Detectie van Heterodimerization van eiwit Isoforms met behulp van een in Situ nabijheid afbinding Assay

De in situ Proximity Ligation Assay of PLA, is een technologie die in staat is om interacties tussen eiwitten, aangebracht weefsel en cellen te detecteren. De associaties tussen eiwitten kunnen worden geïdentificeerd en gekwantificeerd zonder de noodzaak van transgene expressie of extra techs. De enige vereiste is de beschikbaarheid van specifieke hoog-efficiënte antilichamen die met DNA oligonucleotiden kunnen worden gewijzigd.

In weefsels MST1 en MST2 bestaan voornamelijk als actieve homodimeren, maar oncogene stimuli kunnen het niveau van MST1 MST2 heterodimeren verhogen en dergelijke heterodimeren zijn inactief. Na incubatie met specifieke primerantilichamen tegen de proteïnen van belang worden speciale specifieke secundaire antilichamen, elk gekoppeld aan een unieke, korte, gratis DNA-streng die eraan verbonden is, toegevoegd aan de sleuf om zich aan de primaire antilichamen te binden. Als de eiwitten in vragen heterodimerized zijn, zullen zowel de primaire antilichamen als de secundaire antilichamen die eraan verbonden zijn in de nabijheid zijn.

In deze toestand kunnen de bijgevoegde DNA-strengen op de tweede antilichamen interageren door een volgende toevoeging van twee andere cirkelvormende DNA-oligonucleotiden. Enkele honderdvoudige replicatie van de DNA-cirkel kan optreden na een versterkingsreactie en een fluorescentiesignaal wordt gegenereerd door genivelleerde gratis oligonucleotidesondes. Daarom wordt elk gedetecteerd signaal gevisualiseerd als een individuele fluorescerende stip die kan worden toegewezen aan een specifieke subcellulaire locatie op basis van microscoopbeelden.

Op de dag voor het experiment, jas 16 goed kamers dia's door het toevoegen van 50 tot 100 microliter van muis laminine of poly-L-lysine en incubbaat bij 37 graden Celsius. Na 30 minuten koude oplossing te verwijderen, split de cellen met trypsine en plaat 15, 000 tot 25.000 cellen per goed in 16 goed chambered dia. Incubeercellen bij 37 graden Celsius in een bevochtigde 5%koolstofdioxide incubator gedurende 24 uur.

Na 24 uur, verwijder het medium uit de putten en was de cellen voorzichtig met PBS. Gebruik een micropipet om het nemen van risico's van het monster te minimaliseren en vervolgens de PBS aan te trekken en cellen te fixeren door 50 microliter van 4% PFA per put toe te voegen en gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur zonder agitatie uit te broeden. Pipette de oplossing niet rechtstreeks op de cellen, omdat dat kan leiden tot onthechting van de cellen.

Na de fixatie, was de cellen met TBST drie keer gedurende vijf minuten elk met milde agitatie. Volgende permeabiliseren van de cellen en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur zonder agitatie. Nadat de permeabilisatie is voltooid, was de cellen met TBST drie keer gedurende vijf minuten per wasbeurt met agitatie.

Na het verwijderen van TBST voeg een druppel van de blokkering oplossing in elke put en uitbroeden de dia's in een voorverwarmde vochtigheidskamer voor een uur op 37 graden Celsius. Verdun primaire antilichamen. Verwijder de blokkeringsoplossing met behulp van een micropipet, maar laat glijbanen niet drogen.

Vortex en voeg 40 microliter van de verdunde antilichaamoplossing toe aan de juiste putten en broed de monsters bij 37 graden Celsius gedurende een uur in een voorverwarmde vochtigheidskamer. Verdun tijdens de incubatie de twee PLA-sondes in antilichaamverdunningsmiddel. Bereid voor elk monster 40 microliter PLA-sonde voor.

Na een uur incubatie, aspiraat de antilichaam oplossing en was glijbanen twee keer gedurende vijf minuten met TBST bij kamertemperatuur. Verwijder voorzichtig de TBST van de dia's en voeg 40 microliter van de PLA sonde oplossing aan elke put. Broed de glijbanen in een voorverwarmde vochtigheidskamer gedurende een uur bij 37 graden Celsius.

Vortex en verdun de vereiste volumes van de ligatievoorraad 1 tot 5 in hoog zuiverheidswater vlak voor gebruik. Voor elke put is 40 microliter van de ligatieoplossing nodig. Na de incubatie, verwijder PLA oplossing van de dia's en was ze twee keer in TBST gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur met agitatie.

Gebruik een vriesblok bij het verwijderen van ligase uit de vriezer en net voor het toevoegen aan de cellen, vortex en verdun het met de ligatie oplossing. Verwijder de TBST uit de dia's en voeg 40 microliters van de ligatie ligase oplossing aan elke put. Incubeer glijdt in een voorverwarmde vochtigheidskamer gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius.

Na de incubatie de oplossing aanzuigen en twee keer wassen met TBST gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur met agitatie. Vermijd het blootstellen van de put aan fel licht als de reagentia zijn lichtgevoelig. Tijdens de laatste wasbeurt, vortex en verdunnen de eis volumes van versterking oplossing in hoge zuiverheid water onmiddellijk voor gebruik.

Houd de polymerase op ijs of in een koelblok en net voordat u het toevoegt aan de vortex van de cellen en verdunt u met de versterkingsoplossing. Aspirate de TBST uit de putten en voeg 40 microliters van versterking oplossing aan elke put. Incubeer glijdt in een donkere voorverwarmde vochtigheidskamer gedurende 100 minuten bij 37 graden Celsius.

Na de incubatie, aspiraat de versterking polymerase oplossing van de dia's en was twee keer tien minuten elk in TBST bij kamertemperatuur. Verwijder de kamers en siliconen rond de putten volledig van de glijbaan. Schraap de resterende kralen van siliconen af met een scheermes.

Teken een raster op de dia die elke put scheidt. Voeg ongeveer 40 microliters van het montagemedium toe met DAPI, zodat er geen luchtbellen onder de deklip komen te zitten. Gebruik nagellak om het afdekglas te repareren.

Microscopische analyse kan worden uitgevoerd in 20 minuten na fixatie, maar in de praktijk vinden we het het meest handig om beeldanalyse uit te voeren de volgende dag. Om de monsters te analyseren, gebruiken we een Leica SP8 configureren laser scanning microscoop. Hier zijn voorbeelden van in situ nabijheid ligatie test visualiseren nabijheid tussen MST 1 en MST2 eiwitten in menselijke embryonale niercellen in panelen A tot en met D, en Human Schwann cellen in panelen E door H.In alle panelen celkernen zijn blauw gekleurd door DAPI en rode stippen geven positieve nabijheid ligatie ligatie assay signalen als gevolg van nabijheid tussen de aangegeven eiwitten.

Paneel A toont de nabijheid van MST1 en MST2 en paneel B toont de nabijheid van ERK en fosfoERK als deze epitopen zijn op hetzelfde eiwit. Paneel C vertegenwoordigt een negatieve controle omdat deze cellen zoals MST1 en MST2 en paneel D een tweede negatieve controle met antilichamen voor MST1 en ERK vertegenwoordigen die naar verwachting niet in de nabijheid van elkaar zullen zijn. Panelen E en F tonen de nabijheid van MST1 met MST2 en ERK met fosfoERK in Schwann cellen.

Panel G en H zijn negatieve controles die alleen zijn gekleurd met MST1-antilichamen of met MST1- en ERK-antilichamen. Het is absoluut noodzakelijk om niet-reactieve primaire antilichamen te gebruiken dat het slechts één lid van heterodimer zou moeten erkennen. Ook is het belangrijk om te onthouden om verschillende tips te gebruiken om kruisbesmetting van primaire antilichamen en PLA-sondes te voorkomen, om te voorkomen dat de bodem van de put wordt aangeraakt en om te voorkomen dat u rechtstreeks op monsters pipet.

Na het bekijken van deze video moet je een goed begrip van hoe te gebruiken in situ PLA om eiwit dimerization studie in vaste cellen.