Name: Sperma collectie van differentiële kwaliteit met behulp van dichtheid kleurovergang centrifugeren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 28 s
Description: Leer dichtheidsgradiëntcentrifugatie voor spermafysiologieonderzoek. Deze methode scheidt sperma in drie kwaliteitslagen en helpt bij het bestuderen van vruchtbaarheidsbiomarkers.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van de Universiteit van Georgia.
1. wassen met behulp van traditionele centrifugeren
<ol><li>Bereiden fosfaatbuffer (PBS). Toevoegen van 8,0 g NaCl, KCl, 1,44 g nb2HPO4 en 0,24 g van KH2PO4 tot 800 mL gedestilleerd water (dH2van O) 0.2 g. Breng de pH op 7.4 met behulp van 0,1 N HCl en breng de oplossing aan 1 L met behulp van dH2O.</li>
	<li>Motility buffer voor te bereiden. Voeg 6,5 g NaCl, 4.5 g van glucose, 0.444 g CaCl2 en 11,5 g N - tris-[hydroxymethyl] methyl-2-amino-ethanesulfonic acid (TES) tot 800 mL dH2O. Breng de pH op 7.4 met behulp van de 1 M NaOH en breng de oplossing aan 1 L met behulp van dH2O.</li>
	<li>Pipetteer 0,5 mL sperma in een polypropyleen microcentrifuge buis. Voeg 1,0 mL PBS en meng voorzichtig.</li>
	<li>Centrifugeer bij 1.500 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (RT) en verwijder het supernatant. Resuspendeer de pellet sperma met PBS tot 1,5 mL.</li>
	<li>Centrifugeer bij 1.500 x g gedurende 10 min op RT. resuspendeer de zaadcellen met motiliteit pellet buffer tot 0,5 mL.</li>
</ol>2. uitvoeren van de PDGC-techniek
Opmerking: Voer het hele proces van PDGC bij kamertemperatuur.
<ol><li>Breng 3,0 mL 1,08 g/mL en 1,07 g/mL Percoll oplossingen in twee afzonderlijke buizen.<ol>
<li>Voeg 1.712 mL 1.13 g/mL in een schone reageerbuis, oorspronkelijke Percoll tot 0,3 mL van 1,5 M NaCl-oplossing. Voeg 0.988 milliliters dH2O en meng door zachte inversie 3,0 mL een 1,08 g/mL dichtheid om oplossing te maken.</li>
		<li>Voeg 1.482 mL 1.13 g/mL in een schone reageerbuis, oorspronkelijke Percoll tot 0,3 mL van 1,5 M NaCl-oplossing. Voeg 1.218 milliliters dH2O en meng door zachte inversie 3,0 mL een 1,07 g/mL dichtheid om oplossing te maken.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verdun in een schone reageerbuis, 1,0 mL sperma monster 1:2 met 2,0 mL PBS. Meng zachtjes door pipetteren.</li>
	<li>Pipetteer 3,0 mL van de oplossing van de dichtheid 1,07 g/mL in een steriele 15 mL conische buis. Zorgvuldig Pipetteer 3,0 mL van de oplossing van de dichtheid 1,08 g/mL onder de oplossing van de dichtheid 1,07 g/mL. Ervoor zorgen dat de twee lagen niet vermengen. Een lange vorm (9 inch) Pipet van Pasteur kunt gemakkelijker deze stap.</li>
	<li>Pipetteer 3,0 mL verdunde sperma overtreffen de PDG. Om ervoor te zorgen dat het sperma monster niet mengen met de PDG, zachtjes de conische buis met de PDG onder een hoek van 45° te kantelen. Pipetteer van de monster langs de wand van de buis en laat ze vloeien in de buis en over de PDG.</li>
	<li>Een lege buis aan de massa van de PDG met overlay monster voor te bereiden. Beide buizen bij 1500 x g centrifugeren voor 20 min. Wees voorzichtig om de discontinue verloop tijdens het overzetten van de buizen van de Bank naar het evenwicht en vervolgens naar de centrifuge. Opmerking: Gebruik niet de rem aan het eind van centrifugeren.
</li>
	<li>Bekijk het resultaat. Zorg ervoor dat de drie afzonderlijke sperma lagen hebben gevormd in de buis, zoals te zien in Figuur 1.</li>
	<li>Gecombineerd geïsoleerde sperma lagen met een pipet. De bovenste laag van sperma eerst verzamelen, het midden tweede laag, en last van de harde pellet aan de onderkant van de buis. Elk aan een schoon en steriel polypropyleenmicrocentrifuge buis.
</li>
	<li>Verdun elk monster tot 1,5 mL met PBS. Centrifugeer bij 1500 x g gedurende 10 minuten.</li>
	<li>Giet af het supernatant. Sperma pellet met motiliteit buffer door zachte pipetteren reconstrueren. Opmerking: Alternatieve dichtheden mogen worden gebruikt om de behoeften van de onderzoeker. Bepalen hoeveelheid ingrediënten gebruikt met de volgende vergelijking, waarbij v0 volume van voorraad dichtheid oplossing gebruikt, v is eindvolume van oplossing wensen, p is de dichtheid van de dichtheid van de definitieve oplossing wensen en p0 is de dichtheid van de voorraad dichtheid oplossing: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58833/58833eq1.jpg"> Gebruik altijd 0.3 mL 1.5 M NaCl in voorbereiding van dichtheid oplossingen ter vervanging van de concentratie van NaCl van fysiologische zoutoplossing.</li>
</ol>3. bepaling van de kwaliteit van het sperma
<ol><li>Bereken dat de concentratie sperma22zoals hiervoor is beschreven.</li>
	<li>Voer eosine-Nigrosine vitale kleuring als eerder beschreven12 met de volgende wijzigingen:<ol>
<li>Bereiden 100 µL van sperma oplossing bij een concentratie van 1 x 108 cellen/mL.</li>
		<li>Pipetteer 50 µL van sperma oplossing in een buis van de polypropyleen microcentrifuge met een gelijke hoeveelheid eosine-Nigrosine vlek. Laat het mengsel gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur inwerken.</li>
		<li>Plaats een 20 µL drop van gebeitst spermastaaltje aan het ene uiteinde van een glasplaatje en uitstrijkje gelijkmatig in een manier die vergelijkbaar is met die welke gebruikt voor bloed uitstrijkjes. Luchtdroog de vlekkerig dia's bij kamertemperatuur gedurende 3-5 minuten.</li>
		<li>Observeer de uitstrijkjes onder een microscoop. Tellen van het aantal levende zaadcellen (geen vlek) en dode zaadcellen (roze gekleurd) en bereken het percentage van levende zaadcellen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Het uitvoeren van de bepaling van de Accudenz, zoals eerder is gevalideerd voor het sperma van de kip, objectief beoordelen de sperma mobiliteit8 met de volgende wijzigingen:<ol>
<li>Pipetteer 1,0 mL van 6% assay oplossing in polystyreen cuvettes, zoals geïllustreerd in Figuur 2. Incubeer tot 41 ° C. Opmerking: 41 ° C wordt gebruikt om te voldoen aan de inwendige temperatuur van een duivin. De incubatietemperatuur moet overeenkomen met die van het vrouwelijke voortplantingssysteem van de soorten onderzocht.</li>
		<li>Bedekken de voorverwarmde assay-oplossing met 100 µL van het sperma monster bij een concentratie van 5 x 108 cellen/mL.</li>
		<li>Plaats de cuvette bevat bedekt spermastaaltje in de spectrofotometer. Opnemen van de waarde van de extinctie bij 550 nm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>IPVL-penetratie test uitvoeren als eerder beschreven11 met de volgende wijzigingen:<ol>
<li>Knip een stukje (0,5 x 0,5 cm) niet-germinal disc regio intact IPVL.</li>
		<li>Aanpassen van sperma concentratie tot 4 x 106 cellen/mL</li>
		<li>Incubeer sperma in de motiliteit buffer met IPVL in een kleine glazen flesje gedurende 15 minuten bij 37 ° C, zoals geïllustreerd in Figuur 3.</li>
		<li>Dompel het stuk van de IPVL in 3% NaCl om te stoppen met de interactie tussen de IPVL en sperma.</li>
		<li>Het IPVL stuk monteren op een microscoopglaasje en de vlek met Schiff van reagens voor 10 min na fixatie met 10% formaline voor 20 s.</li>
		<li>Observeren van de IPVL onder een Microscoop voor succesvolle sperma penetratie gaten en Tel het aantal alle zichtbare gaten per 0,25 mm2 bij 40 X vergroting.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Spargo, S. C., Hope, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+and+nomenclature+of+the+zona+pellucida+gene+family%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Evolution and nomenclature of the zona pellucida gene family.</a> Biology Reproduction. 68, 358-362 (2003).</li>
<li>Okamura, F., Nishiyama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+passage+of+spermatozoa+through+the+vitelline+membrane+in+the+domestic+fowl%2C+Gallus+gallus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">The passage of spermatozoa through the vitelline membrane in the domestic fowl, Gallus gallus.</a> Cell and Tissue Research. 188 (3), 497-508 (1978).</li>
<li>Henkel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+function+and+assisted+reproduction+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Sperm function and assisted reproduction technology.</a> Reproductive Medicine and Biology. 4, 7-30 (2005).</li>
<li>Reddy, R. P. Artificial Insemination of broilers: Economic and management implications. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aReddy%2C+RP+%22Proceedings+of+1st+International+Symposium+on+Artificial+Insemination+of+Poultry.+Poultry+Science+Association%22">Proceedings of 1st International Symposium on Artificial Insemination of Poultry. Poultry Science Association</a>. Bakst, M. R., Wishart, G. J. , Savoy, Il. 73-89 (1995).</li>
<li>Howarth, B. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Examination+for+Sperm+Capacitation+in+the+Fowl%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">An Examination for Sperm Capacitation in the Fowl.</a> Biology of Reproduction. 3, 338-341 (1971).</li>
<li>Menkveld, R., Holleboom, C. A. G., Rhemrev, J. P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+and+significance+of+sperm+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+Journal+of+Andrology%22%5BJournal%5D)">Measurement and significance of sperm morphology.</a> Asian Journal of Andrology. 13, 59-68 (2011).</li>
<li>Kumaresan, A., Johannisson, A., Al-Essawe, E. M., Morrell, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+viability%2C+reactive+oxygen+species%2C+and+DNA+fragmentation+index+combined+can+discriminate+between+above-+and+below-average+fertility+bulls%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dairy+Science%22%5BJournal%5D)">Sperm viability, reactive oxygen species, and DNA fragmentation index combined can discriminate between above- and below-average fertility bulls.</a> Journal of Dairy Science. 100, 5824-5836 (2017).</li>
<li>Froman, D. P., McLean, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Objective+measurement+of+sperm+motility+based+upon+sperm+penetration+of+Accudenz%5BTitle%5D)+AND+%22Poultry+Science%22%5BJournal%5D)">Objective measurement of sperm motility based upon sperm penetration of Accudenz.</a> Poultry Science. 75, 776-784 (1996).</li>
<li>Zaneveld, L. J., De Jonge, C. J., Anderson, R. A., Mack, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+sperm+capacitation+and+the+acrosome+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Human sperm capacitation and the acrosome reaction.</a> Human Reproduction. 6 (9), 1265-1274 (1991).</li>
<li>Ahammad, M. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acrosome+reaction+of+fowl+sperm%3A+Evidence+for+shedding+of+acrosomal+cap+in+intact+form+to+release+acrosomal+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Poultry+Science%22%5BJournal%5D)">Acrosome reaction of fowl sperm: Evidence for shedding of acrosomal cap in intact form to release acrosomal enzyme.</a> Poultry Science. 92 (3), 798-803 (2013).</li>
<li>Ahammad, M. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturational+changes+in+motility%2C+acrosomal+proteolytic+activity%2C+and+penetrability+of+the+inner+perivitelline+layer+of+fowl+sperm%2C+during+their+passage+through+the+male+genital+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Maturational changes in motility, acrosomal proteolytic activity, and penetrability of the inner perivitelline layer of fowl sperm, during their passage through the male genital tract.</a> Theriogenology. 76 (6), 1100-1109 (2011).</li>
<li>Chalah, T., Brillard, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+assessment+of+fowl+sperm+viability+by+eosin-nigrosin+and+dual+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Comparison of assessment of fowl sperm viability by eosin-nigrosin and dual fluorescence.</a> Theriogenology. 50 (3), 487-493 (1998).</li>
<li>Aitken, R. J., West, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+relationship+between+reactive+oxygen+species+production+and+leukocyte+infiltration+in+fractions+of+human+semen+separated+on+Percoll+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Andrology%22%5BJournal%5D)">Analysis of the relationship between reactive oxygen species production and leukocyte infiltration in fractions of human semen separated on Percoll gradients.</a> International Journal of Andrology. 13, 433-451 (1990).</li>
<li>Mortimer, D., Mortimer, S. T. Density Gradient Separation of Sperm for Artificial Insemination. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMortimer%2C+D+%22Spermatogenesis.+Methods+in+Molecular+Biology+%28Methods+and+Protocols%22">Spermatogenesis. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols</a>. Carrell, D., Aston, K. , Humana Press. Totowa, NJ, USA. 927(2013).</li>
<li>Qingling, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+semen+by+density+gradient+centrifugation+selects+spermatozoa+with+longer+telomeres+for+assisted+reproduction+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+BioMedicine+Online%22%5BJournal%5D)">Processing of semen by density gradient centrifugation selects spermatozoa with longer telomeres for assisted reproduction techniques.</a> Reproductive BioMedicine Online. 31, 44-50 (2015).</li>
<li>Moohan, J. M., Lindsay, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spermatozoa+selected+by+a+discontinuous+Percoll+density+gradient+exhibit+better+motion+characteristics%2C+more+hyperactivation%2C+and+longer+survival+than+direct+swim-up%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Spermatozoa selected by a discontinuous Percoll density gradient exhibit better motion characteristics, more hyperactivation, and longer survival than direct swim-up.</a> Fertility and Sterility. 64 (1), 160-165 (1995).</li>
<li>Paulson, J. D., Polakoski, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+glass+wool+column+procedure+for+removing+extraneous+material+from+human+ejaculate%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">A glass wool column procedure for removing extraneous material from human ejaculate.</a> Fertility and Sterility. 28, 178-181 (1977).</li>
<li>Ahammad, M. U., Chiaki, N., Tatemoto, H., Kawamoto, Y., Nakada, T. Utilization of the swim-up migration sedimentation technique to separate viable and progressively motile fowl spermatozoa. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAhammad%2C+MU+%22World%27s+Poultry+Science+Association+Proceedings%22">World's Poultry Science Association Proceedings</a>. , Cambridge University Press. (2010).</li>
<li>Lucena, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+motile+sperm+using+the+migration-sedimentation+technique+in+an+in+vitro+fertilization-embryo+transfer+programme%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Recovery of motile sperm using the migration-sedimentation technique in an in vitro fertilization-embryo transfer programme.</a> Human Reproduction. 4 (2), 163-165 (1989).</li>
<li>Henkel, R. Sperm Processing for IVF. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHenkel%2C+R+%22Clinical+Embryology%3A+A+Practical+Guide%22">Clinical Embryology: A Practical Guide</a>. , Springer Science and Business Media. New York, USA. (2013).</li>
<li>Sherman, J., Paulson, D., Liu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+glass+wool+filtration+on+ultrastructure+of+human+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Effect of glass wool filtration on ultrastructure of human spermatozoa.</a> Fertility and Sterility. 36, 643-647 (1981).</li>
<li>Freund, M., Carol, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+haemocytometer+counts+of+sperm+concentration+in+human+semen%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Reproduction+and+Fertility%22%5BJournal%5D)">Factors affecting haemocytometer counts of sperm concentration in human semen.</a> Journal of Reproduction and Fertility. 8, 149-155 (1964).</li>
<li>Bakst, M. R., Wishart, G. J., Brillard, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oviducal+sperm+selection%2C+transport+and+storage+in+poultry%5BTitle%5D)+AND+%22Poultry+Science+Review%22%5BJournal%5D)">Oviducal sperm selection, transport and storage in poultry.</a> Poultry Science Review. 5, 117-143 (1994).</li>
<li>Ahammad, M. U., Okamoto, S., Kawamoto, Y., Nakada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+regular+fluid+secretion+from+the+uterus+of+laying+hens+on+the+longevity+and+fertilization+ability+of+fowl+sperm+in+the+oviduct%5BTitle%5D)+AND+%22Poultry+Science+Journal%22%5BJournal%5D)">The effects of regular fluid secretion from the uterus of laying hens on the longevity and fertilization ability of fowl sperm in the oviduct.</a> Poultry Science Journal. 1 (1), 13-22 (2013).</li>
<li>Ahammad, M. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturational+changes+in+the+survivability+and+fertility+of+fowl+sperm+during+their+passage+through+the+male+reproductive+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Reproduction+Science%22%5BJournal%5D)">Maturational changes in the survivability and fertility of fowl sperm during their passage through the male reproductive tract.</a> Animal Reproduction Science. 128 (1-4), 129-136 (2011).</li>
<li>Choi, K. H., Emery, D. A., Straub, D. E., Lee, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Percoll+process+can+improve+semen+quality+and+fertility+in+turkey+breeders%5BTitle%5D)+AND+%22Asian-Australasian+Journal+of+Animal+Sciences%22%5BJournal%5D)">Percoll process can improve semen quality and fertility in turkey breeders.</a> Asian-Australasian Journal of Animal Sciences. 12 (5), 702-707 (1999).</li>
<li>Chen, M. J., Bongso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+evaluation+of+two+density+gradient+preparations+for+sperm+separation+for+medically+assisted+conception%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Comparative evaluation of two density gradient preparations for sperm separation for medically assisted conception.</a> Human Reproduction. 14 (3), 759-764 (1999).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Vruchtbaarheid niet alleen bepaalt de rentabiliteit van de dierlijke productie, maar fungeert ook als een middel van natuurlijke selectie van soorten voor bestaan. De uiteindelijke functie van een zaadcel is een eicel te bevruchten. Het oviduct van een vrouwelijke selecteert alleen deze sterkste zaadcellen met het oog op de bevruchting van de eicel23,24. In vitro studies is gebleken ook een nauw verband tussen kwalitatieve sperma karaktertrekken en bevru...

In gewervelde dieren ondergaan de mannelijke gameten selectieve druk; Daarom is reproductieve fitness van een man cruciaal voor het bereiken van de succesvolle bevruchting. Mannetjes van een bepaalde gewervelde dieren moeten zitten kundig voor produceren van zaadcellen in grote hoeveelheden en van voldoende kwaliteit om te voldoen aan de behoeften van bevruchting. Zaadcellen, met zowel een sperma-hoofd en een flagellum, zijn de meest gepolariseerde cellen in het lichaam. Ze zijn ook zeer heterogene in kwaliteit van sperma (levende en dode morfologisch normale en abnormale en immobiel, lage mobiele en hoge mobiele), die is geopenbaard wordt door de grote variatie in reproductieve efficiëntie van de mannetjes. Hoe groter het aandeel van hoge kwaliteit sperma, de minder het aantal verparingen moeten met succes het bevruchten van de eicel. Echter, om te bereiken vruchtbaarheid, morfologisch normale zaadcellen rekenen op voortstuwende krachten gegenereerd door hun flagellen om de site van bevruchting ook over het penetreren van de zona zitten1 te bereiken (ZP; in het geval van zoogdieren) of inner perivitelline laag2 (IPVL; in het geval van vogels en reptielen) van de eicel na natuurlijke paring of kunstmatige inseminatie (AI). Bepalen van sperma kwaliteit is noodzakelijk voor gebruik in geassisteerde voortplanting technologieën3 (kunst) en selectie van fokken mannetjes worden gebruikt in AI programma's4. Aan de andere kant, berust het succes van ART uitsluitend op de nauwkeurige evaluatie van de kwaliteit van het sperma. Een aantal laboratoriumtests hebben ontwikkeld om te bepalen van de functionele kenmerken van sperma. De belangrijkste parameters zijn levensvatbaarheid, mobiliteit, sperma morfologie, rechtsbevoegdheid (aviaire-sperma vereisen geen rechtsbevoegdheid5), Acrosoom reactie (AR; exocytose en vrijlating van een Proteolytische enzymen uit het Acrosoom van het sperma-hoofd), sperma penetratie van ZP of IPVL en bevruchting6,7,8,9,10,11. Maatregelen van de vruchtbaarheid alleen bieden niet een nauwkeurige evaluatie van de waardegevende bestanddelen vermogen van een sperma bevolking11. Maatregelen van de verschillende evenementen die aanloop naar bevruchting van een eicel is voorzien van een passende vertegenwoordiging van de prestaties van individuele spermatocyten7.
De methodologie ontwikkeld voor het meten van sperma functie is voornamelijk soortspecifieke. Bijvoorbeeld, in aviaire-sperma zijn levensvatbaarheid, de mobiliteit en de penetratie van IPVL de meest voorkomende parameters gebruikt om te beoordelen van sperma kwaliteit8,11,12. Het aantal levende zaadcellen in het ejaculaat speelt een cruciale rol voor het voortbestaan van sperma, omdat de aanwezigheid van een groot aantal dode zaadcellen in het sperma is van invloed op de kwaliteit van sperma. Dit verhoogt de productie van reactieve zuurstof soorten in het sperma en oxidatieve schade veroorzaakt aan de levende zaadcellen13. Sperma mobiliteit, de capaciteit voor flagellar verkeer van aviaire-sperma tegen weerstand op lichaamstemperatuur, is bekend dat een directe rol in het bewerkstelligen van bevruchting8spelen. Het is reeds lang gevestigd dat mobiliteit is positief gecorreleerd met vruchtbaarheid en daarom is het een primaire determinant van vruchtbaarheid8. Een mobiele sperma moet echter ook de mogelijkheid te ondergaan een AR en te doordringen van de IPVL-11. IPVL penetratie testen rekening voor elke sperma die in het proces van bevruchting11 participeert.
Bij de toepassing van ART, wordt ejaculaat meestal verwerkt om de concentratie van hoge kwaliteit sperma te maximaliseren en minimaliseren van de concentratie van lage kwaliteit sperma. Na het verzamelen van sperma, kan het aandeel van hoge kwaliteit sperma worden verrijkt door sperma scheiding procedures gebruikte in zowel de industrie als de onderzoek praktijken. Veel van deze procedures zijn ontwikkeld, allemaal met de respectieve voordelen en beperkingen, maar allemaal gebruik maken van het heterogene karakter van de zaadcellen te verzamelen van alleen het sperma met hoog vermogen van de waardegevende bestanddelen. Deze procedures omvatten sperma migratiemethoden, naleving van kolom filtratie en dichtheid kleurovergang centrifugeren (DGC)14,15,16,17,18,19 , 20. onder de beschikbare technieken, DGC gebleken te zijn zeer eenvoudig, herhaalbaar, kosteneffectieve en efficiënte in het isoleren van de maximale hoeveelheid kwalitatief hoogwaardige sperma voor gebruik in de kunst met als doel het maximaliseren van kans op bevruchting14 , 15. Bovendien, DGC is niet schadelijk voor de celmembraan van sperma. In tegenstelling, sperma migratiemethoden verzamelen slechts geleidelijk mobiele sperma18,19, maar de hoeveelheid sperma verzameld is erg laag, waardoor het inefficiënt bij het verzamelen van grote hoeveelheden sperma18, 20. naleving van kolom filtratie is zeer efficiënt in het filteren van uiterst mobiele sperma van sperma17; Nochtans, neigt het naar schadelijk voor sperma membranen20,21zijn.
Bij het DGC techniek is de meest gebruikte substraat voor het genereren van het verloop van de dichtheid Percoll, die uit deeltjes van de colloïdale silica gecoat in polyvinylpryrolidone bestaat. Percoll dichtheid kleurovergang centrifugeren (PDGC) kan continue of discontinue maar een discontinue verloop wordt meestal gebruikt voor hoog rendement isolatie voor zeer mobiele sperma13,16,20. In een discontinue verloop zweeft lagere dichtheid media boven hogere dichtheid media, maken een verloop dat toename van de dichtheid van de bovenkant naar de onderkant van een conische buis. Hierdoor grenzen op het raakvlak tussen de twee media van verschillende dichtheid. De efficiëntie van de PDGC is afgeleid van twee factoren: 1) de voortstuwende vermogen van individuele zaadcellen en 2) de neiging van de zaadcellen met hoge structurele integriteit te hebben een hogere dichtheid. Sperma met hogere mobiliteit zijn beter in staat te steken uit lagere dichtheid media en doordringen in een hogere dichtheid-media. Lagere mobiliteit sperma zijn meer kans om te worden opgesloten op de grens gemaakt door de interface tussen media van verschillende dichtheid. Hebben een hogere dichtheid dan dood, abnormale of laag zaadcellen mobiele meestal zaadcellen met hoge structurele integriteit en mobiliteit. Wanneer de middelpuntvliedende kracht wordt toegepast in PDGC, vergemakkelijkt dit het verkeer van sperma met verschillende dichtheden naar hun respectieve plaats in het verloop.
In de huisartspraktijk, nadat PDGC wordt uitgevoerd, de zachte pellet van sperma met hoge vruchtbaarheid potentiële aan de onderkant van de conische buis wordt verzameld, en de rest wordt weggegooid. Een onderbenutte voordeel van deze techniek is echter de mogelijkheid om te scheiden van zaadcellen in verschillende groepen op basis van de kwaliteitsverschillen. Voor onderzoeksdoeleinden zorgt scheiding van sperma door mate van kwaliteit met behulp van de PDGC-techniek voor de studie van de kwaliteit van het sperma als het gaat om fysiologische, metabolomic en Proteoom verschillen. Hier willen we in detail hoe deze techniek kan worden gebruikt voor het scheiden van sperma door kwaliteit, evenals het aantonen van deze verschillen in kwaliteit, met behulp van de vitale kleuring van tevoren vastgelegde eosine-Nigrosine voor de levensvatbaarheid, de Accudenz assay voor mobiliteit en sperma-IPVL interactie assay voor werkkleding.

<table><tbody><tr><td>Accudenz</td><td>Accurate Chemical and Scientific Corporation, Westbury, NY, USA</td><td>AN7050</td><td></td></tr><tr><td>Percoll&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA</td><td>P7828</td><td></td></tr><tr><td>Schiff&rsquo;s reagent</td><td>Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA</td><td>3952016</td><td></td></tr><tr><td>TES</td><td>Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA</td><td>T1375</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y</td><td>Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA</td><td>E4009</td><td></td></tr><tr><td>Nigrosin</td><td>Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA</td><td>198285</td><td></td></tr><tr><td>ST 40R Centrifuge&nbsp;</td><td>Thermo Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>75004524</td><td></td></tr><tr><td>DU 530 Life Sciences UV/Vis Spectrophotometer</td><td>Beckman Coulter, Brea, CA, USA</td><td></td><td>Geen catalogus gevonden</td></tr><tr><td>Olympus IX 71 Inverted Fluorescence and Phase Contrast Microscope</td><td>Olympus America Inc., PA, USA</td><td></td><td>Geen catalogus gevonden</td></tr></tbody></table>

sperma collectie van differentiële kwaliteit met behulp van dichtheid kleurovergang centrifugeren

Sperm Collection of Differential Quality Using Density Gradient Centrifugation

In de geslachtelijke voortplanting, een mannelijke gameet of spermacel combineert met een vrouwelijke gameet te bewerkstelligen van bevruchting. Echter, zijn een groot aantal zaadcellen met het bevruchten van vermogen vereist voor interactie met een vrouwelijke gameet om bevruchting. Als zodanig, is het waardegevende bestanddelen vermogen van individuele zaadcellen essentieel voor succesvolle voortplanting. Dichtheid kleurovergang centrifugeren is gebruikt voor enkele tientallen jaren als een reproduceerbaar, snelle, doeltreffende, doelmatige en uiterst flexibele methode voor het verzamelen van alleen hoge kwaliteit sperma in gesubsidieerde reproductieve technologie moet worden gebruikt. De protocollen die we hier beschreven focus op het gebruik van de discontinue Percoll dichtheid kleurovergang centrifugeren (PDGC)-techniek om te isoleren van drie afzonderlijke populaties van Haan sperma door hun kwaliteit. We konden verzamelen van lage-, Midden- en hoge kwaliteit sperma. Ook beschrijven we reproduceerbare protocollen die bepalende potentieel van de vruchtbaarheid van het sperma door de beoordeling van de levensvatbaarheid, de mobiliteit en de werkkleding met zich meebrengen. Verzameling sperma door hun kwaliteit met behulp van PDGC techniek zou zinvol zijn om nauwkeurig en grondig typeren sperma met differentiële vruchtbaarheid potentiële.

De techniek van de PDGC resulteerde in de duidelijke scheiding van de drie lagen van sperma door mate van kwaliteit over alle parameters. Sperma worden gescheiden in een kwalitatief hoogwaardige laag onder de hogere dichtheid oplossing, een midden-kwaliteit laag tussen de hogere en lagere dichtheid oplossing en een lage kwaliteit laag boven de lagere dichtheid oplossing. Deze verschillen in kwaliteit zijn blijkt door duidelijke verschillen in levensvatbaarheid (Figuur...

In deze paper willen we de prestaties van de dichtheid kleurovergang centrifugeren techniek en de toepassing ervan in sperma fysiologie onderzoek beschrijven.

Sperma collectie van differentiële kwaliteit met behulp van dichtheid kleurovergang centrifugeren

In sexual reproduction, a male gamete or sperm cell fuses with a female gamete to bring about fertilization. However, a large number of sperm cells with ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van spermafysiologie, zoals de chemische determinaten van de kwaliteit van het sperma. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is het vermogen om grote hoeveelheden monster te scheiden door kwaliteit, evenals aanpassingsvermogen in vergelijking met alternatieve methoden. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de verschillen in spermakwaliteit, kan het ook worden toegepast op andere monsters, zoals gemengde celtypen of subcellulaire componenten met verschillende dichtheden.Om te beginnen, maak twee 3 milliliter Percoll verdunningen in twee afzonderlijke buizen. Verdun in een schone reageerbuis 1 milliliter spermamonster met 2 milliliter PBS. Pijp het voorzichtig om de oplossing te mengen.Voeg 3 milliliter van de lagere dichtheid Percoll sollution toe aan een steriele conische buis. Dan, voorzichtig pipette 3 milliliter van de hogere dichtheid Percoll oplossing onder de lagere dichtheid Percoll oplossing. Tijdens het kantelen van de conische buis in een hoek van 45 graden, pipet 3 milliliter van het verdunde sperma monster op de top van de Percoll dichtheid gradiënt.Na het bereiden van een lege buis, centrifugeren beide buizen op 1500 Gs gedurende 20 minuten. Verzeker dat drie verschillende lagen sperma zich in het bad hebben gevormd na centrifugatie. Met behulp van een pipet verzamelen van de drie lagen sperma, te beginnen met de bovenste laag, gevolgd door de middelste laag, en eindigend met de harde pellet aan de onderkant van de buis.Breng elk van de lagen over naar een steriele microcentrifugebuis. Verdun elk van de spermamonsters met 1,5 milliliter PBS en centrifuge de monsters tien minuten op 1500 G. Tot slot, giet de supernatant en reconstrueren van de pellets met beweeglijkheid buffer.In dit protocol werd de Percoll-dichtheidsgradiëntcentcentrifugatietechniek of PDGC gebruikt om een spermamonster in drie verschillende lagen te scheiden. Sperma scheidt zich in een laag van hoge kwaliteit onder de oplossing met een hogere dichtheid, een gemiddelde kwaliteitslaag tussen de oplossingen met een hogere en lagere dichtheid en een laag van lage kwaliteit boven de oplossing met een lagere dichtheid. Deze verschillen in spermakwaliteit worden aangetoond door verschillen in levensvatbaarheid, mobiliteit en doordringbaarheid.Tijdens het proberen van deze procedure, is het belangrijk om te onthouden dat monsters moeten worden gebracht op kamertemperatuur. Het succes van PDGC is afhankelijk van een zorgvuldige voorbereiding van het verloop en het zorgvuldig verzamelen van de geïsoleerde lagen. Na de ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor ons onderzoek op het gebied van spermaperdiomics om bio markers van vruchtbaarheid bij vogelsoorten te verkennen.

sperm-collection-differential-quality-using-density-gradient

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een efficiënte methode om in hoge mate gezuiverd levensvatbare meiotische fracties te verkrijgen van de muis testis wordt beschreven, die een combinatie van een verfijnde cel dissociatie protocol met TL-geactiveerde cel sortering (FACS). Deze methode maakt gebruik van verschillen in het DNA-gehalte en de nucleaire dichtheid van discrete meiotische fracties.

Flowcytometrie Zuivering van Mouse cellen in de meiose

This video describes the technique of isolating chronic lymphocytic leukemia (CLL) cells from peripheral blood. With this protocol, we will isolate CLL cells from human patient blood sample for subsequent efficient generation of nuclear and cytoplasmic fractions.

Density Gradient Centrifugation: A Method to Isolate CLL Cells from Peripheral Blood

De STA-PUT methode zorgt voor de scheiding van verschillende populaties van spermatogenese cellen op basis van grootte en dichtheid.

Scheiding van spermatogene Cell typen met behulp van STA-PUT Velocity Sedimentatie

We beschrijven een sorteerstrategie voor muis spermatiden met behulp van flowcytometrie. Spermatiden worden ingedeeld in vier zeer zuivere populaties, waaronder ronde (spermiogenetische stappen 1-9), vroege verlengende (spermiogenetische stappen 10-12), late verlengende (spermiogenetische stappen 13-14) en langwerpige spermatiden (spermiogenetische stappen 15-16). DNA-kleuring, grootte en korreligheid worden gebruikt als selectieparameters.

Stap-specifieke sorteren van Muis Spermatiden door flowcytometrie

Dit werk beschrijft de standaardisatie van een methode om zuivere kiemcelpopulaties te verkrijgen uit testicularweefsel van verschillende zoogdieren. Het is een eenvoudig protocol dat mechanische testis dissociatie combineert, vlekken met Hoechst-33342 en propidiumjodide, en FACS-sortering, met brede toepassingen in vergelijkende studies van mannelijke voortplantingsbiologie.

Een gestandaardiseerde benadering voor multispecies Zuivering van zoogdierkiemcellen door middel van mechanische weefseldissociatie en flowcytometrie

We tonen het gebruik van niet-aaneengesloten dichtheid verlopen te onderscheiden bacteriële populaties op basis van capsule productie. Deze methode wordt gebruikt capsule bedrag tussen culturen vergelijken, mutanten met een specifieke capsule fenotype te isoleren, of capsule regelgevers te identificeren. Hier beschreven is de optimalisatie en de werking van de bepaling.

Scheiden van bacteriën per Capsule bedrag met behulp van een discontinue dichtheid verloop

Gepresenteerd hier is een protocol voor het verrijken van pachytene spermatocyten, ronde spermatiden, en rek spermatiden uit volwassen muis testes met behulp van een discontinu bovine serumalbumine dichtheidsgradiënt met standaard laboratoriumapparatuur.

Verrijking van Pachyteen spermatocyten en spermatiden van muis testes met behulp van Standaard laboratoriumapparatuur

Deze studie beschrijft een methode om bacteriële extracellulaire vesikels (BEV's) verrijkt uit menselijke uitwerpselen te isoleren en te zuiveren via dichtheidsgradiëntcentrifugatie (DGC), identificeert de fysieke kenmerken van BEV's op basis van morfologie, deeltjesgrootte en concentratie, en bespreekt de mogelijke toepassingen van de DGC-benadering in klinisch en wetenschappelijk onderzoek.

Isolatie en zuivering van bacteriële extracellulaire blaasjes uit menselijke uitwerpselen met behulp van dichtheidsgradiëntcentrifugatie

Dit protocol beschrijft een methode voor het screenen van sperma van hoge kwaliteit met een lage DNA-fragmentatie-index door gebruik te maken van de beweeglijkheidskenmerken van het sperma en thigmotaxis. De methode maakt gebruik van een U-vormige horizontale zwembaan, waardoor sperma van hoge kwaliteit de andere kant kan bereiken via bufferdruppels, terwijl dood sperma, celresten en onzuiverheden worden uitgesloten.

U-vormige horizontale zwemtechniek voor het bereiden van sperma van hoge kwaliteit met een lage DNA-fragmentatie-index

Denaturerende gradiënt Gel Elektroforese (DGGE)

Leer dichtheidsgradiëntcentrifugatie voor spermafysiologieonderzoek. Deze methode scheidt sperma in drie kwaliteitslagen en helpt bij het bestuderen van vruchtbaarheidsbiomarkers.

Sperma collectie van differentiële kwaliteit met behulp van dichtheid kleurovergang centrifugeren

Meer video's verkennen