Bereiding van de monsters voor Proteomics-analyse op basis van massa-spectrometrie van oogbeschadigingen en/of Microvessels

De voorbereiding van hoogwaardige massaspectrometrie-compatibele monsters voor uitgebreide proteomeanalyse van oculaire monsters is van cruciaal belang om de moleculaire mechanismen en signaleringstrajecten die betrokken zijn bij gezondheid en ziekte te verduidelijken. De beschreven werkstroom vertegenwoordigt een eenvoudige maar robuuste benadering van strenge monsterbereidingsstappen die specifiek worden verzorgd voor de analyse van massabesprekte monsters zoals oculaire microbloedvaten. Hoewel het hoofddoel van de studie is om een MS-compatibele methode voor oculaire bloedvaten vast te stellen, kan de beschreven werkstroom breed worden toegepast op verschillende cellen- en weefselgebaseerde monsters.

Over het algemeen kunnen individuen die nieuw zijn op deze methode worstelen omdat de identificatie en isolatie van de gekozen korte achterste ciliary slagader, of SPCA takken, kan een uitdaging zijn. Verse varkensogen, samen met oogzenuw en extraoculaire weefsels, werden verkregen uit het lokale slachthuis onmiddellijk post-mortem. Plaats de oogbol in een dissectiekamer met ijskoude Krebs-Henseleit buffer.

Zorgvuldig weggesneden omliggende spieren en weefsels met een paar scherpe Mayo schaar. Maak een incisie met een scalpel, en snijd de wereldbol langs de equatoriale vlak met een paar scherpe Mayo schaar totdat het oog is gescheiden in de voorste en achterste helften. Verwijder zoveel mogelijk glasvocht lichaam van de achterste helft van het oog met behulp van een paar standaard patroon tangen.

Na het gebruik van dissectie pinnen om zorgvuldig pin vaststelling van de achterste helft van het oog, voorzichtig weggesneden de bindweefsels rond de oogzenuw, om de onderliggende retrobulbar vasculatuur bloot met een paar student Vannas voorjaar schaar. Isoleer de paraoptische en distale korte achterste ciliary slagader samen met de omringende bindweefsels met een paar type vijf precisie pincet en Vannas capsulotomie schaar. Verwijder bindweefsels voorzichtig uit de arteriële segmenten met behulp van extra fijne getipte pincet en schaar voordat u de geïsoleerde slagaders in ijskoude PBS spoelt om verontreinigingen en bloedresten te verwijderen.

Zwembad slagaders van twee ogen om een biologische repliceren te verkrijgen, dan wegen de monsters met behulp van een analytische balans. Voeg aan elke buis een mengsel van 0,5 en een millimeter zirkoniumoxidekralen toe, gevolgd door een reagens voor weefseleiwitextractie. Laad nu de monsterbuizen in een blender homogenisator.

Stel de timer in op twee minuten, stel het snelheidsniveau in op zes en begin met homogenisatie. Na het uitvoeren, controleer de monsters voor volledige homogenisatie en houd monsters op ijs tussen elke run. Herhaal de cyclus totdat monsters volledig gehomogeniseerd zijn.

Voorzichtig pipette homogenaat in verse microcentrifuge buizen. Centrifugeer de monsters op 10.000 keer G gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius om onoplosbare eiwitten te pelleteren. Voorzichtig pipette de supernatant met de oplosbare eiwitten zonder het aanraken van de pelletlaag, en de overdracht in verse microcentrifuge buizen.

Voeg 200 microliters extractiebuffer 2A en vijf microliter proteaseremmercocktail toe aan elk pelletmonster. Hang vervolgens de pellet meerdere malen op met een pipet. Gebruik een ultrasone homogenisator om de pellet volledig te homogeniseren.

Stel de amplitude in op 60 en fiets op één. Gebruik een sonde gemaakt van titanium, die geschikt is voor homogenisatie van monsters met kleine volumes. Dompel de sonde onder in de pellet en extractiebuffermengsel op ijs en druk op de startknop.

Sonicate het monster tot de pellet klonten zijn volledig gehomogeniseerd, pauzeren voor een paar seconden tussen elke sonicatie. Controleer op volledige homogenisatie visueel. Meng het homogenaat meerdere malen met een pipet om ervoor te zorgen dat er geen klonten zijn.

Gebruik centrifugaalfilterapparaten met drie kilodalton cutoff voor deze procedure. Steek de drie kilodalton cutoff filter unit in een microcentrifuge buis. Pipette 200 microliter monsterhomogenaat aan één filterapparaat en voeg 200 microliter gedeïmiseerd water toe aan hetzelfde filter.

Na het veilig afdekken, plaats de filtereenheid in een centrifuge en draai gedurende 14.000 keer G gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius. Na centrifugatie scheidt u de filtereenheid die het monsterconcentraat bevat van de microcentrifugebuis die het filtraat bevat, waarbij het filtraat wordt weggegooid. Reconstitueer het concentraat door 400 microliter gedeïsized water toe te voegen aan de filtereenheid.

Na het herhalen van filtratie drie keer, zorgvuldig pipette het gereinigde monster concentraat in een schone microbuis. Bereid de monsters voor op eendimensionale gel elektroforese zoals vermeld in het tekstprotocol, en meng goed met een pipet. Verwarm de monsters op 70 graden Celsius in een droge blokverwarming gedurende 15 minuten en koel af tot kamertemperatuur.

Laad voorzichtig 50 microgram monster per rijstrook met behulp van een pipet, evenals de voorgehouden eiwitstandaard als moleculaire massamarker. Voer de gels ongeveer 60 minuten uit bij een constante spanning van 175 volt. Verwijder aan het einde van de run voorzichtig de gel van de cassetteplaat met een gelmes en breng de gel over in een gel-kleurdoos.

Het bevestigen en bevlekken van de gel uitvoeren zoals beschreven in het tekstprotocol. Schud de gels in de kleuroplossing 's nachts voor de beste algemene resultaten. Voorzichtig decanteren de kleuring oplossing en vervangen door 200 milliliter gedeïsized water voor het schudden van de gels voor ten minste zeven tot acht uur in water om de achtergrond duidelijk.

Verdrijk de eiwitbanden uit de gel met schone nieuwe microtomebladen. Snijd de band in kleine stukjes en breng de gelstukken voorzichtig over in 1,5 milliliter microcentrifugebuizen. Voeg 500 microliter destaining oplossing met 100-millimolar ammonium bicarbonaat en acetonitril.

Incubeer de monsters bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten, met af en toe schudden. Voorzichtig pipette uit de vast te houden oplossing. Controleer visueel op buizen met resterende vlek, en herhaal deze stap als gel stukken zijn nog steeds blauw gekleurd.

Voeg ongeveer 400 microliter vers bereide DTT-oplossing toe en broed gedurende 30 minuten in op 56 graden Celsius. Voeg na het weggooien van de reduceeroplossing met een pipet ongeveer 400 microliters vers bereide IAA-oplossing toe en broed in het donker gedurende 30 minuten in het donker. Verwijder de alkylating buffer met een pipet en gooi.

Voeg 500 microliter neat acetonitril toe bij kamertemperatuur gedurende 10 tot 15 minuten, totdat de gelstukken krimpen en ondoorzichtig worden. Pipette uit de acetonitril, en lucht-droog de gel stukken gedurende vijf tot 10 minuten onder de motorkap. Vervolgens pipette 50 microliters van trypsine oplossing in elke buis om volledig te dekken de gel stukken, en de buizen in te broeden op vier graden Celsius.

Voeg na 30 minuten voldoende trypsinebuffer toe om de gelstukken indien nodig volledig af te dekken. Incubeer de monsters 's nachts op 37 graden Celsius. Om peptide extractie uit te voeren, voorzichtig pipette de geëxtraheerde peptide oplossing uit de buizen en de overdracht naar schone microbuisjes.

Droog de supernatant in een centrifugale vacuümverdamper. Voeg 100 microliter extractiebuffer toe aan elke buis met gelstukken en broed gedurende 30 minuten met schudden. Pipette de supernatant in dezelfde microbuisjes met de geëxtraheerde peptiden volgens hun respectieve banden, en droog af in een vacuümcentrifuge.

Ga over tot peptide zuivering en vloeibare chromatografie-electrospray ionisatie MS/MS analyses zoals beschreven in het tekstprotocol. De totale hoeveelheid eiwitten in monsters die bij elk type wasmiddel worden geëxtraheerd, wordt hier afgebeeld. De hoogste opbrengst kwam uit weefsels die werden geëxtraheerd met weefseleiwitextractiebuffer, gevolgd door DDM, CHAPS, ASB-14 en de laagste opbrengst van ACN en TFA.

Consequent, de totale eiwitten geïdentificeerd waren ook de hoogste in het weefsel eiwit extractie buffer geëxtraheerd monster, en volgde dezelfde trend als de totale opbrengst. Hier is de vergelijking van de een-dimensie gel elektroforese eiwitprofielen van SPCA, voor en na te zijn onderworpen aan de geoptimaliseerde monster voorbereiding en reiniging stappen. Over het algemeen werd een hoge mate van smeren en een slechte scheiding van de eiwitbanden waargenomen op baan drie.

Dit profiel toont aan dat de monsters extractie reagens kunnen bevatten, en ook verontreinigingen zoals lipiden en cellulair puin. Echter, de SPCA monsters die werden gescheiden in supernatant en pellet, en vervolgens onderworpen aan de geoptimaliseerde protocol, resulteerde in voorbeeldige eendimensionale gel elektroforese profielen. De geoptimaliseerde methode voor snelle, robuuste en efficiënte eiwitextractie uit oculaire microschepen kan ook gemakkelijk worden toegepast op andere weefselgebaseerde monsters.

Hier worden eiwitprofielen getoond van de supernatant en de pellet van murinehersen en cardiale weefselmonsters. Tijdens een poging tot deze procedure is het belangrijk om te onthouden om de monsters te onderwerpen aan volledige homogenisatie, om de supernatant te scheiden van de pellet, en om de verontreinigingen en de extractie reagentia te verwijderen. Na de ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van experimentele en translationele oogheelkunde om het proteoom van osculaire vasculatuur grondig te onderzoeken met behulp van varkensogen als model.