Een methode om α-synucleïnetoxiciteit en -aggregatie te bestuderen met behulp van een gehumaniseerd gistmodel

Dit is een eenvoudige methode om cellulaire fenotypen en kenmerken van R-pass-kernen te controleren. Het kan ook vaak worden teruggevonden in genoombrede studie om de genetische factoren te vinden die de stabiliteit van R-pass-kernen beïnvloeden. Omdat dit een goed ingeburgerd motorisch organisme is, is deze techniek eenvoudig en vereist het niet veel tijd en moeite in vergelijking met het gebruik van menselijke cellijnen of diermodellen.

De aggregatie van R-pass kernen is nauw verbonden met de ziekte van Parkinson. De eiwitten of chemicaliën die waarschijnlijk de stabiliteit van R-pass kernen beïnvloeden, kunnen worden getest in dit gehumaniseerde gistmodel. Om te beginnen, patch drie enkele kolonies op een SD-URA agar plaat voor de selectie van cellen die alfa-synucleïne plasmiden bevatten.

Ent vervolgens de drie-gepatchte gisttransformatoren per stam in 3 milliliter SRD-URA voor de selectieve groei van gist die de plasmiden bevat met 2% raffinose voor remming van de inductie van alfa-synucleïne onder de Gal1-promotor en 0,1% glucose. Incubeer de geënte cultuur bij 30 graden celsius onder agitatie met 200 rotaties per minuut. Ent de volgende dag de nachtelijk gekweekte cellen in 3 milliliter verse SRD-URA totdat ze een optische dichtheid van 0,2 bij 600 nanometer bereiken.

Incubeer vervolgens de cultuur gedurende zes uur bij 30 graden celsius onder agitatie met 200 rotaties per minuut. Meet de optische dichtheid op 600 nanometer met behulp van een spectrofotometer. Verdun vervolgens de monsters tot een optische dichtheid van 0,5 op 600 nanometer met steriel gedestilleerd water in baan 1 van een 96-well plaat om het aantal cellen in elke cultuur gelijk te trekken.

Voer 5-voudige seriële verdunningen van de gistcellen uit door 160 microliter steriel gedestilleerd water toe te voegen aan de volgende vijf rijstroken en zorg voor een totaal volume van 40 microliter bij het serieel verdunnen van de cellen in elke baan. Gebruik een meerkanaals pipet om 10 microliter uit elke put over te brengen om de monsters op SD-URA agarplaten voor de controles en SG-URA agarplaten om de toxiciteit te controleren te spotten. Incubeer de gevlekte platen ondersteboven bij 30 graden celsius gedurende vier dagen.

Maak elke 24 uur tot dag vier foto's van de platen en analyseer vervolgens de gegevens door de groeiverschillen tussen met het oog gespotte stammen te vergelijken. Ent de drie gepatchte gisttransformatoren per stam in drie milliliter SRD-URA en incubeer bij 30 graden Celsius onder agitatie met 200 omwentelingen per minuut per nacht. Meet de volgende dag de optische dichtheid van de cellen die 's nachts op 600 nanometer zijn gekweekt en ent de cellen in totaal 200 microliter verse SD-URA en SG-URA in 96-well platen.

Pas het uiteindelijke volume inclusief de cellen aan op 200 microliter en pas de initiële optische celdichtheid aan op 0,05 bij 600 nanometer. Pas de programma-instellingen in de microtiterplaat aan. Stel de doeltemperatuur in op 30 graden Celsius, de intervaltijd op 15 minuten, de schudduur op 890 seconden, de schudamplitude op 5 millimeter en de meting als absorptie op 600 nanometer.

Incubeer de plaat gedurende 2-3 dagen voor alle stammen om de stationaire fase in een microplaatlezer te bereiken. Analyseer de gegevens door de groeicurve uit te zetten. Ent de gepatchte gisttransformaties in 3 milliliter SRD-URA en kweek ze 's nachts op 30 graden Celsius onder agitatie met 200 rotaties per minuut.

Ent de volgende dag de 's nachts gekweekte cellen opnieuw in 3 milliliter verse SRD-URA tot een optische dichtheid van 0,003 op 600 nanometer en incubeer vervolgens de cultuur bij 30 graden Celsius onder agitatie met 200 rotaties per minuut, totdat de optische dichtheid 0,2 bereikt. Voeg vervolgens 300 microliter 20% galactose toe en incubeer vervolgens nog eens 6 uur bij 30 graden Celsius onder agitatie met 200 rotaties per minuut. Verzamel een milliliter van de celcultuur door centrifugeren bij 800 g gedurende 5 minuten en gooi het supernatant weg.

Resuspenseer de celpellet voorzichtig in 30 microliter gedestilleerd water. Bereid een agarose gel pad op een glazen glijbaan. Resuspendeer de cellen en laad vijf microliter van de cel resuspensie op de glasplaat en bedek de cellen met behulp van de gesneden agarose pad voor onderzoek.

Om microscopische beeldvorming uit te voeren met een 100x-objectief, gebruikt u de optie voor het vastleggen van schermen voor het genereren van afbeeldingen met behulp van het programma en selecteert u brightfield om de cel scherp te stellen met een 100x-objectief met behulp van dompelolie. Schakel over naar een GFP-fluorescentiefilter en pas de belichtingstijd van het beeld aan tot tussen 50 milliseconden en 300 milliseconden om een helder beeld te verkrijgen door de signaal-ruisverhouding in evenwicht te brengen. Open het afbeeldingsbestand en analyseer de gegevens door de cellen te tellen op basis van het aantal foci in de cellen met behulp van beeldanalysesoftware.

De synucleïne-expressie onder de Gal1-promotor in de PRS426-vector vertoonde een significante groeivertraging op de agarplaat met galactose als inductor. Het verschil in groei door synucleïneexpressie werd ook waargenomen in vloeibare culturen. In beide kweekomstandigheden vertoonden wild-type synucleïne en varianten met E46K- of A53T-mutaties groeidefecten als gevolg van synucleïnetoxiciteit.

De synucleïne A30p-variant, die geen aggregaten vormt, vertoonde echter een niet-toxisch fenotype. De stammen die ernstige cytotoxiciteit vertoonden, vertoonden foci van synucleïneaggregaten, maar in de A30p-variant werd een minder toxische vorm van synucleïne door de cellen verspreid. Om reproduceerbare resultaten te bereiken, is het belangrijk om de cel in elk experiment in dezelfde groeifase te gebruiken, vooral wanneer u synucleïne-geassocieerde fenotypen monitort.

Zoals we hebben aangetoond in fluorescerende microscoopgegevens, kan synucleïne grotere aggregaten vormen. Daarom kan het eenvoudig worden gefractioneerd door centrifugatie en kan het worden gekwantificeerd door western blotting met behulp van synucleïne-specifiek antilichaam. Deze techniek is toepasbaar voor high-throughput screening om nieuwe genetische factoren en chemische verbindingen te vinden die de aggregatie van synucleïne beïnvloeden.

Zo hopen we nieuwe therapeutische kandidaten voor de ziekte van Parkinson te vinden.