Opsporen van de Ligand-bindend domein dimerisatie activiteit van oestrogeen Receptor-Alpha met behulp van de zoogdieren twee-hybride Assay

Dus deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over het vermogen van oestrogene liganden te reguleren oestrogeen receptor alpha en de mechanismen van selectieve oestrogeen receptor modulatoren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een eenvoudige methode is. Het toont ligand-afhankelijke oestrogeen receptor alfa ligand binding domein dimerization activiteit in de cellen.

Het aantonen van de procedure zal Tanner Jefferson zijn, een postdoc student van onze groep. Deze methode maakt gebruik van drie verschillende plasmiden om de oestrogeen receptor ligand binding domein dimerization activiteit in cellen te detecteren. pG5-Luc is de luciferase reporter plasmid voor het detecteren van de werkzaamheid van dimerisatie activiteit.

pBIND muis oestrogeen receptor alpha EF is een galactose-responsieve transcriptie factor GAL4 DNA binding aan een hoofd gesmolten muis oestrogeen alpha ligand binding domein expressie plasmid dat bindt aan de GAL4 responsieve element op de pG5-Luc verslaggever. pACT muis oestrogeen receptor alpha EF is een herpes simplex virus transactivating segment eiwit VP16 activatie domein gesmolten muis oestrogeen receptor alfa ligand bindende domein expressie plasmid die niet rechtstreeks binden aan de pG5-Luc reporter. Wanneer de juiste ligand aanwezig is, de eiwitten afgeleid van de pBIND muis oestrogeen receptor alpha EF en pACT muis oestrogeen receptor alpha EF plasmiden binden via de oestrogeenreceptor alfa ligand binding domein.

De efficiëntie van de dimerisatie wordt bepaald door de luciferase activiteit. De belangrijkste stap is het beheersen van de activiteit van de pBIND muis oestrogeen receptor alpha EF afgeleid eiwit. De activiteit van pBIND-afgeleide oestrogeen receptor alfa ligand bind domein in elke ligand zonder de pACT oestrogeen receptor alpha EF plasmide moet worden geëvalueerd alvorens de ligand-afhankelijke oestrogeen receptor ligand bindende domein dimerization activiteit.

Begin met het toevoegen van de juiste plasmide combinaties in twee 1,5-milliliter microcentrifugebuizen per combinatie. Bereid de twee combinaties van het DNA-mengsel. Eerste buis bevat de pG5-Luc, pBIND-oestrogeen receptor-alpha EF, en lege pACT plasmiden.

Tweede buis bevat de pG5-Luc, pBIND-oestrogeen receptor-alpha EF, en pACT-oestrogeen receptor-alpha EF plasmiden. Om het DNA neer te halen, voeg een 1/9 van het VOLUME van het DNA-mengsel van drie molaire natriumacetaat en een 20x drie molair natriumacetaatvolume van 100% ethanol toe aan het DNA-mengsel in elke buis en vortex de buizen. Bewaar de mengsels op 20 graden Celsius 's nachts voor centrifugeren op maximale snelheid de volgende ochtend.

Gooi de supernatants weg en spoel de onzichtbare pellets opnieuw op in 120 microliters van 75% ethanol per buis, waarbij u ervoor zorgt dat dna dat aan de binnenkant van de buizen vastzit, wordt afgespoeld. Na een tweede centrifugatie onder dezelfde omstandigheden, gooi de supernatants en droog het DNA in een vacuüm concentrator gedurende 30 minuten. Voor de transfectie, was de bereide menselijke hepatocellulaire carcinoomcellen twee keer met 0,5 milliliter kamertemperatuur PBS per goed wassen en voer de cellen met 0,5 milliliter verse 37 graden Celsius fenol rood-vrije MEM aangevuld met 10%houtskool gestripte warmte-geïnactiveerd foetaald runderserum en twee millimolar L-amine glut.

Vervolgens, schort gedroogde plasmide DNA-mengsel en transfectie reagens in de juiste hoeveelheid DMEM per aantal putten in individuele 1,5-milliliter microcentrifuge buizen. Voeg een gelijk volume van transfectie reagens medium aan elke DMEM-zwevende plasmid DNA mengsel buis. Voeg na een incubatie van vijf tot tien minuten bij kamertemperatuur 25 microliters dna-mengsel toe aan de juiste experimentele putten van de 24-put menselijke hepatocellulaire carcinoomcelkweekplaat voor een zes uur durende transfectie in de celkweek incubator.

En het einde van de incubatie, vervang de transfectie medium met 0,5 milliliter verse 37 graden Celsius fenol rood-vrije MEM aangevuld met 10%houtskool-gestripte warmte-geïnactiveerde FBS, twee millimolar L-glutamine, 1%penicilline streptomycine, en ligand per goed en de cellen terug te keren naar de celcultuur incubator voor nog eens 16 tot 18 uur. De volgende ochtend, was de cellen met een milliliter PBS per put en bevestig de cellen van elke put met 100 microliters van passieve lyse buffer per goed en krachtig schudden met een vortex mixer. Bevries vervolgens de cellysates in vloeibare stikstof.

Schud op de dag van de dubbele luciferase-test de lysates op een shaker tot de plaat op kamertemperatuur is en breng 10 microliter lysaat over naar individuele putten van een 96-put witte plastic plaat. Lees vervolgens de luciferase-activiteit van elk cellysaatmonster op een microplatelezer. De behandeling van pBIND muis oestrogeen receptor alpha EF en pACT plasmiden transfected cellen met 10 nanomolar estradiol stimuleert luciferase activiteit als de oestrogeen receptor alfa ligand binding domein bevat de ligand-afhankelijke transactivatie functioneel domein, AF-2.

Een en 10-nanomolar concentraties echter, induceren luciferase activiteit in de cellen doorgeschoerd met de combinatie van pBIND en pACT muis oestrogeen receptor alpha EF plasmiden, wat wijst op de haalbaarheid van deze procedure voor de evaluatie van oestrogeen receptor alfa ligand bindende domein dimerization activiteit tot een nanomolar van estradiol behandeling. Behandeling met 4-hydroxy-tamoxifen niet uitlokken luciferase activiteit in de pBIND muis oestrogeen receptor alpha EF en pACT plasmid getransfecteerde cellen, wat suggereert dat de AF-2 functie van oestrogeen receptor alpha niet wordt geactiveerd door deze ligand. Tot 10 nanomolar concentraties echter, induceert luciferase activiteit in de cellen doorgeschat met de combinatie van pBIND en pACT muis oestrogeen receptor alpha EF plasmiden, wat suggereert dat deze procedure haalbaar is voor de evaluatie van oestrogeen receptor alfa ligand binding domein dimerization activiteit op maximaal 10 nanomolar van 4-hydroxy-tamoxifen behandeling.

De activiteit van de combinatie van pBIND en pACT muis oestrogeen receptor alpha ligand binding domein expressie plasmiden met 4-hydroxy-tamoxifen is aanzienlijk hoger dan de combinatie van pBIND en pACT menselijke oestrogeen receptor alfa ligand bindende domein expressie plasmiden. Dit geeft aan dat de 4-hydroxy-tamoxifen-afhankelijke homodimerisatie activiteit van de muis oestrogeen receptor alfa ligand binding domein is krachtiger dan de menselijke oestrogeen receptor alfa ligand bindend domein. Verder, de 4-hydroxy-tamoxifen-afhankelijke homodimerisatie activiteit van de muis oestrogeen receptor alfa ligand binding domein met een menselijk F-domein is aanzienlijk lager dan die van het wilde type muis oestrogeen receptor alpha ligand bindend domein.

In tegenstelling, de 4-hydroxy-tamoxifen-afhankelijke homodimerisatie activiteit van de menselijke oestrogeen receptor alfa ligand binding domein met een muis F domein is aanzienlijk hoger dan die van het wilde type menselijke oestrogeen receptor alfa ligand bindend domein. Dit suggereert dat de F-domein heeft een invloed op de soort-specifieke 4-hydroxy-tamoxifen-afhankelijke oestrogeen receptor alfa ligand bindende domein homodimerisatie activiteit. Tijdens een poging deze procedure, is het belangrijk om te onthouden om de basale activiteit van GAL4 DNA bindende domein gesmolten oestrogeen receptor alfa ligand bind domeinactiviteit met uw ligand te testen.

Deze activiteit moet hetzelfde zijn als de behandeling van het voertuig.