Isolatie en analyse van traceerbare en gefunctionaliseerde extracellulaire blaasjes uit het plasma en vaste weefsels

Dit protocol biedt een haalbare manier om de juiste extracellulaire blaasjes uit de meeste bloed- en vaste weefsels te isoleren en te verzamelen, vooral hun bron en de eiwitinhoud te analyseren, wat verdere functionele experimenten helpt. Naast een hoge opbrengst en lage contaminatie is het belangrijkste voordeel van dit protocol de analyse van oppervlakteantigenen en eiwitladingen van EV's, wat nuttig is voor fysiologische en pathologische studies. Het vergemakkelijkt de diagnose van kankers van ziekten, zoals ontstekingsziekten en osteoporose door de detectie van oppervlaktemarkers van oudercellen van extracellulaire blaasjes met een flowcytometer.

De hoeveelheid weefsel extracellulair blaasje is van cruciaal belang voor de volgende experimenten. Zorg ervoor dat de concentratie van extracellulaire blaasjes niet hoog is. Wees geduldig om de verdunning uit te voeren.

Om te beginnen, bereid de maxillaire botmonsters voor door het maxillaire bot te isoleren met een oogheelkundig pincet en een schaar en was ze met PBS om zachte weefsels met een pincet te verwijderen. Doe vervolgens het maxillaire bot in centrifugebuizen van 1,5 milliliter en snijd het bot met een schaar in kleine stukjes van een millimeter in diameter. Voeg een bepaalde hoeveelheid Liberase toe om het weefsel te bedekken en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius.

Centrifugeer vervolgens het monster op 800 G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius en breng het supernatant voorzichtig over met een pipet naar een nieuwe en schone centrifugebuizen van 1,5 milliliter. Na het centrifugeren van de bereide plasma- en botmonsters gedurende 15 minuten bij 2, 500 G en vier graden Celsius om grote celresten en resterende bloedplaatjes te verwijderen, brengt u de supernatanten voorzichtig over naar nieuwe en schone centrifugebuizen van 1,5 milliliter en centrifugeert u gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius bij 16.800 G. Gooi vervolgens het supernatant weg en resuspensie de pellets in elke buis met één milliliter PBS.

Na het centrifugeren en weggooien van het supernatant zoals eerder aangetoond, opnieuw, resuspendeert u de pellets in elke buis met 50 microliter PBS en bewaart u deze monsters bij vier graden Celsius gedurende minder dan 24 uur of gebruikt u ze bij voorkeur onmiddellijk voor de analyses. Resuspendeerde monsters met 500 microliter PBS en breng 50 microliter over in een nieuwe en schone centrifugebuis van 1,5 milliliter als een blanco controle gelabeld als buis A en nog eens 50 microliter in een andere schone centrifugebuis van 1,5 milliliter als een eenvoudige kleuringsbuis voor FITC, gelabeld als buis B.Voeg 0,5 microliter membraankleurstof toe aan de primaire buis voor membraankleuring terwijl u gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur broedt. Na het centrifugeren van de primaire buis gedurende 30 minuten bij 16, 800 G en het weggooien van het supernatant, resuspensie de pellets met 200 microliter PBS.

Verdeel elk monster van 50 microliter in vier centrifugebuizen van 1,5 milliliter voor eenvoudige kleuringsbuizen voor PE gelabeld als buis C, oppervlaktemarkerkleuring gelabeld als buis D en secundaire antilichaam-only controles gelabeld als buis E.Voeg het primaire antilichaam van osteoclast-geassocieerde receptor- en botextracellulaire blaasjesmonsters toe, evenals CD-18-antilichaam- en plasma-extracellulaire blaasjesmonsters aan buis B en buis D afzonderlijk, een uur broeden bij vier graden Celsius. Centrifugeer de buizen en gooi het supernatant weg zoals eerder aangetoond en resuspensie van de pellets met 500 microliter PBS. Nogmaals, centrifugeer gedurende 30 minuten op 16, 800 G en vier graden Celsius om de extra primaire antilichamen te verwijderen.

Na het weggooien van het supernatant resuspendien de pellets met 50 microliter PBS, gevolgd door toevoeging van FITC geconjugeerde secundaire antilichamen respectievelijk in buis E.Incubeer alle buizen gedurende één uur bij vier graden Celsius in het donker. Verdun een druppel van respectievelijk 0,2, 0,5 en een micrometer grote kraalsuspensie tot één milliliter PBS. Voer vervolgens elke maat kralen uit om er zeker van te zijn dat de poort is gekozen voor extracellulaire blaasjes en stel de drempel van de flowcytometer in om te zoeken naar de kralen en extracellulaire blaasjespopulatie met behulp van een geschikte voorwaartse binnenste verstrooiing.

Stel de terminale conditie in als het berekenen van 100.000 membraan geverfde deeltjes en analyseer het monster via een flowcytometer zoals beschreven in het manuscript. Resuspendeer de pellets in 50 microliter RIPA-lysisbuffer en incubeer gedurende 30 minuten op ijs. Om de eiwitconcentraties van alle monsters in de 96-putmicroplaat te kwantificeren met de BCA-eiwittest, verdunt u de twee milligram per milliliter BSA met 0,9% van de normale zoutoplossing tot 0,5 milligram per milliliter.

Bij 0,5 milligram per milliliter BSA en 0,9% van de normale zoutoplossing in drie gedupliceerde putten met bepaalde volumes. Laat vervolgens twee microliter van de monsters vallen en voeg 18 microliter normale zoutoplossing toe aan drie gedupliceerde putjes afzonderlijk. Na het bereiden van een werkoplossing door BCA-reagens A te mengen met reagens B, voegt u 200 microliter van de werkoplossing toe aan elke put en schudt u voorzichtig gedurende 30 seconden.

Incubeer vervolgens de 96-putmicroplaat gedurende 20 tot 25 minuten bij 37 graden Celsius en meet de optische dichtheid op 596 nanometer met de spectrofotometer. Exporteer vervolgens de gegevens, teken een standaardcurve en bereken de eiwitconcentratie van de monsters. Verdun volgens de resultaten de monsters tot één microgram per microliter met 0,9% van de normale zoutoplossing en vijf keer de concentratie van SDS-PAGE-laadbuffer en sluit de buizen goed af met film en verwarm gedurende vijf minuten bij 100 graden Celsius.

Laad de monsters in de eiwitladder in een gradiëntconcentratie van vier tot 20% HEPy's tris-gel. Laat de gel in de loopbuffer op 80 volt lopen totdat de eiwitten een lijn vormen. Schakel vervolgens een uur lang over naar 120 volt totdat de laadkleurstof zich aan de onderkant van de gel bevindt.

Breng de gel gedurende 20 seconden over op het polyvinylideenfluoridemembraan dat vooraf in methylalcohol is geïncubeerd met behulp van een nat transfersysteem om gedurende één uur bij 200 milliampère over te brengen. Bereid 5% BSA-blokkeringsbuffer voor door 2,5 gram BSA en 50 milliliter TBST toe te voegen aan een centrifugebuis van 50 milliliter. Blokkeer de membranen in deze buffer gedurende twee uur bij kamertemperatuur met roeren.

Incubeer de membranen met specifieke primaire antilichamen verdund met TBST in de juiste concentratie 's nachts bij vier graden Celsius. Was de membranen in de wasbuffer vier keer en incubeer de membranen met geschikte secundaire antilichamen gedurende een uur bij kamertemperatuur met roeren. Nadat u de membranen in de wasbuffer vier keer hebt gewassen, beeldt u de membranen af met behulp van de chemiluminescentiekit in een gelbeeldvormingssysteem.

De transmissie-elektronenmicroscopie en nanodeeltjestraceringsanalyse onthulden dat de typische morfologische kenmerken van extracellulaire blaasjes rond en bekervormig waren met een diameter variërend van 500 tot 300 nanometer. Flowcytometrie-analyse toont de percentages van specifieke membraanmarkers uitgedrukt op extracellulaire blaasjes die hun oorsprong uit oudercellen impliceren. Western blot-analyse toont de expressie van PGD en PKM2 respectievelijk als een vertegenwoordiger van het eiwitgehalte en plasma-extracellulaire blaasjes en botextracellulaire blaasjes, wat de metabole status aangeeft.

Negatieve expressie van Golgin-84 in extracellulaire blaasjes werd gedetecteerd met de aanwezigheid van mitofiline, alfa-actinine-4, flottielachtig-1, caveolin-1 en bèta-actine, samen met blaasjesmarker CD9, terwijl CD81-expressie laag of afwezig is met een gebrek aan APO-A-1-bestaan in de extracellulaire blaasjes van het plasma. Onderzoekers, dus rekening houdend met stap 2.2, moet de voorbereiding en de vertering van de weefselmonsters voldoende worden gedaan. Anders is het aantal extracellulaire blaasjes dat uit de weefsels wordt geëxtraheerd beperkt.

De marker met het label fluorescerende kleuring van de extracellulaire blaasjes kan in de mond worden geïnjecteerd om de fase te behandelen die verband houdt met de potentiële functie.