Karakterisering van Histone posttranslationele wijziging wijzigingen in gist neurodegeneratieve Proteinopathy modellen

Dit protocol stelt ons in staat om gemakkelijk te verkennen van de epigenetische kenmerken van neurodegeneratieve ziekte. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het gist als modelsysteem exploiteert, in vergelijking met andere cellulaire en dierlijke modellen van neurodegeneratieve ziekte, gist is opportuun en kostenefficiënt. Deze techniek stelt ons in staat om de epigenetische veranderingen die zich voordoen in neurodegeneratieve ziekte, die kunnen leiden tot nieuwe markers voor de diagnose, evenals nieuwe doelen voor therapie in kaart te brengen.

Deze methode maakt verder onderzoek van de rol van epigenetische merken bij neurodegeneratieve ziekte mogelijk en kan worden aangepast voor de beoordeling van menselijke fibroblasten en geïnduceerde pluripotente stamcellen. Deze specifieke methode bevat een aantal details die visueel moeten worden aangetoond, zoals het goed laden van het westerse vlekapparaat. Het aantonen van de procedure zal Michel Fallah en Navin Rana, beide undergraduate onderzoekers in het Torrente laboratorium.

Begin met het restreaking gist uit bevroren glycerol voorraden op histidine 2%glucose agar selectieve medium platen, voor een twee tot drie dagen incubatie bij 30 graden Celsius. Aan het einde van de incubatie, inenting restreaked gist voor elk over expressie model en controle in vijf milliliter van histidine selectieve vloeibare medium. Aangevuld met 2%raffinose bij 30 graden Celsius en 200 rotaties per minuut, 's nachts.

De volgende ochtend, groeien 100 milliliter vloeibare cultuur voor elk van de overexpressie modellen en controles in selectieve mediums aangevuld met 2% galactose 's nachts. En meet de optische dichtheid op 600 nanometer of OD600 om het volume van de nachtelijke cultuur te bepalen die nodig is om expressieculturen te maken bij een beginnende OD600 van 0,3. Om eiwitoverexpressie te induceren, kweekt u de gist op galactosemedium met schudden op 30 graden Celsius voor de juiste experimentele periode.

Meet vervolgens de OD600 van elke cultuur aan het einde van de inductieperiode. En standaardiseer alle celtellingen tot de laagste OD600-waarde. Oogst de culturen in 50 milliliter centrifugebuizen door centrifugatie en resuspend de pellets in een milliliter steriel stilstaand water voor elke 10 milliliter kweek geteeld.

Aliquot een milliliter cel resuspensie in individuele microcentrifuge buizen voor een extra centrifugatie en het aanzuigen van de supernatants. Vervolgens snap bevriezen van de cel pellets in vloeibare stikstof voor opslag op min 80 graden Celsius. Om de cellen te lyse voor westerse vlekanalyse, ontdooi de gistcelpellets op ijs voordat ze opnieuw worden geschorst in 100 microliters gedestilleerd water.

Voeg 300 microliter natriumhydroxide van 0,2 molar en 20 microliter 2-Mercaptoethanol toe aan elk celmonster. En resuspend de pellets door pipetting. Na een incubatie van 10 minuten op ijs, pellet de cellen door centrifugatie en resuspend de monsters in 100 microliters van lading kleurstof.

Kook vervolgens de monsters gedurende 10 minuten op een verwarmingsblok. Terwijl de monsters worden lysed, plaats twee gels in een gel houder en vul de binnenste kamer naar de top met lopende buffer en de buitenkamer aan de twee-gel lijn merk. Wanneer de monsters klaar zijn, laad 15 microliters per stuk, cel lyse oplossing, in elke put van de 10 goed, 12% polyacrylamide gel en voeg vijf microliter eiwit ladder aan de eiwit ladder lane goed.

Voer de gel ongeveer 45 minuten op 150 volt of totdat het laden kleurstof voorzijde bereikt de bodem van de gel. Terwijl de gel draait, weken twee vezel pads per gel in overdracht buffer en een polyvinylidene fluoride, of PVDF, membraan per gel in methanol. Wanneer de gel klaar is, spoel membraan in overdracht buffer en plaats een voorgesnapte vezel pad op de bodem van een semi-droge overdracht apparaat cel.

Gevolgd door de PVDF membraan, de gel en de tweede presoaked fiber pad. Stel vervolgens de stroom in op 150 milliampère voor een uur. Verwijder aan het einde van de eiwitoverdracht het membraan uit het transferapparaat voor een korte spoeling met gedestilleerd water.

Plaats het gespoelde membraan, eiwit kant omhoog in een kleine kleuring doos en bedek het membraan met tris-gebufferde zoutoplossing of TBS, het blokkeren van buffer voor een uur incubatie bij kamertemperatuur met zachte schommelen. Aan het einde van de blokkerende incubatie, incuberen het membraan 's nachts met een anti-gist histone en modificatie-specifieke antilichaam in TBS op vier graden Celsius. En een goede nucleaire lading controle antilichaam.

De volgende ochtend, was het membraan vier keer in TBS, aangevuld met 0,1% polysorbaat 20 gedurende vijf minuten met schommelen op kamertemperatuur per wasbeurt. Na de laatste wasbeurt, incubeer de vlek met de juiste secundaire antilichamen gedurende een uur bij kamertemperatuur. Gevolgd door vier, vijf minuten wasbeurten in tbst en een vijf minuten wassen in tbs alleen met schommelen.

Dan beeld de vlek op een fluorescerende Westerse vlek verbeelden systeem voor twee minuten. Hier wordt groeionderdrukking in vaste en vloeibare culturen aangetoond met significante effecten op de gistgroei waargenomen in de aanwezigheid van galactose-geïnfundeerd in sarcoomoverexpressiemodellen. Een significante daling van de histonniveaus zijn zichtbaar in het gefuseerde sarcoomoverexpressiemodel en aanzienlijke stijgingen van de histonacetylatie in het TAR-bindende eiwit 43 overexpressiemodel, worden waargenomen die niet worden waargenomen in het gefuseerde sarcoom- of alfasynuclein overexpressiemodel.

Er zijn ook aanzienlijke dalingen in de histonniveaus in het alfasynuclein overexpressiemodel. In dit sacharose-tuning experiment, hoe lager de hoeveelheid galactose gebruikt om te induceren gesmolten in sarcoom overexpressie, de lagere toxiciteit die wordt waargenomen in zowel vaste als vloeibare cultuur. Belangrijk is, hoe lager het niveau van gesmolten in sarcoom overexpressie, hoe kleiner de omvang van de vermindering van de histonniveaus.

Tijdens het uitvoeren van dit protocol, is het noodzakelijk om de hoeveelheid gist in elk monster te standaardiseren om een goede vergelijking in de niveaus van histone post-translationele wijziging mogelijk te maken. 2-Mercaptoethanol moet onder een kap worden gebruikt om inademing te voorkomen. Als Ponceau vlek wordt gebruikt, moet het goed worden weggegooid.