Een eenvoudige migratie/invasie Workflow met behulp van een geautomatiseerde Live-cel Imager

Kankercelmobiliteit is cruciaal voor het initiëren van metastase. Daarom is onderzoek naar celbeweging en invasieve capaciteit van tumorcellen van groot belang. Deze geïntegreerde methode voor het onderzoeken van kankercelmigratie en invasie, op één platform in realtime, biedt een gemakkelijk reproduceerbare en tijdefficiënte optie voor het bestuderen van celmobiliteit en pathologie.

Deze methode kan inzicht geven in kankercelinvasie, via de extracellulaire matrix, en kan worden toegepast op andere celtypen. Om een optimale krastijd te bereiken, moet u ervoor zorgen dat de zaaidichtheid is geoptimaliseerd en de incubatietijd niet verlengen zodra de celmonolaag 100 procent samenvloeiing heeft bereikt. Om het optimale aantal gezaaide cellen voor een migratietest te bepalen, plaatst u de cellen in een reeks dichtheden in drievoud in een 96-wandplaat.

Plaats de plaat in de live celafbeelding en selecteer planningsscans uit de takenlijst in de imager-software. Bepaal in het deelvenster ladeopstelling de posities van de plaat en klik op vat toevoegen om het plaattype te selecteren. Selecteer of bewerk het scanpatroon in het configuratievenster van de scan op basis van de experimentele plaatinstelling en stel het scantype als standaard in.

Klik met de rechtermuisknop op de tijdlijn en selecteer ingestelde intervallen. Stel vervolgens scans toe om de twee uur gedurende 24 uur, en klik op toepassen. Open na 24 uur de ladeopstelling zodat de experimentele plaat kan worden geselecteerd en klik op het verwijderen van het vat.

Selecteer drie tot zes representatieve afbeeldingen en plaats ze in een nieuwe afbeeldingsverzameling. Als u een goede verwerkingsdefinitie wilt bepalen, gebruikt u segmentatieaanpassing, opschooning en filters om een geschikt samenvloeiingsmasker toe te passen en gebruikt u een voorbeeld van huidige alles om de nauwkeurigheid van de maskers te bekijken. Start de analysetaak en bepaal een geoptimaliseerde celdichtheid, volgens een samenloop van ongeveer 100 procent tegen de tijd, binnen zes tot achttien uur, afhankelijk van wanneer de migratietest begint.

Pas vervolgens het meetanalyseprogramma toe op de automatisch verzamelde contrastafbeeldingen met hoge definitiefase die worden verzameld om een celproliferatiecurve tegen de tijd te genereren. Voordat u met de test begint, bedekt u de plaat voor de invasietest met 50 microliter extracellulaire matrixgel, verdund in ijskoud celkweekmedium, tot een concentratie van 100 microgram per milliliter. Plaats vervolgens de plaat 's nachts in een couveuse van de celcultuur.

De volgende middag, zachtjes aspirate het overtollige medium, en plaat de cellen op de geoptimaliseerde dichtheid, in drievoud, in de juiste putten van de extracellulaire matrix-gecoate plaat, en in een extra ongecoate 96-put plaat. Plaats vervolgens de platen 's nachts in de couveuse van de celcultuur. Plaats de volgende ochtend de ongecoate migratietestplaat in de basisplaathouder van het krasgereedschap en gebruik de geleidedeuvels om de bovenkant van de houder voorzichtig op de basis te plaatsen.

Houd de zwarte hendel ingedrukt terwijl u het pinblok voorzichtig optilt om de krassen te maken. De krassen in elke put moeten zichtbaar zijn met het blote oog, evenals onder de microscoop. Was vervolgens de plaat een of twee keer met voorverwarmd kweekmedium om losse cellen of celvellen te verwijderen.

Voor de invasie test, krassen op de gecoate plaat zoals net aangetoond. Na het verwijderen van losse cellen en vellen, gebruik maken van een vooraf gekoelde koelbox om de plaat te equilibrate op vier graden Celsius gedurende vijf minuten voordat zorgvuldig aspirating het koude medium. Voeg vervolgens 50 microliter verdunde extracellulaire matrixgel toe in de juiste putten en plaats de plaat dertig minuten in de celkiluse.

Bubbels komen vaak voor bij het werken met extracellulaire matrix gel, maar ze kunnen worden geëlimineerd door het aspirating 70 procent ethanol. Voeg vervolgens 100 microliter vers, warm medium, met of zonder de testverbinding, toe aan de juiste putten van de migratie- of invasietestplaat en plaats de plaat in het live celbeeldvormingsplatform. Om het krasgereedschap schoon te maken, plaatst u het bovenste pinblok in individuele wasboten van 45 milliliter, met 5 procent wasmiddel één, één procent wasmiddel twee, steriel gedestilleerd water of 70 procent ethanol gedurende vijf minuten per wasbeurt voordat u het krasgereedschap weer op de bodemplaat plaatst, voor opslag in een stofvrije omgeving.

Voor het beeldvorming van de wondtesten, na het toestaan van de plaat te equilibrate gedurende vijf minuten, selecteer vat type'als het beeld log vliegtuig, en stel de scan type als kraswond. Selecteer of bewerk het scanpatroon, volgens de experimentele plaatopstelling, en plan 24 uur herhaling van het scannen om de een tot twee uur gedurende 72 uur, of totdat de wonden zijn genezen zoals aangetoond. Wanneer alle wonden zijn genezen, stop de scan en selecteer drie tot zes representatieve beelden, verspreid over een reeks geluidspercentages, inclusief beelden direct nadat de wond is gemaakt, en wondsluiting met 10 en 50 procent.

Als u een goede verwerkingsdefinitie wilt bepalen, past u een geschikt kraswondmasker en een samenvloeiingsmasker toe zoals aangetoond, en gebruikt u voorbeeldstroom om de nauwkeurigheid van de maskers te bekijken. Start vervolgens de analysetaak. In een migratietest is de wondbreedte de gemiddelde afstand tussen de celbladen naast de wond.

De wond samenvloeiing is de samenvloeiing binnen het gewonde gebied. De ideale eerste wond samenvloeiing moet dicht bij nul procent. De relatieve wonddichtheid en wond samenvloeiing suggereren de snelheid van de cellen bezetten de kraswond gebied.

Deze gegevens overlappen elkaar bijna in beide representatieve cellijnen. Verschillende cellijnen tonen zeer verschillende wondgenezingsvermogens aan, wat wijst op differentiële migratievaardigheden tussen de cellijnen. Bijvoorbeeld, lamellipodia worden waargenomen in deze borst adenocarcinoom cellijn aan het migratiefront aan het begin van de migratie, terwijl deze mucin 1-producerende borstkankercellijn geen teken van celmigratie tegelijkertijd vertoonde.

Verder was de relatieve wonddichtheid van de borstacarcinoomlijn verzadigd na 50 uur, terwijl de relatieve wonddichtheid van de mucin 1-producerende borstkankercellijn na verloop van tijd niet veranderde, wat het zeer invasieve fenotype van de adenocarcinoomcellen en niet-invasiefheid van de mucin 1-producerende borstkankercellen onderstreepte. De adenocarcinoomcellen gedroegen zich ook anders tijdens een invasie door de extracellulaire matrixgel, die een langwerpige morfologie met leidende uitsteeksels aantoonde, en in migratietesten werd een bleb aan het migratiefront gevisualiseerd. Bij het beplating, bedenk dan dat als er te weinig cellen worden gezaaid, de kras niet goed zal vormen, en als er te veel cellen worden gezaaid, zal er overbevolking zijn.

Na deze procedure kunnen spoorbehandelingen worden toegevoegd, waardoor deze methode kan worden aangepast voor screening van een hoog doorvoertraject. Deze methode stelt onderzoekers in staat om deze tests uit te voeren op een enkel platform, dat is high-throughput, en stelt onderzoekers in staat om hun cellen te controleren in real time, in plaats van in experimentele eindpunt. De ontsmettingsmiddelen die worden gebruikt voor het steriliseren van het krasgereedschap kunnen gevaarlijk zijn.

Zorg ervoor dat u de oplossingen verzamelt en verwijdert volgens de relevante MSDS en de reguliere triggerlijnen van uw faciliteit.