Twee-foton beeldvorming van Microglial processen attractie naar ATP of serotonine in Acute hersenen plakjes

Om een microgliale fenotype volledig te karakteriseren, is het belangrijk om zowel basale als directionele beweeglijkheid aan te pakken. Dit protocol kan worden gebruikt om de directionele beweeglijkheid van microglia te testen door twee-foton beeldvorming in muizen hersenen plakjes, met behulp van aangepaste 3D-print interface en perfusie kamers. Het aantonen van de procedure zal Fanny Etienne, een promovendus, en Vincenzo Mastriolia, een post-doctorale onderzoeker, zowel uit onze laboratoria.

Ten minste 30 minuten voor de dissectie, beginnen borrelen 70 milliliter choline kunstmatige hersenvocht, of choline aCSF, op ijs. Voeg 150 milliliter choline aCSF toe bij 32 graden Celsius, met carbogen. Plaats een 200 milliliter kristalliseren schotel met een bar magneet in een verzegelde voedseldoos en voeg 200 milliliter van aCSF aan de schotel.

Plaats een 3D-geprinte interface slice houder op de top van de schotel en verwijder overtollig vocht uit de kristalliserende schotel, totdat slechts een dunne film van oplossing die het gaas van de interface schuifhouder blijft. Voeg een paar millimeter aCSF aan de onderkant van de voedseldoos en begin borrelen de vloeistof met carbogen. Sluit vervolgens de verzegelde doos met behoud van constante carbogenation om een bevochtigde, 95% zuurstof, 5% kooldioxide-rijke interface kamer te creëren.

Na het oogsten, plaats de hersenen op een stuk van aCSF-geweekt filter papier en ontleden uit het gebied van belang, volgens de gewenste hoek van het snijden. Voor coronale plakjes, positie en lijm de staart gezicht van de hersenen op een 10 centimeter Petri schotel bevestigd aan het snijblok van een trillende snijmachine, en plaats het blok in het reservoir kamer van de vibrerende snijmachine in een grote kamer gevuld met ijs. Vul de schotel met ijskoude choline aCSF en gebruik de snijmachine om 300 micrometer dikke hersenplakjes te verkrijgen, met behulp van een vier millimeter diameter wegwerp overdracht pipet na elke pas van het blad om elk plakje te verzamelen.

Laat elk segment herstellen in de 32 graden Celsius choline aCSF voor ongeveer 10 minuten nadat het is verkregen, alvorens de plakjes op stukken van de lens schoonmaken papier, gegarneerd met een druppel choline aCSF. Aspirate dan de overtollige choline aCSF en gebruik een spatel om de plakjes over te dragen op het net van de interface kamer, waardoor de plakjes te herstellen in deze omgeving voor ten minste 30 minuten. Sluit 30 minuten voor aanvang van de opname de peristaltische pomp aan op een aangepaste opnamekamer met boven- en bodemperfusie voor het optimaliseren van de oxygenatie en levensvatbaarheid van de weefselschijven en reinig het hele perfusiesysteem met 50 milliliter ultrazuiver water.

Aan het einde van de reinigingscyclus start u de perfusie van de opnamekamer met 50 milliliter aCSF in een glazen beker onder constante carbogenatie, en gebruik een wegwerppijppijp van de wijdmondoverdracht om het eerste plak dat op het bekerglas moet worden afgebeeld, over te brengen om het lenspapier te verwijderen. Wanneer de sectie naar de onderkant van het bekerglas is gezonken, breng je de sectie over naar de opnamekamer en plaats je de slicehouder op het segment om de beweging die door de perfusiestroom wordt veroorzaakt te minimaliseren. Gebruik bright-field verlichting om het hersengebied van belang onder een vijf tot 10x vergroting te richten.

Gebruik vervolgens een 25x-doelstelling met een 0,35x wateronderdompelingslens om de positie van het kijkveld aan te passen. Gebruik fluorescentieverlichting om de fluorescerende microgliale cellen te lokaliseren en vul de pipet bij met 10 microliter van aCSF die de verbinding van belang bij de uiteindelijke concentratie bevat. Richt de punt naar beneden met zachte schudden om eventuele luchtbellen gevangen in de tip te verwijderen en monteer de gevulde pipet in een pipet houder aangesloten op een vijf milliliter spuit met de zuiger geplaatst op de vijf milliliter positie en gemonteerd op een drie-assige micromanipulator.

Laat de pipet voorzichtig naar het plakje zakken, controleert en past het doel tegelijkertijd aan, totdat de pipettepunt het oppervlak van het segment licht raakt. Stem nu de laser af en schakel de microscoop over naar de multiphoton-modus. Zorg ervoor dat de kamer wordt gescreend van een lichtbron en schakel de niet-gescande detectoren in.

Stel de versterking in en gebruik een opzoektabel met een bovengrens met kleurcode om te voorkomen dat de pixels in de afbeelding verzadigen. Dan, beginnen met het opnemen voor een totale duur van ten minste 30 minuten, langzaam deprimerend van de spuit zuiger van de vijf tot een milliliter positie, na vijf minuten, over een periode van vijf seconden, om de verbinding toe te passen op de sectie. Voor beeldanalyse voert u eerst z-projectie- en driftcorrectie uit met ImageJ in het dossier van belang.

Open vervolgens het gewijzigde bestand in Icy en teken een cirkelvormig gebied met een diameter van 35 micrometer, gecentreerd over de injectieplaats. Voer de film opnieuw met de ROI, om ervoor te zorgen dat het goed gepositioneerd is. Gebruik vervolgens de regio van de evolutie van de rente-intensiteit om de gemiddelde intensiteit in de tijd in het gebied van belang te meten en de resultaten op te slaan als een xls-bestand.

Dit protocol maakt het mogelijk de reacties veroorzaakt door verschillende verbindingen, zoals ATP of serotonine, worden gemeten. Hoewel de injectie van ATP een toename van fluorescentie uitlokt, is er na de meeste ATP-injecties een onmiddellijke, lichte afname van fluorescentie als gevolg van weefselvervorming die na een paar minuten terugkomt. De grootte van het gebied van belang heeft ook invloed op de kwantificering, omdat het verhogen van de diameter de variabiliteit tussen de experimenten vermindert, maar de nauwkeurigheid en omvang van de gedetecteerde respons vermindert.

Beoordeling van de microgliale respons op een specifiek tijdstip kan nuttig zijn voor de statistische vergelijking van verschillende verbindingen, of om de effecten van specifieke antagonisten toegevoegd aan de perfusieoplossing te testen. Om de beweeglijkheid in drie dimensies te kwantificeren, weet u dat u mogelijk het z-stapinterval en de bemonsteringssnelheid van de acquisitie moet wijzigen om binnen de analysevereisten te voldoen.