Voorbereiding van menselijke weefsels ingebed in optimale snijtemperatuurverbinding voor massaspectrometrie-analyse

OCT is een cryoconserveringsmiddel dat niet compatibel is met massaspectrometrie-analyse. Met behulp van dit protocol kunnen onderzoekers OCT uit weefsels verwijderen en sfingolipiden kwantificeren met tandemvloeistofchromatografie massaspectrometrie. De voorbereiding van weefseldrogende lonten, weefselwassen en weefselweging zal worden gedemonstreerd door April Boyd van de Virginia Commonwealth University, en de lipide-extractie zal worden gedemonstreerd door Dr. Jeremy Allegood, directeur van de Virginia Commonwealth Metabolomics en Lipidomics Core.

Maak om te beginnen een chirurgische schaar schoon door ze gedurende vijf minuten onder te dompelen in methanol, gevolgd door ze af te vegen met een schoon weefsel van laboratoriumkwaliteit. Draai met poedervrije handschoenen het uiteinde van een weefsel van laboratoriumkwaliteit om een fijn taps toelopende lont van 30 tot 40 millimeter lang te creëren. Knip vervolgens met de methanol gereinigde schaar de lont aan het dikke uiteinde en plaats deze in een schone kartonnen doos.

Knip vervolgens met behulp van de methanol gereinigde schaar vier tot vijf millimeter van de punt van een pipetpunt van één milliliter en plaats de punt terug in de tiphouder. Om de OCT uit de weefsels weg te spoelen, voegt u 10 milliliter ijskoud ultrapuur gedeïoniseerd water toe aan elke buis met menselijk longweefsel en sluit u ze stevig af. Laat de buisjes 10 minuten incuberen.

Vortex elke buis krachtig totdat al het weefsel dat op de wanden van de buis of de weefselpellet is afgezet, volledig is geresuspendeerd. Centrifugeer vervolgens de buizen in een voorgekoelde zwenkbakcentrifuge op 4.000 tot 5.000 maal G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Zodra de centrifugatie is voltooid, sluit u de buizen op ijs af.

Zuig de wasoplossing voorzichtig op, laat ongeveer 0,5 milliliter van het supernatant in de buis achter en sluit de buis vervolgens opnieuw af. Nadat u het supernatant uit alle buizen hebt verwijderd, wast u de weefsels nog twee keer op dezelfde manier. Gebruik na de drie OCT-verwijderingswasbeurten de voorbereide verkorte pipetpunt om 500 microliter ijskoude PBS aan de buis toe te voegen.

Gebruik dezelfde punt, resuspendeer de pellet voorzichtig en breng al het geresuspendeerde weefsel over in een vooraf gelabelde en vooraf gewogen centrifugebuis van 1,5 milliliter. Houd de buis op ijs totdat alle weefselmonsters zijn overgedragen. Pelleteer de weefsels door de buizen in een voorgekoelde centrifuge te centrifugeren, aspirateer vervolgens voorzichtig zoveel mogelijk van de PBS zonder de pellet te verstoren en plaats de buizen terug op ijs.

Gebruik de eerder bereide weefseldrooglonten, verwijder voorzichtig de resterende wasoplossing, sluit vervolgens de buis en plaats deze op ijs. Om de buizen te wegen, plaatst u één buis tegelijk in een recent gekalibreerde geteerde en nulvormige analytische balans en sluit u de kamerdeur. Zodra het gewicht is gestabiliseerd, registreert u het in een elektronische spreadsheet.

Plaats na het wegen de buis weer op ijs en voeg 300 microliter ijskoude PBS toe. Breng met behulp van een verkorte pipetpunt voorzichtig al het weefsel over in twee milliliter ijskoude methanol in een vooraf gelabelde glazen buis met schroeftop. Laat vóór lipide-extractie de interne lipidennormen van weefsels en massaspectrometrie gedurende 20 minuten in evenwicht brengen tot kamertemperatuur, vortex en dompel de interne standaardoplossingen onder in een ultrasoon waterbad totdat de lipidenormen volledig zijn opgelost.

Voeg met behulp van een herhalende pipet 250 picomol van de interne massaspectrometriestandaarden toe aan elke buis en vat de buizen licht samen. Om homogenisatie te vergemakkelijken, past u het volume methanol aan op twee milliliter en tritureert u het weefsel vervolgens met behulp van een homogenisator door de homogenisatorpunt in een cirkelvormige beweging te bewegen die zachtjes tegen de buiswand wordt gedrukt. Wanneer klonten niet meer zichtbaar zijn, sluit u de buis opnieuw af.

Dompel de buis onder in een hoek van 45 graden in een ultrasoon waterbad gedurende 5 tot 10 seconden. Voeg vervolgens onder een zuurkast chloroform en methanol toe aan elke buis om een methanol-chloroform-waterverhouding van twee tot één tot 0,1 te bereiken. Sluit de buizen goed af en laat ze tot het einde van de dag op de benchtop liggen.

Voordat u die avond vertrekt, plaatst u de goed afgedekte buizen in een waterbad van 48 graden Celsius voor een nachtelijke incubatie. Pelleteer de volgende dag elk oplosmiddel en oplosbaar vuil door centrifugering. Decanteer vervolgens in een zuurkast het supernatant voorzichtig in vooraf gelabelde 13 in 100 millimeter borosilicaat glazen reageerbuizen die in een hoek van 30 tot 45 graden zijn gekanteld om het decanteren te vergemakkelijken.

Nadat u het supernatant uit alle buizen hebt gedecanteerd, gebruikt u een vacuümconcentrator op maximaal vacuüm met een eerste verwarmingsstap van een uur bij 40 graden Celsius om alle oplosmiddelen te verdampen en voegt u vervolgens 500 microliter methanol toe aan elke buis. Om de gedroogde lipide-extracten te resuspenderen, vortex de buis gedurende 5 tot 10 seconden en dompelt u de buis vervolgens onder in een ultrasoon waterbad in een hoek van 45 graden met rotatie gedurende twee minuten. Vortex de buis gedurende vijf seconden opnieuw en dompel opnieuw onder in het ultrasone waterbad gedurende een extra minuut.

Verwijder onoplosbaar vuil door centrifugeren en decanteer het supernatant vervolgens in een vooraf gelabelde injectieflacon met auto-injectoren die in een hoek van 30 tot 45 graden is gekanteld om het decanteren te vergemakkelijken. Sluit de injectieflacons goed af voordat u ze tot de analyse bij min 80 graden Celsius bewaart. Vloeistofchromatografie elektrospray ionisatie tandem massaspectrometrie analyse na OCT verwijdering bevestigt dat verschillende ketenlange soorten ceramiden en monohexosyl-ceramiden significant verhoogd zijn in menselijke longadenocarcinoomtumoren in vergelijking met normale aangrenzende niet-betrokken weefsels.

Sfingolipidenormen elueren sequentieel in de volgende volgorde:d17:1 sphingosine, d17:1 sphingosine-1-fosfaat, C12 lactosyl-ceramide, C12 monohexosyl-ceramide, C12 sfingomyelin en C12 ceramide. Voor elk van deze sfingolipidesoorten is er, met behulp van de gradiënt- en instrumentatie-instellingen in de tekst, een geschatte positieve verschuiving van 0,15 minuten in de retentietijd voor elke twee koolstoftoenames in ketenlengte. Langere kettinglange lipiden zoals C24 en C26 kunnen echter grotere retentietijdverschuivingen hebben.

Bovendien resulteert een dubbele binding in het vetzuur vaak in een negatieve verschuiving van 0,15 minuut in de retentietijd. C18:1 ceramide zal dus een retentietijd hebben die vergelijkbaar is met C16 ceramide. In plaats van bijna uitsluitend te vertrouwen op vers verzamelde weefsels, breidt dit protocol de weefselbronnen die kunnen worden gebruikt voor massaspectrometrie-analyse uit met die cryogenisch opgeslagen in biorepositories.