Gevalideerde immunochemische test voor uitgebreide bepaling van de humane epidermale groeifactorreceptor 2 die vrijkomt uit en gebonden is aan cellen

We presenteren een gevalideerde sandwich, ELISA, met behulp van nieuwe monoklonale antilichamen, die een nauwkeurige kwantificering mogelijk maakt van het celgebonden en vrijgegeven extracellulaire domein van HER2-eiwit voor in vitro gekweekte cellen en patiëntmonsters.

Het protocol komt tegemoet aan de behoefte aan nauwkeurige en gevalideerde testen om de concentratie van circulerend HER2-eiwit te correleren met klinische manifestaties van de ziekte in diagnostiek en onderzoek.

Het brede werkbereik van de test, de verscheidenheid aan monstertypes en de betrouwbaarheid van de resultaten kunnen nieuwe mogelijkheden bieden voor een uitgebreide analyse van de receptorstatus in in vitro en in vivo modellen.

De ontwikkelde ELISA zal worden gebruikt voor de kwantificering van HER2 dat vrijkomt uit kankerweefsels in verschillende uitscheidingen van het menselijk lichaam, zoals bloed, peritoneale vloeistoffen of slijm.

[Docent] Om te beginnen, koppelt u de cellen los met trypsine nadat ze 80% confluentie hebben bereikt en verzamelt u ze in een afzonderlijke conische buis van 15 milliliter. Na het tellen van de cellen met behulp van een automatische cellenteller en zaad drie keer 10 tot de macht van vijf cellen per putje in een plaat met 12 putjes met één milliliter groeimedium. Incubeer de cultuur bij 37 graden Celsius in een bevochtigde atmosfeer met 5% koolstofdioxide. Verzamel van de 24-uurs kweek het kweekmedium uit één putje van elke cellijn in een buisje van 1,5 milliliter. Centrifugeer de verzamelde monsters bij 10.000 G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius en breng het bovenstaande over in een nieuwe buis voor opslag bij min 20 graden Celsius. Was de resterende cellen in elk putje met een milliliter koude PBS, aspireer voorzichtig en gooi de PBS weg. Voeg vervolgens 200 microliter RIPA-buffer, aangevuld met 1% proteaseremmer toe aan elk putje en incubeer gedurende vijf minuten. Schraap nu de cellen met een celschraper en meng het lysaat door meerdere keren te pipetteren om te homogeniseren. Verzamel de gelyseerde cellen in een nieuwe buis en zuig het monster langzaam op in een spuit van twee milliliter die is uitgerust met een naald van 21 gauge van 0,8 bij 40 millimeter. Na vijf tot 10 keer te hebben opgezogen, centrifugeert u de verzamelde monsters gedurende 10 minuten bij 10.000 G bij vier graden Celsius en brengt u het bovenstaande over in een nieuwe buis voor opslag bij min 20 graden Celsius. Verdun het Anti-HER2-opvangende antilichaam tot één microgram per milliliter in de coderingsbuffer. Voeg met behulp van een meerkanaalspipet 100 microliter van de opvangantilichaamoplossing toe aan elk putje van een ELISA-plaat met 96 putjes. Dek de plaat af met afdichtfolie. Incubeer de plaat een nacht bij vier graden Celsius. Plaats de plaat na een nacht incubatie gedurende een uur bij kamertemperatuur op een horizontale microplaatschudder. Zuig met behulp van een microplaatwasser de coatingoplossing op en was elk putje drie keer met 300 microliter PBST. Voeg vervolgens met een meerkanaalspipet 100 microliter blokkeerbuffer met 5% magere droge melk in PBS toe aan elke gecoate put om niet-specifieke bindingsplaatsen te blokkeren. Bereid nu de kalibratiecurve en positieve controle voor. Voeg twee microliter van één milligram per milliliter, HER2-voorraadoplossing toe aan 1.998 microliter PBS om een standaard werkende 1000 nanogram per milliliter te creëren. Voeg voor standaard twee 500 microliter standaard één toe aan 500 microliter PBS en meng grondig om een concentratie van 50 nanogram per milliliter te bereiken. Bereid seriële verdunning voor om standaarden drie tot en met zeven te genereren. Bereid vervolgens matrixmonsters voor met behulp van PBS-cellysaten en kweekmedium verrijkt met bekende HER2-concentraties. Verdunde cellysaten één tot 2000 met 2,5 microliter lysaat en vijf milliliter PBS om HER2-niveaus onder de detectielimiet te verkrijgen. Om een oplossing van twee nanogram per milliliter te bereiden, voegt u acht microliter standaard één toe aan 392 microliter PBS-kweekmedium of cellysaat en mengt u grondig. Voeg met behulp van een enkelkanaalspipet 100 microliter standaard PBS-blanco toe en testmonsters elk in drievoud in hun respectievelijke putjes van de gecoate en geblokkeerde ELISA-plaat. Was de plaat na een uur op 37 graden Celsius in een vochtigheidskamer met een microplatenwasser. Om antilichaambinding te detecteren, verdunt u het gebiotinyleerde detectieantilichaam in PBS tot een werkconcentratie van één microgram per milliliter. Voeg vervolgens met behulp van een meerkanaalspipet 100 microliter van deze detecterende antilichaamoplossing toe aan elk putje. Verdun vervolgens de AVID en HRP conjugatie één tot 40.000 in 40 milliliter PBST. Voeg met behulp van een meerkanaalspipet 100 microliter van het verdunde conjugaat toe aan elk putje. Gebruik na het incuberen en wassen van de plaat een meerkanaalspipet om 100 microliter 3,3 5,5 tetramethylbenzidinesubstraat aan elk putje toe te voegen om de metrische kleurreactie op gang te brengen. Dek de plaat vervolgens af met een afdichtingsfolie. Incubeer de plaat gedurende één tot vijf minuten bij 37 graden Celsius, bescherm hem tegen licht en houd de kleurontwikkeling in de gaten. Wanneer de gewenste kleurintensiteit is bereikt, voegt u 100 microliter stopoplossing toe aan elk putje om de reactie te beëindigen. Meet ten slotte de extinctie bij 450 nanometer met behulp van een microplaatlezer. Bereken met behulp van een kalibratiecurve met vier parameters de monsterconcentratie op basis van de curvevergelijking. De ontwikkelde sandwich, ELISA, demonstreerde een werkbereik voor HER2-eiwit van 1,56 tot 100 nanogram per milliliter met een bepalingscoëfficiënt van één die een uitstekende afstemming aangeeft. De HER2-concentratie in het kweekmedium nam in de loop van de tijd toe voor alle geteste cellijnen met de hoogste waarden na 72 uur. SK-OV-3- en SK-BR-3-cellen vertoonden respectievelijk ongeveer tien keer en 50 keer hogere HER2-concentraties in vergelijking met MDA-MB-231-cellen in het kweekmedium na 24 uur. Evenzo waren de HER2-niveaus in lysaten ongeveer drievoudig en vijfvoudig hoger voor respectievelijk SK-OV-3 en SK-BR-3. Interessant is dat het celkweekmedium 1000 keer lagere concentraties van het geteste antigeen bevatte in vergelijking met membraangebonden eiwit dat in hele cellysaten wordt aangetroffen.