiovascular Research. 80 (1), 88-95 (2008).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit protocol rapporteert een efficiënte methode voor de bouw van een meerdere lagen MSC blad. Deze cellaag vertoont optimale mechanische sterkte, hoge celdichtheid seeding en gunstige stamcel topicale. BMSCs als een voorbeeld gebruikt, is de 3D celstructuur snel gebouwd met RAD16-ik peptide hydrogel. Na wordt gekweekt in het dynamische perfusie-systeem, het meerdere lagen BMSC blad met succes wordt verkregen en de BMSCs handhaven een hoog expressie van markeringen in een cel van de stam.
Bouw ...

Stamcel therapie werd gerapporteerd als een effectieve behandeling voor vele ziekten; lage cel retentie en arme overleven binnen de doelzone blijven echter kritieke problemen na injectie van de traditionele cel van de stam. U kunt dit probleem oplossen, ontwikkeld weefsel engineering wetenschappers de cel blad techniek. Een monolayered cellaag met intact extracellulaire matrix bereid was om te beginnen met behulp van de temperatuur-respons cultuur schotel1, en haar follow-up studies rapporteerde de significante verbeteringen van de stamcel retentie en overleven in de infarcted gebied2,3. Onder de werd bouw van de meerdere lagen cellaag gerapporteerd als een doeltreffende strategie ter verbetering van de overleving van de cel en de cel blad therapeutisch effect3,4. Sindsdien hebben wetenschappers gewerkt aan andere cel blad bouwmethoden te ontwikkelen teneinde het bedrag van de cel, stamcel eigenschap en mechanische eigenschap van de bladen van de cel. Tot nu toe, bepaalde soorten cellaag zijn gebouwd en studeerde bij de behandeling van myocardinfarct5,6van de schade van kraakbeen, en huid wond7.
De topicale van stamcellen voor transplantatie toonde een opkomende invloed op benadeelde Weefselregeneratie en andere cel blad bouw strategieën hebben verschillende effecten op de cellen van de stam. Aan de ene kant confluente cel bladen alleen bestond uit high-density stamcellen en natuurlijke extracellulaire matrices kunnen worden verworven door stapelen monolayered cel bladen8 of met behulp van magnetische weefsel engineering technieken9. Aan de andere kant, ontwikkelde onderzoekers verschillende steigers voldoende mechanische sterkte te en te ondersteunen cel groei10,11,12, waardoor een laag stamcel dichtheid om ervoor te zorgen de voeding zaaien aanbod. Echter, ondanks deze benaderingen, de lage efficiënte voeding levering binnen de meerdere lagen celstructuur blad blijft een groot probleem tijdens de bouw in vitro . Dus is een bouwsysteem van efficiënt en haalbaar cel blad dringend noodzakelijk.
Dit protocol beschrijft de stappen ter voorbereiding van de cellaag van een multilayeredmesenchymal-cel van de stam (MSC). In dit bouwsysteem, wordt het blad van de mechanische sterkte van cel verzorgd door een DPP. Op basis van deze steiger, de 3D celstructuur kan worden snel geconstrueerd met RAD16-ik peptide hydrogel, en een dynamische perfusie-systeem wordt gebruikt voor de cultuur van de meerdere lagen cellaag, om te stabiliseren van de 3D blad celstructuur en voldoende voeding aanbod voor de cellen. Met behulp van dit systeem, een meerdere lagen BMSC blad met succes werd voorbereid en een optimaal therapeutisch effect op de rat myocardiaal infarct model13tentoongesteld.

<table><tbody><tr><td>Phospholipase A2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6534</td><td></td></tr><tr><td>Sodium deoxycholate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750-100G</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffer</td><td>Gibco BRL</td><td>89033</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin streptomycin / amphotericin&nbsp;</td><td>Gibco BRL</td><td>15640055</td><td></td></tr><tr><td>Buffer bicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3041</td><td></td></tr><tr><td>Table concentrator</td><td>Changzhou Aohua Instrument Co.</td><td>KT20183</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)</td><td>Corning Cellgro</td><td>10-014-CVR</td><td></td></tr><tr><td>South American fetal bovine serum&nbsp;</td><td>Gibco BRL</td><td>10270-106/P30-3302</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-005-CI</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Trypsin/2.21 mM EDTA</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>Biosafety cabinet</td><td>Esco,Singapore</td><td>AC2-2S1</td><td></td></tr><tr><td>Constant temperature incubator&nbsp;</td><td>Esco,Singapore</td><td>CLS-170B-8</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge tube&nbsp;</td><td>Corning</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>EP tube</td><td>Axygen</td><td>31617934</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugal machine</td><td>TOMOS</td><td>1-16R&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9378-500G</td><td></td></tr><tr><td>Pura Matrix&nbsp;</td><td>BD</td><td>354250</td><td></td></tr><tr><td>Dynamic perfusion culture system</td><td>Minucells and Minutissue</td><td>D-93077</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic pump</td><td>Ismatec</td><td>IPC N8</td><td></td></tr><tr><td>Pump tubing</td><td>Ismatec</td><td>Nr.1306</td><td></td></tr><tr><td>MINUSHEET 1300&nbsp;</td><td>Regensburg</td><td></td><td>weefseldragercomponenten&nbsp;</td></tr><tr><td>MINUSHEET</td><td>Regensburg</td><td></td><td>dynamisch perfusiesysteem&nbsp;</td></tr><tr><td>MINUSHEET 0006</td><td>Regensburg</td><td></td><td>gaswisselingsapparatuur&nbsp;</td></tr><tr><td>MINUSHEET 0002</td><td>Regensburg</td><td></td><td>500 mL glazen fles&nbsp;</td></tr><tr><td>MINUSHEET 1301</td><td></td><td></td><td>perfusiecultuurcontainer&nbsp;</td></tr></tbody></table>

bouw van een meerdere lagen mesenchymale stamcellen blad met een 3d dynamische cultuur-systeem

Construction of a Multilayered Mesenchymal Stem Cell Sheet with a 3D Dynamic Culture System

Stamcel therapie toont een veelbelovende toekomst in het regenereren van de benadeelde orgel en weefsels, en de cel blad techniek is ontwikkeld ter verbetering van het lage cel retentie en de overleving van de arme binnen de doelzone. Echter tijdens het bouwproces in vitro , is een oplossing voor het behoud van de stamcel topicale en verhoging van het bedrag van de cel binnen de cellaag dringend nodig. Dit protocol presenteert hier een methode voor de bouw van een meerdere lagen cellaag met gunstige stamcel topicale en optimale bruikbaarheid. Decellularized varkens hartzakje (DPP) wordt bereid door fosfolipase een methode decellularization2 (PLA2) als de cel blad steiger en rat beenmerg mesenchymale stamcellen (BMSCs) zijn geïsoleerd en uitgebreid als de geplaatste cellen. De tijdelijke meerdere lagen blad celstructuur is gebouwd met behulp van RAD16-ik peptide hydrogel. Tot slot, de cellaag is gekweekt met een dynamische perfusie-systeem te stabiliseren van de driedimensionale (3D) structuur en de cellaag kon worden verkregen na een 48-urige cultuur in vitro. Dit protocol biedt een efficiënt en haalbaar methode voor de bouw van een vel met meerdere lagen cel van de stam en het blad van de cel kan worden ontwikkeld als een gunstige stamcel therapie product in de toekomst.

Het schema van de opbouw van meerdere lagen stamcel blad is afgebeeld in Figuur 1. Voorbereiding van de cel blad steiger door de PLA2 decellularization methode is de eerste stap. Gebaseerd op de steiger, is een tijdelijke 3D celstructuur gebouwd door het mengen van de cellen van de stam met de RAD16-1 peptide hydrogel. Het verkrijgen van een meerdere lagen cellaag met gunstige stamcel topicale en optimale mechanische sterkte, is de cellaag gekweekt...

Dit artikel biedt een efficiënt en haalbaar methode voor de opbouw van meerdere lagen stamcel bladen met de cel van de stam van de gunstige eigenschap.

Bouw van een meerdere lagen mesenchymale stamcellen blad met een 3D dynamische cultuur-systeem

Stem cell therapy shows a promising future in regenerating injured organ and tissues, and the cell sheet technique has been developed to improve the low ...

Stamceltherapie is op grote schaal gemeld als een veelbelovende behandeling voor vele ziekten. En de celbladtechnieken zijn ontwikkeld om de retentie van de cel en de overleving binnen de doelen te verbeteren. Tijdens de opbouw van celbladen blijft de ontoereikende voedingsvoorziening een belangrijk probleem voor het verlies van de functie van stamcel, en is een onbevredigende stamceleigendom die uiteindelijk de therapeutische effecten in vivo zou beïnvloeden.Ons doel om de beschikbare meerlaagse stamcelblad product voor te bereiden, ons team ontwikkelde de cellulaire gepolste polesized, pericardium en cel blad steiger. Op basis van het steiger zou de meerlaagse cellen starter snel worden gebouwd met nonapeptide Waterstof en een dynamica perfusiesysteem wordt gebruikt om de voedingsvoorziening van de stamcel in vitro te garanderen. Neem een gedroogde DBP steiger en zet het in het midden van de zwarte basis.Leg een witte spanningsring op de DBP steiger, en breng het aan in de weefseldrager. Zorg ervoor dat de DBP steiger volledig vast zit in de weefseldrager. Voeg 100 microliters cultuur mediums op de DBP steiger.Zet de steiger in de 37 graden Celsius incubator, en laat het weken voor 15 minuten. Haal de cellen uit de couveuse, verwijder de kweekmediums uit de kweekschaal, was de cellen voorzichtig met twee milliliter warme PBS. Verwijder alle PBS uit de kweekschaal en zorg ervoor dat er geen vloeistof overblijft.Voeg twee milliliter toe aan 1,25% trypsineoplossing aan de schotel en ontcubeer de cellen gedurende drie minuten. Stop het trypsin effect door het toevoegen van twee milliliter cultuur medium. Was de cellen voorzichtig uit de schaal.Breng de celsuspensies over in een nieuwe centrifugaalbuis van 15 milliliter. Centrifugate de cellen op 220 keer zwaartekracht gedurende vijf minuten, en het verkrijgen van celsedimenten. Verwijder de supernatant, en veeg de cel sediment.Schors de cellen opnieuw met drie milliliter 10%sucroseoplossing. Aspirate 10 microliter cel suspensie, en de inhoud celnummer leest een hemocytometer, extract drie miljoen cellen en overdracht in uw nieuwe 1,5 milliliter centrifugaal buis. Centrifugate de cellen op 220 keer vierkant wortel gedurende vijf minuten, volledig verwijderen van de supernatants en het verkrijgen van de cellen sediment.Bereid 20 microliter voor 10% sacharoseoplossing. Voorzichtig opnieuw op te schorten de cellen en het verkrijgen van een uniforme suspensie. Voeg 20 microliter peptide hydro gel aan de bovenkant van de suspensie voorzichtig meng de peptide hydro gel, en de cellen schorsing met de T, neem de DBP steiger, het verlaten van de weefseldrager, en dan zachtjes aspirate de calculi mediaan met een T.Aspirate het mengsel het mengsel en gelijkmatig toe te voegen aan de DBP steiger.Voeg een milliliter calciumedetaat toe aan de bodem van de weefseldrager. Voeg voorzichtig vier milliliter cultureel medium in de cultuur schotel en dan ontstaan de cel vel. Zet de cellen in de couveuse voor twee uur laat het cultuur.Het dynamische perfusiesysteem omvat een perfusiecultuurcontainer het gas dat recrement en een glasfles uitwisselt. Assembles zijn dynamische perfusiesystemen zoals de figuur wordt weergegeven. Voeg twee hydro milliliters cultuur medians in de glazen fles.Steek de celplaat in de kamer van de kweekcontainer, voeg drie milliliters cultuurmedianen in de container, zet de dynamische perfusiesystemen in de couveuses en begin te pompen. Open de kweekcontainer in de bipositieve ligfiets. Haal het celblad uit de kweekcontainer en zet het in cultuurschotel.Gebruik een tang om de weefseldrager te immobiliseren en gebruik nog eens twee tangen om de witte spanningsring van de zwarte basis te scheiden. Tot slot, verkrijg het meerlaagse celblad. DBP steiger is transparant.De SEM doorverkoopt toont aan dat hogescholen gevangen en de componenten zijn volledig gereserveerd. De celbladen kunnen door tangen voor korte bewaring worden verkregen en worden gehouden. Deze cel plaat kan worden overgebracht naar 1,5 milliliter cylindriform buis.Als model bijvoorbeeld te beginnen met celvertoningen van BMFC's zeer positief voor de stamcellen marker CD 9O en de CD 29. Na de celconstructie van de BMFC's die het celblad verlaten, blijven hoge expansieniveaus van CD 90 en de CD 29. Het bouwen van de meerlaagse celstructuur is de kritieke stap van het protocol.De pantijd vereist vier hydrogel wanneer de PH-waarde verandert van SA naar neutraal, daarom is het belangrijk om de cel te wassen met sacharoseoplossing om de oppervlakte-ionen te verwijderen. Ook de volumeverhouding van celsuspensie en panthihydrogel is geen goede vriend voor de bouw van de tijdelijke meerlaagse structuur. Na de vorming van 3D stamcelstructuur ziet u dat het dynamische perfusiesysteem belangrijk is voor het stabiliseren van de meerlaagse structuur en het handhaven van de viabiliteiten van de stamcel.De dynamische infiltratie van de cultuurmediaan zou stamcellen kunnen vergemakkelijken om celcontext binnen de meerlaagse structuur te vermenigvuldigen en te extrapoleren ook zouden de dynamische cultuurthermometers volgens verschillende stamceltypes moeten worden aangepast.

construction-multilayered-mesenchymal-stem-cell-sheet-with-3d-dynamic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

In dit protocol, tonen we de fabricage van een Microactuator reeks van verticaal verschoven berichten op de technologie gebaseerd is, en hoe deze basistechnologie kunnen worden gewijzigd om high-throughput mechanisch dynamische celkweek te voeren in zowel twee-dimensionale en drie-dimensionale cultuur paradigma's.

Microfabricated Platforms voor Mechanisch Dynamic Cel Cultuur

This video showcases the development and differentiation of human neural stem cells within a three-dimensional scaffold. A laminin coating on the scaffold promotes cell attachment, while a growth factor-free neural medium induces cell differentiation into neural progenitor cells, which extend their processes within a porous architecture in multiple directions, forming a three-dimensional...

Differentiating Human Neuronal Stem Cells into 3D Culture Using a Porous Scaffold

Voor het creëren van hoog georganiseerde structuren van complex weefsel, moet men meerdere materiaal- en celtypen samenvoegen tot een geïntegreerd composiet. Dit combinatoire ontwerp bevat orgaanspecifieke gelaagde cellagen met twee verschillende biologisch afgeleide materialen die een sterke vezelachtige matrixbasis bevatten, en endotheelcellen voor het bevorderen van de vorming van nieuwe bloedvaten.

Tissue engineering: Bouw van een Meercellige 3D Steiger voor de levering van Layered Cell Sheets

We beschrijven de fabricage van microgepatternde hydrogelvellen met behulp van een eenvoudig proces, dat kan worden geassembleerd en gemanipuleerd in een zelfstandige vorm. Met behulp van deze modulaire hydrogelvellen kan een eenvoudig macro-geschaald 3D-celkweeksysteem worden gegenereerd met een gecontroleerde cellulaire micro-omgeving.

Bouw van modulaire Hydrogel Sheets voor micropatterned Macro-schaal 3D Cellular Architecture

Engineering en analyse van dragende weefsels met heterogene celpopulaties is nog steeds een uitdaging. Hier beschrijven we een methode voor het maken van bi-gelaagde alginaat-hydrogelschijven als platform voor co-cultuur van diverse celpopulaties binnen één constructie.

Gelaagde Alginaat Constructen: Een platform voor Co-cultuur van heterogene celpopulaties

Chondrogenese uit stamcellen vereist fine tuning van de kweekomstandigheden. Hier presenteren we een magnetische aanpak voor het condenseren van cellen, een essentiële stap om chondrogenese te initiëren. Bovendien tonen wij aan dat dynamische rijping in een bioreactor zijn mechanische stimulatie van de cellulaire constructen en verbetert kraakbeenachtige extracellulaire matrix productie.

3D Magnetic Stem Cell Samenvoeging en Bioreactor rijping voor het herstel van kraakbeen

Hier presenteren we een protocol voor 3D-cultuur systemen bij het zelf monteren van peptide steigers ter bevordering van de differentiatie van dedifferentiated menselijke articulaire chondrocyten in kraakbeen-achtig weefsel.

Kweken van zoogdiercellen in driedimensionale Peptide steigers

We beschrijven een methode om apparaten te construeren voor 3D-cultuur en experimenten met cellen en multicellulaire organoids. Dit apparaat maakt analyse van cellulaire reacties op oplosbare signalen in 3D-micromilieus met gedefinieerde chemoattractant gradiënten. Organoids zijn beter dan enkele cellen bij de opsporing van zwakke luidruchtige ingangen.

3D-analyse van multi-cellulaire reacties op chemoattractant gradiënten

Hierin demonstreren we een organoïdemodel in drie stappen (tweedimensionale [2D] expansie, 2D-stimulatie, driedimensionale [3D] rijping) dat een veelbelovend hulpmiddel biedt voor fundamenteel peesonderzoek en een potentiële steigervrije methode voor peesweefselmanipulatie.

Demonstratie van zelf-geassembleerde celbladcultuur en handmatige generatie van een 3D-pees/ligament-achtige organoïde met behulp van menselijke dermale fibroblasten

Hier laten we zien hoe epitheelcellen gekweekt met fibroblasten in het nanovezelige membraangebaseerde tweelaagse systeem stabiel kunnen hechten aan en groeien op het membraan.

Het opzetten van een driedimensionale cocultuurmodule van epitheelcellen met behulp van nanovezelmembranen

Leer de constructie van meerdere lagen mesenchymale stamcellen met een 3D dynamisch cultuursysteem. Deze methode verbetert de voedingsvoorziening en behoudt stamceleigenschappen voor effectieve regeneratieve therapieën.

Bouw van een meerdere lagen mesenchymale stamcellen blad met een 3D dynamische cultuur-systeem

Meer video's verkennen