Microsampling in gerichte massaspectrometrie-gebaseerde eiwitanalyse van eiwitten met een lage abundantie

Dit protocol geeft u een stap-voor-stap overzicht van hoe u kralen kunt voorbereiden voor affiniteitsopruiming en eiwitproteolyse en hoe u deze kunt gebruiken bij het bepalen van eiwitten met een lage abundantie uit gedroogde microsamples. Het belangrijkste voordeel is dat u de tools krijgt om zeer efficiënte bemonstering van complexe monsters uit zeer kleine volumes voor te bereiden en uit te voeren. Deze methode kan worden aangepast aan andere eiwitbiomarkers, zolang u toegang hebt tot efficiënte antilichamen om het eiwit of het proteotypische peptide te vangen.

U moet heel voorzichtig zijn wanneer u de pH aanpast voor zuurbehandeling van het antilichaam, vooral als u een klein volume kralen bereidt. Breng om te beginnen het gewenste volume antilichaamoplossing over naar een vijf-milliliter eiwitarme microcentrifugebuis en voeg een kleine magnetische roerstaaf toe aan de antilichaamoplossing. Gebruik een pH-meter met een micro-elektrode om de pH te meten en pas de pH aan door eerst 10 microliter eenmolair zoutzuur toe te voegen en vervolgens het volume te verminderen naarmate de pH 2,5 nadert.

Noteer het totale volume zoutzuur van één mol dat nodig is om de pH op 2,5 te brengen. Verwijder de micro-elektrode en incubeer het aangezuurde antilichaam op ijs op een magneetroerder gedurende een uur. Om de antilichaamoplossing te neutraliseren, meet u de pH en stelt u deze in op zeven door eerst 10 microliter natriumhydroxide met één mol toe te voegen en vervolgens het volume natriumhydroxide te verminderen naarmate de pH zeven nadert.

Noteer het totale volume toegevoegd natriumhydroxide van één mol. Meng de magnetische kraalsuspensie grondig op een vortexmixer en trek een volume op met de gewenste hoeveelheid kraalsuspensie. Om bijvoorbeeld een milliliter kraalsuspensie te bereiden, trekt u een volume op met 20 milligram kralen.

Plaats de kralenophanging gedurende één minuut op een magnetisch rek en verwijder het supernatant. Was de kralen twee keer met een gelijk volume type I water en meng met behulp van een vortexmixer na elke toevoeging van de wasoplossing. Plaats de oplossing vervolgens gedurende één minuut opnieuw op een magnetisch rek en verwijder het supernatant zoals eerder getoond.

Voeg zuurbehandeld antilichaam, 0,5-molaire boraatbuffer en koppelingsbuffer voor antilichaamkoppeling toe aan de magnetische kralen. Meng met behulp van een vortexmixer en roteer 's nachts op omgevingstemperatuur met behulp van een end-over-end monstermixer, bij voorkeur met wederzijdse rotatie en trillingen. Centrifugeer vervolgens gedurende 10 minuten op 239 g.

Plaats de buis gedurende twee minuten op de magneet en verwijder het supernatant. Na het wassen van de kralen, plaatst u de buis opnieuw op de magneet gedurende één minuut en volgt u dezelfde procedure om het supernatant te verwijderen. Bewaar dit in de gewenste buffer met behulp van de gewenste voorraadconcentratie van kralen in een koelkast.

Laat 10 microliter serum verzamelen in een volumetrische absorberende microsampling van 10 microliter, of VAMS, tip volgens de richtlijnen van de fabrikant, en droog aan de lucht bij omgevingstemperatuur gedurende ten minste twee uur. Verwijder het VAMS uit de houder en plaats het in een microcentrifugebuis met een laag eiwitgehalte van twee milliliter. Voeg 1.000 microliter 100-millimolaire ammoniumbicarbonaatoplossing toe en extraheer VAMS gedurende een uur bij 22 graden Celsius met behulp van een temperatuurgecontroleerde mixer bij 1.000 tpm.

Breng het extract over naar een nieuwe 1,5 milliliter eiwitarme microcentrifugebuis voor tryptische proteolyse. Voeg 30 microliter gewassen trypsineparels toe aan elk VAMS-extract om de spijsvertering te starten en incubeer gedurende twee uur bij 37 graden Celsius en 1.000 tpm met behulp van een temperatuurgecontroleerde mixer of iets dergelijks. Centrifugeer gedurende vijf minuten op 2.655 g en breng het supernatant over in een nieuwe microcentrifugebuis met een laag eiwitgehalte van twee milliliter.

Voeg 25 microliter van 14 nanogram per milliliter interne standaard, of IS, oplossing met het stabiele isotoop-gelabelde peptide toe in 100-millimolaire ammoniumbicarbonaatoplossing. Voeg twee 20 microliter gewassen magnetische kraalsuspensie toe aan elke eiwitarme microcentrifugebuis met een verteerd VAMS-extract en IS. Voer de immunoextractie gedurende één uur uit met behulp van een end-over-end monstermenger bij omgevingstemperatuur. Was de magnetische kralen door 500 microliter PBS toe te voegen met 0,05% polysorbaat 20.

Verwijder de eiwitarme microcentrifugebuis met kralen en wasoplossing uit het magnetische rek en keer voorzichtig om tot het homogeen is. Plaats vervolgens de eiwitarme microcentrifugebuis gedurende 30 seconden op de magneet, keer deze gedurende 30 seconden om en plaats deze gedurende één minuut opnieuw op de magneet. Verwijder de wasoplossing en was de magnetische kralen opnieuw met PBS, tris zoutzuur en ammoniumbicarbonaat.

Voeg 15 microliter 2% mierenzuur in type I-water toe aan elk monster en incubeer gedurende vijf minuten bij 22 graden Celsius en 1.000 tpm met behulp van een temperatuurgecontroleerde mixer of iets dergelijks om de gevangen peptiden te elueren. Nadat u het eluaat gedurende één minuut op de magneet hebt geplaatst, brengt u het over naar een nieuwe 1,5 milliliter eiwitarme microcentrifugebuis. Herhaal dit eenmaal en breng het tweede eluaat over naar dezelfde eiwitarme microcentrifugebuis als het eerste eluaat.

Voeg 20 microliter 100 millimolair ammoniumbicarbonaat toe aan elk eluaat. Centrifugeer het en breng 40 microliter van het eluaat over naar microinserts voor HPLC-injectieflacons. Stel in de instrumentsoftware de temperatuur van de kolomoven in op 25 graden Celsius en het debiet op 50 microliter per minuut.

Plaats vervolgens de monsters in de autosampler. Bereid een sequentie voor met de monsters die moeten worden uitgevoerd met behulp van de software die beschikbaar is voor het LC-MS/MS-systeem en stel het injectievolume in op 10 microliter. Druk op Run Sequence in de instrumentsoftware om de sequentie te starten en het piekgebied van het affiniteitsvastgelegde, ProGRP-specifieke, tryptische peptide en zijn IS vast te leggen. De massaspectrometrie, of MS, chromatogrammen van het proteotypische peptide en de IS na VAMS en gedroogde serumvlek, of DSS, bemonstering, evenals voor een spiked serummonster dat rechtstreeks in de extractieoplossing wordt toegevoegd, worden hier weergegeven.

De representatieve resultaten van de piekoppervlakteverhouding van het proteotypische ProGRP-peptide tot IS voor serummonsters met ProGRP en toegepast op VAMS, DSS of rechtstreeks op de extractieoplossing worden in deze figuur weergegeven. Uit deze resultaten kan worden afgeleid dat VAMS vergelijkbare oppervlakteverhoudingen biedt als het controlemonster, wat aangeeft dat er geen verlies aan het bemonsteringsmateriaal is, terwijl DSS een aanzienlijk lagere oppervlakteverhouding biedt, wat wijst op verlies van het bemonsteringsmateriaal. Een vergelijking van de basepiekchromatogrammen na intacte eiwitextractie en proteotypische epitooppeptide-extractie wordt in deze figuur weergegeven.

Wanneer u zelf antilichaam- of enzymgecoate kralen bereidt, kunt u de kralen aanpassen aan uw specifieke behoeften. Dit is relevant voor gerichte eiwitbepaling en globale proteomics-analyse. Gevoelige methoden voor eiwitbepaling uit VAMS en gedroogde bloedvlekken maken patiëntgerichte benaderingen zoals testen buiten het ziekenhuis mogelijk bij de follow-up van een breder scala aan ziekten.