Name: Detectie van Heterodimerization van eiwit Isoforms met behulp van een in Situ nabijheid afbinding Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Leer de in situ Proximity Ligation Assay (PLA) om eiwitinteracties zoals MST1/MST2-heterodimerisatie in gefixeerde cellen te detecteren. Deze gevoelige methode visualiseert eiwitcomplexen zonder transgene expressie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken het hele Chernoff laboratorium voor het bijdragen tot de optimalisatie en validatie van dit protocol, met name Maria Radu en Galina Semenova. Wij danken ook Andrey Efimov van de cel Imaging faciliteit op Fox Chase Cancer Center. Dit werk werd gesteund door een subsidie van de NIH (R01 CA148805) naar JC.

1. bereiding van de oplossingen
<ol><li>Bereid kleefpoeders oplossing: 4% paraformaldehyde (PFA) in 1 x PBS. Neem voor 10 mL, 2,5 mL van 16% PFA en voeg 7,5 mL 1 x PBS. Risico's: PFA is kankerverwekkend zijn bij lage doseringen. Rook en contact met de huid zijn gevaarlijk. Winkel bij-20 ° C.</li>
	<li>Bereid permeabilization oplossing: 0,1% Triton X-100 in 1 x PBS. Voeg 100 µL van Triton X-100 in 100 mL 1 x PBS voor 100 mL van de oplossing. Bewaren bij kamertemperatuur (RT).</li>
	<li>Bereiden was Buffer: 1 x TBST. Voor 1 liter, neem 100 mL 10 x TBS, 890 dH2O mL en 10 mL van tween-20 (10%).</li>
	<li>Bereid blokkerende oplossing zoals geleverd door kit. U kunt ook gebruik 1 x PBS oplossing met 2% BSA.</li>
	<li>De antilichaam-verdunningsmiddel bereiden zoals geleverd door kit. U kunt ook gebruik 1 x PBS oplossing met 1% BSA.</li>
</ol>2. de beplating van cellen
Opmerking: In deze studie gebruikten we vereeuwigd menselijke Schwann cellen (iHSC) en menselijke embryonale 293 van de nier cellen (HEK 293); Deze methode kan echter worden gebruikt voor vele soorten Adherente cellen.
<ol><li>Cultuur HEK 293 in DMEM aangevuld met 10% FBS, 0.2% Glucose, 2 mM L-Glutamine, 100 U/mL penicilline G en 100 µg/mL streptomycine op Weefselkweek behandeld platen bij 37 ° C in 5% CO,2. IHSC in 10% FBS/DMEM aangevuld met Pen/Strep en 2 µM forskolin handhaven. Routinematig testen cellen voor mycoplasma. Geen cel lijn verificatie werd uitgevoerd.</li>
	<li>Jas van een dia 16-well kamer met 50 µL van 10 µg/mL natuurlijke muis laminin of 0,01% poly-L-lysine oplossing en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C in 5% CO2. Hiermee splitst u cellen met behulp van 0,04% trypsine-EDTA.</li>
	<li>Plaat iHSC en HEK-293 in 100 µL van medium aan 80% samenvloeiing (15.000-25.000 cellen per putje).</li>
	<li>Incubeer de cellen voor 12-24 uur bij 37 ° C in een bevochtigde, 5% CO2 incubator.</li>
</ol>3. fixatie en Permeabilization
<ol><li>Verwijder het medium van de putten en wassen met 100 µL van 1 x PBS. Gecombineerd met een micropipet tot een minimum beperken van het risico van het verwijderen van het monster.</li>
	<li>Fix cellen door 50 µL van 4% PFA per goed en incubeer gedurende 10 min op RT, zonder agitatie toe te voegen. Cellen zijn gevoelig voor detachement, dus vermijd pipetteren de oplossingen direct op de cellen.</li>
	<li>Wassen van de cellen met 0,05% TBST drie keer voor elke 5 min. Gecombineerd met een micropipet tot een minimum beperken van het risico van het verwijderen van het monster.</li>
	<li>De cellen met permeabilization oplossing (0,1% Triton x-100 in 1 x PBS) behandelen gedurende 10 minuten zonder agitatie op RT.</li>
	<li>Wassen van cellen met TBST driemaal voor 5 min met agitatie.</li>
</ol>4. blokkeren
<ol><li>Tik op uit de TBST (heel voorzichtig met een micropipet). Visualiseren van de dia in een microscoop te zien als cellen aangesloten blijven.</li>
	<li>Voeg één druppel (50-60 µL) 1 x blokkeren oplossing aan elk monster.</li>
	<li>Verwarm op een kamer (lege tip doos met water) van de vochtigheid bij 37 ° C en Incubeer de dia's in het gedurende 1 uur bij 37 ° C.</li>
</ol>5. primaire antilichamen
<ol><li>Verdun de primaire antilichamen (1:100) in het antilichaam verdunningsmiddel (Zie Tabel van materialen). Bereid 40 antilichaam-oplossing van µL per putje.</li>
	<li>Blokkerende oplossing uit dia's verwijderen door te onttrekken uit de vloeistof. Niet toestaan cellen te drogen.</li>
	<li>Vortex en 40 µL van de antilichaam-oplossingen toe te voegen aan elk putje.</li>
	<li>Incubeer 1 uur bij 37 ° C in een voorverwarmde vochtigheid kamer.</li>
</ol>6. nabijheid afbinding Assay sondes
Opmerking: PLA sondes worden geleverd als onderdeel van een kit (Zie Tabel van materialen). De keus aan sondes zal afhangen van de soorten primaire antilichamen gebruikt om te ontdekken de proteïnen van belang.
<ol><li>De twee PLA sondes (anti-muis MINUS en anti-konijn PLUS) verdunnen 1:5 in het antilichaam verdunningsmiddel. Voor elk monster, 40 µL van PLA sonde te bereiden. Incubeer het mengsel gedurende 20 minuten op RT.</li>
	<li>Tik op uit de primair antilichaam-oplossing van de dia's. Wassen van de dia's tweemaal voor elke 5 min met wassen Buffer op RT.</li>
	<li>Zachtjes Tik op van de Buffer van de was uit de dia's en breng de verdunningsmiddel PLA sonde oplossing in putjes (40 µL per putje).</li>
	<li>Incubeer de dia's in een voorverwarmde vochtigheid kamer voor 1 uur bij 37 ° C.</li>
</ol>7. afbinding
Opmerking: De in situ Detection reagentia Red, Ligase en Afbinding oplossing worden geleverd als onderdeel van een kit (Zie Tabel van materialen).
<ol><li>Gebruik de in situ Detection reagentia Red.</li>
	<li>Onmiddellijk vóór gebruik, vortex en de vereiste omvang van de 5 x afbinding voorraad 1:5 in zuiver water verdunnen. Opmerking: Bewaar niet verdunde reagentia.</li>
	<li>Tik op uit de PLA sonde oplossing van de dia's. Wassen van de dia's in 1 x wassen Buffer tweemaal voor elke 5 min op RT.</li>
	<li>Onmiddellijk vóór toevoeging aan de monsters, vortex en Ligase toe te voegen aan de afbinding oplossing om 1:40 verdunning en vortex opnieuw.</li>
	<li>Tik op uit de Buffer van de was uit de dia's en de afbinding/Ligase-oplossing toevoegen aan elk putje (40 µL per putje).</li>
	<li>Incubeer de dia's in een voorverwarmde vochtigheid kamer gedurende 30 minuten bij 37 ° C.</li>
</ol>8. de versterking
Opmerking: De versterking voorraad worden verstrekt als onderdeel van een kit (Zie Tabel van materialen). Reagentia zijn licht gevoelig; dus Vermijd blootstelling van de dia's aan het licht.
<ol><li>Vortex en Verdun de vereiste hoeveelheden de 5 x amplificatie voorraad 1:5 in zuiver water en meng.</li>
	<li>Tik op uit de afbinding/Ligase oplossing van de dia's. Wassen van de dia's in 1 x wassen Buffer tweemaal voor elke 2 min op RT.</li>
	<li>Vortex en de polymerase opnieuw toevoegen aan de oplossing van de versterking op 1:80 verdunning en vortex.</li>
	<li>Tik op uit was Buffer van de dia's en de versterking/Polymerase-oplossing toevoegen aan elk putje (40 µL per putje). Incubeer de dia's in een voorverwarmde vochtigheid kamer voor 100 min bij 37 ° C.</li>
</ol>9. voorbereiding voor Imaging
Opmerking: Dit zijn lichte gevoelige reagentia. Houd de dia's beschermd tegen licht.
<ol><li>Tik op uit de versterking-Polymerase-oplossing van de dia's en wassen tweemaal voor 10 min elke in 1 x wassen Buffer op RT.</li>
	<li>De kamers en de siliconen rond de putten van de dia volledig verwijderen. Schraap de resterende bits van siliconen met een scheermes. Tekent een raster op de dia scheiden van elk goed.</li>
	<li>Voeg ~ 40 µL van het medium van de montage met DAPI. Wees voorzichtig om te voorkomen dat overvullen luchtbellen onder de slip van de cover. De randen van de cover slip kunnen worden verzegeld met nagellak.</li>
	<li>Wacht minstens 20 min voordat het uitvoeren van de analyse van de afbeelding met behulp van een confocal microscoop. Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd.</li>
	<li>Na imaging, opslaan van de dia's op-20 ° C in het donker.</li>
</ol>

<ol><li>Zhou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nore1B%2FMst1+complex+restrains+antigen+receptor-induced+proliferation+of+na%C3%AFve+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The Nore1B/Mst1 complex restrains antigen receptor-induced proliferation of naïve T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (51), 20321-20326 (2008).</li>
<li>Praskova, M., Xia, F., Avruch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MOBKL1A%2FMOBKL1B+phosphorylation+by+MST1+and+MST2+inhibits+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">MOBKL1A/MOBKL1B phosphorylation by MST1 and MST2 inhibits cell proliferation.</a> Current Biology. 18 (5), 311-321 (2008).</li>
<li>Dan, I., Watanabe, N. M., Kusumi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ste20+group+kinases+as+regulators+of+MAP+kinase+cascades%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The Ste20 group kinases as regulators of MAP kinase cascades.</a> Trends in Cell Biology. 11 (5), 220-230 (2001).</li>
<li>Rawat, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H-ras+Inhibits+the+Hippo+Pathway+by+Promoting+Mst1%2FMst2Heterodimerization%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">H-ras Inhibits the Hippo Pathway by Promoting Mst1/Mst2Heterodimerization.</a> Current Biology. 26 (12), 1556-1563 (2016).</li>
<li>Creasy, C. L., Ambrose, D. M., Chernoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ste20-like+protein+kinase%2C+Mst1%2C+dimerizes+and+contains+an+inhibitory+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The Ste20-like protein kinase, Mst1, dimerizes and contains an inhibitory domain.</a> Journal of Biological Chemistry. 271 (35), 21049-21053 (1996).</li>
<li>Buntru, A., Trepte, P., Klockmeier, K., Schnoegl, S., Wanker, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+Approaches+Toward+Quantitative+Mapping+of+the+Interactome%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Current Approaches Toward Quantitative Mapping of the Interactome.</a> Frontiers in Genetics. 74 (7), (2016).</li>
<li>Greenwood, C., Ruff, D., Kirvell, S., Johnson, G., Dhillon, H. S., Bustin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximity+assays+for+sensitive+quantification+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecular+Detection+and+Quantification%22%5BJournal%5D)">Proximity assays for sensitive quantification of proteins.</a> Biomolecular Detection and Quantification. 4, 10-16 (2015).</li>
<li>Fredriksson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+detection+using+proximity-dependent+DNA+ligation+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays.</a> Nature Biotechnology. 20 (5), 473-477 (2002).</li>
<li>Leuchowius, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+visualization+of+multiple+protein+complexes+in+individual+cells+in+tumor+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Parallel visualization of multiple protein complexes in individual cells in tumor tissue.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 12 (6), 1563-1571 (2013).</li>
<li>Söderberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

We vonden het nuttig te gebruiken glas kamer dia's voor dit experiment, zoals het is erg handig voor het uitvoeren van experiment met verschillende cellijnen van (14-16) en er is geen behoefte om te veranderen van de steekproef telkens tijdens de microscopie analyse. Een paar complicaties voordoen, zoals een verhoogd risico op kruisbesmetting met antilichamen. Wij stellen daarom voor elke goed wassen individueel in plaats van met behulp van een Coplin pot, ondanks de toegenomen duur van het experiment. Daarnaast zijn de ...

Verstoring van het MST1/Hippo signalering is verbonden met ontwikkelingsstoornissen en carcinogenese1. Bij zoogdieren, activeren de kinases MST1 en MST2 (phosphorylate) MOB1 en LATS1/2, de laatste kinaseenzym en inactiveert de transcriptionele co activator ja-geassocieerde proteïne (YAP)2. In zijn actieve vorm (unphosphorylated) heeft YAP oncogene activiteit, verbetering van de transcriptie van cel proliferatie genen; omgekeerd, wanneer YAP wordt geïnactiveerd door het traject van Hippo, celproliferatie wordt onderdrukt en apoptosis bevorderd3. In de weefsels, MST1 en MST2 bestaan voornamelijk als actieve homodimers, maar oncogene prikkels kunnen verhogen van MST1/MST2 heterodimers, en dergelijke heterodimers zijn inactief4. Het blijft echter slecht begrepen hoe MST1/MST2 heterodimerization wordt geregeld. Zowel homo- als heterodimers zijn gemedieerde via interacties tussen C-terminal spiraalsnoer-spoel regio's MST1 en MST2, bekend als SARAH domeinen5. Met behulp van een in situ PLA aangetoond in dit artikel tonen we de aanwezigheid van MST1/MST2 heterodimers in menselijke Schwann cellen (HSC) en menselijke embryonale nier cellen (HEK-293). PLA heeft een voordeel ten opzichte van andere proteïne/eiwit interactie detectiemethoden, omdat het mogelijk maakt het opsporen van endogene eiwit-eiwitinteractie, die kunnen worden geïdentificeerd en gekwantificeerd zonder de noodzaak van transgenic meningsuiting of het gebruik van epitoop tags 6.
Transductie signaalroutes worden grotendeels bepaald door de voorwaardelijke associatie van component eiwitten. Bijvoorbeeld, leidt stimulatie van de meeste receptor tyrosine kinases tot hun homo - of hetero-dimerisatie en latere vereniging met extra intracellulaire signalering eiwitten, die zelf vorm verder complexen. Het doel van de PLA-methode is om te visualiseren van de afstand tussen de eiwitten in cellen, mits de eiwitten minder dan 30-40 nm uit elkaar zijn. De nabijheid van het eiwit is meestal gedetecteerd door eerste het broeden van de cellen met passende primaire antilichamen groeide op in verschillende soorten (bv., konijn en muis) tegen elke interactie eiwit, vervolgens toe te voegen soortspecifieke secundaire antilichamen, vooraf gekoppelde naar kort DNA-sondes. Als de DNA-sondes in de nabijheid zijn, kunt gelijktijdig een specifieke oligonucleotide voor koppelen DNA binden, zowel van deze sondes, vorming van een platform voor amplificatie door in situ PCR of door het walsen van cirkel mechanisme. Fluorescerende tags toegevoegd aan de amplificatie reactie kun visualisatie van de interacterende eiwitten, die als tl stippen die gemakkelijk kunnen worden gekwantificeerd en gelokaliseerd op bepaalde regio's in de cel7,8 verschijnen,, 9 , 10.

```html
<table><tbody><tr><td>Chamber slides</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>178599</td><td>16 well, glass slide</td></tr><tr><td>PLA probe Anti-Mouse Minus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO92004</td><td>Bevat 1x Blokkingsoplossing, 1x antilichaam Diluent</td></tr><tr><td>PLA Probe Anti-Rabbit PLUS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO92002</td><td>Bevat 1x Blokkingsoplossing, 1x antilichaam Diluent</td></tr><tr><td>Wash Buffers, Fluorescerend</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82049</td><td>Bevat Wash Buffer A en Wash Buffer B</td></tr><tr><td>Montage Medium met DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82040</td><td></td></tr><tr><td>Detectie Reagentia Rood</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO92008</td><td>Bevat 5x Ligatie, 1x Ligase, 5x Amplifikation Rood, 1x Polymerase</td></tr><tr><td>p44/42 MAPK (Erk1/2) Antilichaam</td><td>Cell Signaling</td><td>9102s</td><td></td></tr><tr><td>Phospho-p44/42 MAPK (Erk1) (Tyr204)/(Erk2) (Tyr187)</td><td>Cell Signaling</td><td>5726s</td><td>pERK antilichaam</td></tr><tr><td>MST2 antilichaam</td><td>Cell Signaling</td><td>3952s</td><td></td></tr><tr><td>Krs-2 (RJ-5)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-100449</td><td>MST1 antilichaam</td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyde</td><td>Electron microscopy sciences</td><td>15710</td><td>Verdun tot 4% PFA in PBS voor fixeeroplossing</td></tr><tr><td>Triton x100</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP 151-500</td><td>Om 0,1% Triton x-100 in 1xPBS voor Permeabilisatie oplossing te bereiden</td></tr><tr><td>Confocale microscopie</td><td>Leica TCS SP8, 63x</td><td></td><td>Beeldanalyse met ImageJ software</td></tr></tbody></table>
```

detectie van heterodimerization van eiwit isoforms met behulp van een in situ nabijheid afbinding assay

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Gereglementeerde eiwit-eiwitinteractie zijn een leidend beginsel voor veel signalering gebeurtenissen, en de opsporing van dergelijke evenementen is een belangrijk element in het begrip van hoe dergelijke trajecten zijn georganiseerd en hoe zij functioneren. Er zijn vele methoden voor de opsporing van eiwit-eiwitinteractie in cellen, maar relatief weinig kunnen worden gebruikt voor het detecteren van interactie tussen endogene eiwitten. Een dergelijke methode, de nabijheid van afbinding assay (PLA), heeft verschillende voordelen aan het gebruik ervan. Vergeleken met andere gemeenschappelijke analysemethoden eiwit-eiwit interactie, PLA heeft relatief hoge gevoeligheid en specificiteit, met minimale cel manipulatie, en, in het protocol hierin beschreven kan worden uitgevoerd, slechts twee doelgroepen gerichte requires antistoffen afkomstig van verschillende soorten (bv., van muis en konijn) en één gespecialiseerde reagens: een aantal secundaire antilichamen die covalent gekoppeld aan specifieke oligonucleotides dat toen bracht in de nabijheid van elkaar, maken een amplifiable platform voor in situ PCR of rollende cirkel versterking. In deze presentatie tonen we hoe toe te passen op de PLA-techniek om wijzigingen in de nabijheid van de MST1 en MST2 in vaste cellen zichtbaar maken. De techniek wordt beschreven in dit manuscript is met name van toepassing voor de analyse van cel signalering van studies.

We gebruikten de PLA-assay voor het testen van de interactie tussen MST1 en MST2 in HEK-293 en iHSC. De cellen waren vaste permeabel en gekleurd met verschillende antilichamen, gevolgd door in situ versterking volgens het PLA-protocol (Figuur 1). Om het document op het niveau van de MST1/MST2 heterodimerization, werden cellen gekleurd met MST1 en MST2 antilichamen (figuur 1Aen 1 C, 1 G). Als positieve co...

Hier, laten we zien hoe een nabijheid afbinding Assay (PLA) gebruiken om te visualiseren van MST1/MST2 heterodimerization in vaste cellen met hoge gevoeligheid.

Detectie van Heterodimerization van eiwit Isoforms met behulp van een in Situ nabijheid afbinding Assay

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

De in situ Proximity Ligation Assay of PLA, is een technologie die in staat is om interacties tussen eiwitten, aangebracht weefsel en cellen te detecteren. De associaties tussen eiwitten kunnen worden geïdentificeerd en gekwantificeerd zonder de noodzaak van transgene expressie of extra techs. De enige vereiste is de beschikbaarheid van specifieke hoog-efficiënte antilichamen die met DNA oligonucleotiden kunnen worden gewijzigd.In weefsels MST1 en MST2 bestaan voornamelijk als actieve homodimeren, maar oncogene stimuli kunnen het niveau van MST1 MST2 heterodimeren verhogen en dergelijke heterodimeren zijn inactief. Na incubatie met specifieke primerantilichamen tegen de proteïnen van belang worden speciale specifieke secundaire antilichamen, elk gekoppeld aan een unieke, korte, gratis DNA-streng die eraan verbonden is, toegevoegd aan de sleuf om zich aan de primaire antilichamen te binden. Als de eiwitten in vragen heterodimerized zijn, zullen zowel de primaire antilichamen als de secundaire antilichamen die eraan verbonden zijn in de nabijheid zijn.In deze toestand kunnen de bijgevoegde DNA-strengen op de tweede antilichamen interageren door een volgende toevoeging van twee andere cirkelvormende DNA-oligonucleotiden. Enkele honderdvoudige replicatie van de DNA-cirkel kan optreden na een versterkingsreactie en een fluorescentiesignaal wordt gegenereerd door genivelleerde gratis oligonucleotidesondes. Daarom wordt elk gedetecteerd signaal gevisualiseerd als een individuele fluorescerende stip die kan worden toegewezen aan een specifieke subcellulaire locatie op basis van microscoopbeelden.Op de dag voor het experiment, jas 16 goed kamers dia's door het toevoegen van 50 tot 100 microliter van muis laminine of poly-L-lysine en incubbaat bij 37 graden Celsius. Na 30 minuten koude oplossing te verwijderen, split de cellen met trypsine en plaat 15, 000 tot 25.000 cellen per goed in 16 goed chambered dia. Incubeercellen bij 37 graden Celsius in een bevochtigde 5%koolstofdioxide incubator gedurende 24 uur.Na 24 uur, verwijder het medium uit de putten en was de cellen voorzichtig met PBS. Gebruik een micropipet om het nemen van risico's van het monster te minimaliseren en vervolgens de PBS aan te trekken en cellen te fixeren door 50 microliter van 4% PFA per put toe te voegen en gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur zonder agitatie uit te broeden. Pipette de oplossing niet rechtstreeks op de cellen, omdat dat kan leiden tot onthechting van de cellen.Na de fixatie, was de cellen met TBST drie keer gedurende vijf minuten elk met milde agitatie. Volgende permeabiliseren van de cellen en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur zonder agitatie. Nadat de permeabilisatie is voltooid, was de cellen met TBST drie keer gedurende vijf minuten per wasbeurt met agitatie.Na het verwijderen van TBST voeg een druppel van de blokkering oplossing in elke put en uitbroeden de dia's in een voorverwarmde vochtigheidskamer voor een uur op 37 graden Celsius. Verdun primaire antilichamen. Verwijder de blokkeringsoplossing met behulp van een micropipet, maar laat glijbanen niet drogen.Vortex en voeg 40 microliter van de verdunde antilichaamoplossing toe aan de juiste putten en broed de monsters bij 37 graden Celsius gedurende een uur in een voorverwarmde vochtigheidskamer. Verdun tijdens de incubatie de twee PLA-sondes in antilichaamverdunningsmiddel. Bereid voor elk monster 40 microliter PLA-sonde voor.Na een uur incubatie, aspiraat de antilichaam oplossing en was glijbanen twee keer gedurende vijf minuten met TBST bij kamertemperatuur. Verwijder voorzichtig de TBST van de dia's en voeg 40 microliter van de PLA sonde oplossing aan elke put. Broed de glijbanen in een voorverwarmde vochtigheidskamer gedurende een uur bij 37 graden Celsius.Vortex en verdun de vereiste volumes van de ligatievoorraad 1 tot 5 in hoog zuiverheidswater vlak voor gebruik. Voor elke put is 40 microliter van de ligatieoplossing nodig. Na de incubatie, verwijder PLA oplossing van de dia's en was ze twee keer in TBST gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur met agitatie.Gebruik een vriesblok bij het verwijderen van ligase uit de vriezer en net voor het toevoegen aan de cellen, vortex en verdun het met de ligatie oplossing. Verwijder de TBST uit de dia's en voeg 40 microliters van de ligatie ligase oplossing aan elke put. Incubeer glijdt in een voorverwarmde vochtigheidskamer gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius.Na de incubatie de oplossing aanzuigen en twee keer wassen met TBST gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur met agitatie. Vermijd het blootstellen van de put aan fel licht als de reagentia zijn lichtgevoelig. Tijdens de laatste wasbeurt, vortex en verdunnen de eis volumes van versterking oplossing in hoge zuiverheid water onmiddellijk voor gebruik.Houd de polymerase op ijs of in een koelblok en net voordat u het toevoegt aan de vortex van de cellen en verdunt u met de versterkingsoplossing. Aspirate de TBST uit de putten en voeg 40 microliters van versterking oplossing aan elke put. Incubeer glijdt in een donkere voorverwarmde vochtigheidskamer gedurende 100 minuten bij 37 graden Celsius.Na de incubatie, aspiraat de versterking polymerase oplossing van de dia's en was twee keer tien minuten elk in TBST bij kamertemperatuur. Verwijder de kamers en siliconen rond de putten volledig van de glijbaan. Schraap de resterende kralen van siliconen af met een scheermes.Teken een raster op de dia die elke put scheidt. Voeg ongeveer 40 microliters van het montagemedium toe met DAPI, zodat er geen luchtbellen onder de deklip komen te zitten. Gebruik nagellak om het afdekglas te repareren.Microscopische analyse kan worden uitgevoerd in 20 minuten na fixatie, maar in de praktijk vinden we het het meest handig om beeldanalyse uit te voeren de volgende dag. Om de monsters te analyseren, gebruiken we een Leica SP8 configureren laser scanning microscoop. Hier zijn voorbeelden van in situ nabijheid ligatie test visualiseren nabijheid tussen MST 1 en MST2 eiwitten in menselijke embryonale niercellen in panelen A tot en met D, en Human Schwann cellen in panelen E door H.In alle panelen celkernen zijn blauw gekleurd door DAPI en rode stippen geven positieve nabijheid ligatie ligatie assay signalen als gevolg van nabijheid tussen de aangegeven eiwitten.Paneel A toont de nabijheid van MST1 en MST2 en paneel B toont de nabijheid van ERK en fosfoERK als deze epitopen zijn op hetzelfde eiwit. Paneel C vertegenwoordigt een negatieve controle omdat deze cellen zoals MST1 en MST2 en paneel D een tweede negatieve controle met antilichamen voor MST1 en ERK vertegenwoordigen die naar verwachting niet in de nabijheid van elkaar zullen zijn. Panelen E en F tonen de nabijheid van MST1 met MST2 en ERK met fosfoERK in Schwann cellen.Panel G en H zijn negatieve controles die alleen zijn gekleurd met MST1-antilichamen of met MST1- en ERK-antilichamen. Het is absoluut noodzakelijk om niet-reactieve primaire antilichamen te gebruiken dat het slechts één lid van heterodimer zou moeten erkennen. Ook is het belangrijk om te onthouden om verschillende tips te gebruiken om kruisbesmetting van primaire antilichamen en PLA-sondes te voorkomen, om te voorkomen dat de bodem van de put wordt aangeraakt en om te voorkomen dat u rechtstreeks op monsters pipet.Na het bekijken van deze video moet je een goed begrip van hoe te gebruiken in situ PLA om eiwit dimerization studie in vaste cellen.

detection-heterodimerization-protein-isoforms-using-an-situ-proximity

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Hier laten we zien hoe Proximity Ligatie Assay (PLA), te gebruiken met een combinatie van antilichamen tegen botmorfogenetisch Protein (BMP) signalering in vaste cellen te visualiseren. Deze techniek liet ons toe om de nucleaire accumulatie van endogene BMP geactiveerde effector-complexen te volgen en hun niveaus loop van de tijd te kwantificeren onder BMP4 stimulatie.

Detectie van Signalering Effector-Complexen Stroomafwaarts van BMP4 gebruik In situ PLA, een Proximity Ligatie Assay

This video describes the proximity ligation assay to study in situ protein-protein interactions in nematode cells. The close proximity of the proteins of interest generates the circular DNA template with the help of a PLA probe attached to a secondary antibody. The probe is further amplified using the amplification solution, which produces a long single-stranded DNA followed by the hybridization of the detector probe, enabling the localization of protein-protein interactions in cells.

Proximity Ligation Assay to Study In Situ Protein-Protein Interactions

Dit protocol toont hoe Proximity Ligatie Assay kunnen worden toegepast voor aantonen in situ eiwit-eiwit interacties bij de Drosophila larven neuromusculaire junctie. Met deze techniek worden Schijven grote en Hu-li tai Shao aangetoond dat een complex in het postsynaptische gebied, een associatie eerder geïdentificeerd door middel co-immunoprecipitatie vormen.

Detectie van In Situ Eiwit-eiwit complexen in de Drosophila Larvale Neuromusculaire Junction Met behulp van Proximity ligatiebepaling

Hier beschrijven we een werkwijze voor het visualiseren en kwantificeren gevoeligheid een endogene interacties tussen het endoplasmatisch reticulum en mitochondria in gefixeerde cellen. Het protocol is voorzien van een geoptimaliseerde in situ nabijheid ligation assay gericht op de inositol 1,4,5-trifosfaat receptor / glucose-gereguleerd eiwit 75 / voltage-afhankelijke anion kanaal / cyclofiline D-complex aan de mitochondria bijbehorende membraan interface.

Studie van endoplasmatisch reticulum en mitochondriën interacties door<em&gt; In Situ</em&gt; Proximity Ligatie Assay in gefixeerde cellen

Eiwit-eiwit interacties kunnen zowel in de kern als in het cytoplasma van een cel optreden. Om deze interacties te onderzoeken, worden traditionele co-immunoprecipitatie en moderne proximity ligatie-assay toegepast. In deze studie vergelijken we deze twee methoden om de verdeling van NF90-RBM3 interacties in de kern en het cytoplasma te visualiseren.

Visualisatie van eiwit-eiwit interacties in nucleaire en cytoplasmatische fracties door Co-immunoprecipitatie en<em&gt; In Situ</em&gt; Proximity Ligatie Assay

Hier wordt aangetoond hoe de in situ Proximity Ligation Assay (PLA) kan worden gebruikt om de directe eiwit-eiwit interacties tussen ATM en p53 te detecteren en visualiseren in suspensiecellen die blootgesteld zijn aan genotoxische stress.

Detectie en visualisatie van DNA-schade-geïnduceerde eiwitcomplexen in suspensiecellenculturen met behulp van de proximity-liggingsassay

Hier presenteren we een protocol voor het controleren van de montage en demontage van de toxine van de bloedzweer met behulp van biolayer interferometrie (BLI). Na montage/demontage op de biosensor oppervlak, de grote eiwitcomplexen worden vrijgegeven uit het oppervlak voor visualisatie en identificatie van onderdelen van de complexen met behulp van elektronenmicroscopie en massaspectrometrie, respectievelijk.

Analyseren van de dynamische eiwitcomplexen op gemonteerd en vrijgelaten uit Biolayer interferometrie Biosensor met behulp van spectrometrie van de massa en elektronenmicroscopie

Dit protocol beschrijft een kalibratie-vrije aanpak voor het kwantificeren van eiwit homo-oligomerisatie in vitro op basis van fluctuatiemarges Fluorescentiespectroscopie met behulp van commerciële licht scanning microscopie. De juiste overname-instellingen en de analysemethoden worden weergegeven.

Kalibratie-gratis In Vitro kwantificering van eiwit Homo-oligomerisatie met behulp van commerciële instrumentatie en Software van de analyse van de helderheid van gratis, Open Source

Cognate J-Domain eiwitten werken samen met de Hsp70 chaperonne om te helpen bij een groot aantal biologische processen, variërend van eiwit vouwen tot afbraak. Hier beschrijven we een in-situ proximity ligatie test, die het mogelijk maakt om deze transitieve gevormde chaperonne machinerie in bacteriële, gist en menselijke cellen te monitoren.

In situ monitoring van transitieve gevormde moleculaire Chaperone-assemblages in bacteriën, gist en menselijke cellen

Dit protocol toont het gebruik van de nabijheidsligatietest om te sonde voor eiwit-eiwitinteracties in situ in de C. elegans kiembaan.

In Situ Detectie van Ribonucleoprotein Complex Assembly in de C. elegans Germline met behulp van Proximity Ligation Assay

De D-loop capture (DLC) en D-loop extension (DLE) assays maken gebruik van het principe van proximity ligatie samen met kwantitatieve PCR om D-loopvorming, D-loop extensie en productvorming te kwantificeren op de plaats van een induceerbare dubbelstrengs breuk in Saccharomyces cerevisiae.

Detectie van homologe recombinatietussenproducten via nabijheidsligatie en kwantitatieve PCR in saccharomyces cerevisiae

Leer de in situ Proximity Ligation Assay (PLA) om eiwitinteracties zoals MST1/MST2-heterodimerisatie in gefixeerde cellen te detecteren. Deze gevoelige methode visualiseert eiwitcomplexen zonder transgene expressie.

Detectie van Heterodimerization van eiwit Isoforms met behulp van een in Situ nabijheid afbinding Assay

Meer video's verkennen