-Voor-stapmodus zuivering van macromoleculaire complexen met behulp van RNA gekoppeld aan biotine en een foto-cleavable Linker

Deze methode moet van belang zijn voor onderzoekers die proberen RNA-eiwitcomplexen te isoleren en hun samenstelling te identificeren door middel van massaspectrometrie. Wij geloven dat ons protocol vooral nuttig zal zijn voor het zuiveren van complexen die in cellen in beperkte hoeveelheden bestaan en de neiging hebben om te scheiden tijdens lange meerstapszuiveringsprocedures. Het belangrijkste voordeel van deze methode is dat het gaat om slechts een enkele zuivering stap en kan worden gebruikt met RNA bindende sites van elke lengte en volgorde.

Het aantonen van een aantal van de stappen zal Xiao-cui Yang, die een senior onderzoekstechnicus in onze groep. Voor bindingssites die aanzienlijk langer zijn dan 65 nucleotiden, verkrijgen T7 gegenereerde RNA en een adapter PCB oligonucleotide zoals beschreven in het tekstprotocol. Meng 20 picomolen van het RNA met 100 picomoles van de adapter oligonucleotide in een 1,5 milliliter buis met 100 microliter binding buffer.

Plaats de buis in kokend water en laat het 5 minuten inbroeden. Laat het water vervolgens afkoelen tot kamertemperatuur. Eerste aanvulling 1 milliliter van de muis kernextract met 80 millimolar EDTA bij pH 8 tot een uiteindelijke concentratie van 10 millimolar.

Voeg vervolgens tussen de 5 en 10 picomoles van het RNA-substraat toe dat is gelabeld met de PCB moiety. Incubeer op ijs gedurende 5 minuten, zorg ervoor dat af en toe meng het monster. Gebruik vervolgens een voorgekoelde microcentrifuge bij 4 graden Celsius om het mengsel gedurende 10 minuten op 10.000 g te centrifugeren om eventuele neerslagen te verwijderen.

Verzamel de supernatant voorzichtig in een nieuwe buis op ijs, terwijl voorzichtig is om te voorkomen dat de pellet wordt overgebracht. Breng ongeveer 100 microliter streptavidin agarose kraal suspensie over naar een buis van 1,5 milliliter. Voeg ongeveer 1 milliliter bindende buffer toe om te beginnen met het wassen van de kralen.

Centrifugeer de buis op 25 keer g gedurende 2 tot 3 minuten en aspirate de supernatant. Herhaal dit was- en centrifugatieproces 2 tot 3 keer om de kralen te equilibreren met de bindingsbuffer. Laad de eerder verzamelde supernatant, die het geassembleerde complex over de geëquilibreerde kralen bevat.

Met behulp van een buis rotator, draai de buis voor 1 uur op 4 graden Celsius om de RNA en gebonden complexen immobiliseren op de kralen. Draai vervolgens de buis op 25 keer g gedurende 2 tot 3 minuten om de kralen te verzamelen aan de onderkant van de buis. Aspirate de supernatant.

En spoel de kralen twee keer met bindende buffer, met behulp van de eerder beschreven wasproces. Na het verwijderen van de supernatant van de tweede was, voeg 1 milliliter bindende buffer en draai het monster gedurende 1 uur op 4 graden Celsius. Draai het monster 25 keer g af gedurende 2 tot 3 minuten.

Voeg vervolgens 1 milliliter bindingsbuffer toe en breng de ophanging over naar een nieuwe buis. Draai het monster maximaal 1 uur op 4 graden Celsius. Centrifugeren de geïmmobiliseerde complexen op 25 keer g gedurende 2 tot 3 minuten.

Dan aspirate supernatant, en voeg 200 microliter van bindende buffer. Breng de kralen over naar een 500 microliter buis. Zet een uv-lamp met hoge intensiteit aan die UV-licht uitzendt op 365 nanometer en laat het volledige schittering bereiken.

Vul de bodem van een petrischaaltje met strak verpakt ijs dat het over het deksel van de schotel stapelt. Kort vortex de buis met de geïmmobiliseerde complexen. Plaats het vervolgens horizontaal op het ijs en bedek het met de voorverwarmde lamp, om ervoor te zorgen dat het monster 2 tot 3 centimeter van het oppervlak van de lamp verwijderd is.

Bestraal het monster gedurende in totaal 30 minuten terwijl de buis vaak wordt omgedraaid en vortexing om een uniforme blootstelling te garanderen en oververhitting te voorkomen. Draai hierna 2 tot 3 minuten de kralen op 25 keer g en verzamel de supernatant. Centrifuge dit supernatant nogmaals onder dezelfde voorwaarden.

Verzamel de resulterende supernatant om ervoor te zorgen dat een kleine hoeveelheid aan de onderkant van de buis te verlaten om te voorkomen dat de overdracht van eventuele resterende kralen. Met behulp van SDS-PAGE elektroforese, scheiden een fractie van de UV eluted supernatant en de overeenkomstige fractie van het materiaal links op de kralen na UV-elution. Gebruik vervolgens een commercieel verkrijgde zilveren kleuringkit om de gel te bevlekken.

Evalueer de efficiëntie van UV-elutie door de intensiteit van de eiwitten die aanwezig zijn in de UV-eluted supernatant en die links op de kralen na UV-bestraling te vergelijken. Accijns de eiwit banden van belang en bepalen hun identiteit door massaspectrometrie. Daarna direct analyseren van een fractie van de UV eluted supernatant door massaspectrometrie om het volledige proteoom van het gezuiverde materiaal te bepalen op een onbevooroordeelde manier.

In deze studie wordt stamlus RNA met foto-cleavable biotine geïncubeerd met 1 milliliter cytoplasmatisch S100-extract verkregen uit muizen myeloomcellen. En het effect en de efficiëntie van UV-elutie wordt geanalyseerd door zilveren vlekken. Een aantal eiwitten worden gedetecteerd op de streptavidin kralen voor UV-elutie.

Bestraling met lange golf UV releases slechts een aantal van deze eiwitten in de supernatant waardoor een niet-specifieke achtergrond op de kralen. Dit benadrukt het belang van de UV-elutiestap. Massaspectrometrie identificeert de belangrijkste UV-eluted eiwitten als 3'hExo en SLBP met SLBP wordt vertegenwoordigd door zowel de volledige lengte eiwit en een aantal kortere afbraak producten.

Kleinere hoeveelheden andere eiwitten geïdentificeerd als verschillende RNA bindende eiwitten ook selectief vrijgegeven in oplossing door de UV-bestraling. UV-elutie van geïmmobiliseerde Drosophila histone pre-mRNA gelabeld met foto-cleavable biotine geïncubeerd met een nucleair extract resulteerde in een selectieve release van slechts een klein aantal eiwitten in de supernatant met een intense achtergrond van niet-specifieke eiwitten die overblijven op de kralen. Massaspectrometrie identificeert deze eiwitten als componenten van de U7 snRNP.

Ze worden niet gedetecteerd in aanwezigheid van verwerkingsconcurrenten die de binding van U7 snRNP blokkeren aan histone pre-mRNA. Het is belangrijk om een hoge intensiteit UV-lamp te gebruiken en plaats het een korte afstand tot het bestraalde monster, terwijl ook ervoor te zorgen dat het niet oververhit raakt. De UV-elutiemethode levert inheemse RNA-eiwitcomplexen op die grote verontreinigingen missen en direct geschikt zijn voor extra zuiveringsstappen en functionele testen.

Vermijd blootstelling aan ogen en huid tijdens UV-bestraling.