Laser Microdissection-Based Protocol voor de LC-MS/MS analyse van het proteomische profiel van Neuromelanine Granules
December 16th, 2021
Hier wordt een robuust protocol gepresenteerd voor het isoleren van neuromelaninekorrels uit menselijk post-mortem substantia nigra pars compacta weefsel via lasermicrodissectie. Dit herziene en geoptimaliseerde protocol minimaliseert massaal de vereiste tijd voor monsterverzameling, vermindert de vereiste monsterhoeveelheid en verbetert de identificatie en kwantificering van eiwitten door LC-MS / MS-analyse.
Onze combinatie van lasermicrodissectie en massaspectrometrie maakt het mogelijk om ruimtelijk opgeloste veranderingen op proteomisch niveau in elk soort weefsel te onderzoeken. In ons geval neuromelaninekorrels. Ons protocol maakt de proteomische analyse mogelijk op basis van beperkt monstermateriaal.
Wat meestal een grote uitdaging is bij het werken met postmortaal hersenweefsel. Omdat afzonderlijke cellen kunnen worden geïsoleerd om gezonde en ziekteomstandigheden op proteomisch niveau te vergelijken. Dit kan ons begrip van ziektemechanismen vergroten.
Plaats om te beginnen de weefselmembraanschuif in de diahouder op het robo-podium met het weefsel naar boven gericht. Om een overzichtsscan van het weefselgedeelte te verkrijgen. Gebruik de scanfunctie, selecteer het interessegebied linksboven en rechtsonder.
Selecteer vervolgens scan alle ROI's om de scan uit te voeren. Voor de automatische selectie van neuromelaninekorrels in het huidige gezichtsveld. Selecteer gezichtsveldanalyse.
Selecteer vervolgens het resultaat omkeren en stel de drempel in voor de RGB-kanalen. Zodat alleen neuromelaninekorrels rood worden gemarkeerd in het voorbeeldvenster. Klik nu op ok, om de aangepaste instellingen voor het gezichtsveld te gebruiken.
Pas de laserinstellingen aan met een deel van de dia dat alleen door het membraan wordt bedekt. Vul de buisdop van de monsterverzameling met 50 microliter ultrapuur water. En steek de dop in de collector van de robo mover.
Plaats met behulp van de software-interface de robo-verhuizer boven de robo-fase twee om het verzamelen van monsters te starten. Start de laser. Regel de energie- en focusinstellingen tijdens het laserproces en pas de instellingen indien nodig aan.
Zorg voor een goede isolatie en katapultatie van de geïsoleerde objecten in de buisdop van de monsterverzameling voor ten minste de eerste 10 objecten. Wanneer de bemonstering is voltooid, navigeert u de robo-verhuizer naar zijn beginpositie en verwijdert u de monsterverzamelingsbuis. Na het spinnen van de monsters door middel van centrificatie.
Droog de monsters gedurende 1,5 uur in een vacuümconcentrator. Na het uitvoeren van drievoudige spijsvertering zoals beschreven in de tekst. Bereid het monster voor op HPLC-MS-analyse door 200 tot 400 nanogram monsterpeptiden op te lossen in een gedefinieerd volume van 0,1% TFA.
In inerte massa spectrometrische glazen injectieflaconinlaten. Als de concentratiebepaling niet van toepassing is vanwege een lage hoeveelheid monster. Controleer de identieke monsterbelasting door de totale ionenstroom te vergelijken.
Om te beginnen met proteomische ruwe data-analyse. Klik op laden om de RAW-bestanden in de software te laden. Klik op experiment instellen om de voorbeeldnamen toe te wijzen.
Om groepsspecifieke parameters te definiëren. Voeg de modificaties toe door deamidatie NQ, oxidatie M en carbamidomethylatie N-term te kiezen als variabele modificaties. en voeg vervolgens carbamidomethylatie C toe als vaste modificatie.
Kies trypsine als verteringsenzym in het tabblad spijsvertering. Voeg in het tabblad labelvrije kwantificering de optie LFQ toe en als er meer dan 10 bestanden moeten worden verwerkt, kiest u de snelle LFQ-optie om de verwerkingstijd te verkorten. Ervoor zorgen dat alle andere groepsspecifieke parameters in de fabrieksinstellingen blijven.
Ga naar het tabblad Algemene parameters en voeg het FASTA-bestand toe dat is afgeleid van uniprot. org op het tabblad sequenties. Wijzig de id-regel dienovereenkomstig.
En voeg de taxonomie ID 9606 voor Homo sapiens toe. Kies voor eiwitkwantificering unieke en scheermespeptiden. Voeg vervolgens de iBAQ-optie toe als een maat voor eiwitkwantificering in het tabblad labelvrije kwantificering.
Zorg ervoor dat alle andere globale parameters in de fabrieksinstellingen blijven en klik op start. Nadat de analyse met succes is uitgevoerd, worden de eiwitgroepen opgehaald. txt-uitvoer.
Laad de eiwitgroepen. txt-bestand in de analysesoftware. Voeg de iBAQ-waarden toe als hoofdkolommen en sorteer alle andere kolommen op basis van hun type.
Filter lokvogels en verontreinigingen uit door rijen te filteren op basis van de categorische kolom en filterresultaten op basis van geldige waarden. Exporteer de uitvoer in txt-indeling voor verdere verwerking. En evalueer de resultaten met betrekking tot de onderzoeksvraag.
In deze studie werden 1.898 eiwitgroepen geïdentificeerd in NMG's en 1.565 in omringend SN-weefsel, waarvan 1.384 in beide weefselgebieden. Zo werden 514 en 181 eiwitgroepen uitsluitend geïdentificeerd in respectievelijk NMG's en SN-weefsel. In de representatieve DDA-metingen.
Iets hogere iBAQ-waarden in NMG's in vergelijking met SN duidden op een hogere abundantie van het eiwit cytoplasmatisch dynien-1, zware keten 1 in NMG's. Deze observatie kan worden geverifieerd in PRM-experimenten voor het peptide ESPEVLLTLDILK. Waarin een hogere abundantie in NMG's werd gedetecteerd.
Gebaseerd op het piekgebied op MS1- en MS2-niveau. De belangrijkste stap is veruit de isolatie van de NMG's, omdat de rest van het protocol op deze stap is gebaseerd om goed te worden uitgevoerd. Na de LMD-procedure kunnen de monsters worden gebruikt en verder worden verwerkt voor elke vorm van omics-techniek zoals genomics, transcriptomics, proteomics of lipidomics.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie presenteert een robuust protocol voor het isoleren van neuromelanine korrels uit humane post-mortem substantia nigra pars compacta weefsel met behulp van laser microdissectie. De geoptimaliseerde aanpak vermindert de tijd en hoeveelheid monster die nodig is voor de verzameling aanzienlijk, terwijl de eiwitidentificatie en -kwantificering via LC-MS/MS analyse wordt verbeterd.
Belangrijke Studie Componenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Proteomics
- Post-mortem hersenanalyse
Achtergrond
- Neuromelanine korrels zijn historisch gezien lastig geweest om te isoleren voor analyse.
- Traditionele methoden vereisen grotere monsters en langere verzamelingstijden.
- Laser microdissectie maakt nauwkeurige isolatie op single-cel niveau mogelijk.
- Dit protocol heeft tot doel het begrip van ziektemechanismen in neurologische aandoeningen te verbeteren.
Doel van Studie
- Het optimaliseren van de isolatie van neuromelanine korrels voor proteomische analyse.
- Het minimaliseren van monstervereisten en het verminderen van verzamelingstijd in post-mortem weefsel.
- Het verbeteren van de detectie van eiwitten gekoppeld aan gezondheids- en ziektetoestanden.
Gebruikte Methoden
- Laser microdissectie werd gebruikt om neuromelanine korrels uit menselijk hersenweefsel te isoleren.
- Het model omvatte post-mortem substantia nigra weefsel.
- Een gedetailleerde LC-MS/MS workflow werd geïntegreerd voor eiwitidentificatie.
- Inbegrip van cruciale stappen zoals geautomatiseerde selectie en aanpassing van laserinstellingen werd benadrukt.
- Proteomische analyse omvatte validatie tegen gevestigde eiwitkwantificeringsmethoden.
Belangrijkste Resultaten
- 1.898 eiwitgroepen werden geïdentificeerd in neuromelanine korrels, met verschillende expressiepatronen vergeleken met omliggend weefsel.
- Opmerkelijke bevindingen omvatten hogere iBAQ waarden in neuromelanine korrels voor specifieke eiwitten.
- De methode maakt vergelijking van gezonde versus zieke toestanden op proteomische niveau mogelijk.
- Deze studie benadrukt cruciale bevindingen met betrekking tot de eiwitsamenstelling in hersengezondheid en pathologie.
Conclusies
- De studie toont een gestroomlijnde aanpak voor het isoleren van neuromelanine korrels, waardoor proteomische analyses worden verbeterd.
- De geoptimaliseerde methode heeft significante implicaties voor het begrijpen van ziektemechanismen in neurologische aandoeningen.
- Verdere toepassingen kunnen leiden tot vooruitgang in klinische en onderzoeksomgevingen gericht op neuromelanine-gerelateerde pathologieën.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
Laser microdissection enables spatially resolved proteomic analysis of neuromelanin granules from limited post-mortem human brain tissue, addressing a key bottleneck in neurodegenerative disease research. This approach supports target validation and mechanistic de-risking by providing disease-relevant proteomic data from dopaminergic neurons affected in Parkinson's disease. The method enhances predictive confidence in early discovery by allowing direct comparison of healthy and diseased states at the protein level.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating neuromelanin granules for proteomic profiling in Parkinson's disease-relevant tissue.
- Operational Value: Reduces tissue requirements through unbiased, automated collection of granules, facilitating analysis of precious post-mortem samples.
- Scientific Value: Supports biological de-risking by identifying proteins exclusively enriched in neuromelanin granules versus surrounding substantia nigra tissue.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream omics workflows by yielding high-purity granule isolates compatible with LC-MS/MS.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through automated selection thresholds and consistent laser settings for granule isolation.
- Scientific Value: Enables reliable compound evaluation by providing quantitative proteomic outputs (iBAQ, LFQ) from disease-relevant neuronal compartments.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Discusses disease relevance by linking neuromelanin granule proteomics to neurodegenerative conditions like Parkinson's disease and dementia with Lewy bodies.
- Operational Value: Describes continuity from discovery through preclinical validation by enabling proteomic comparison of healthy versus disease conditions.
- Scientific Value: Focuses on predictive de-risking value by identifying differentially abundant proteins (e.g., cytoplasmic dynein-1 heavy chain 1) as potential translational biomarkers.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation to preclinical research by providing spatially resolved proteomic data from disease-affected neuronal populations.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling proteomic comparison of neuromelanin granules and surrounding substantia nigra tissue.
- Screening: Describes assay readiness through automated granule selection and reproducible sample collection for downstream LC-MS/MS analysis.
- Analytics: Highlights label-free quantification (LFQ) and iBAQ measurements that allow teams to compare protein abundance between conditions.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity by enabling proteomic profiling of human tissue relevant to Parkinson's disease pathology.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability for omics applications (genomics, transcriptomics, lipidomics) beyond proteomics.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in neurodegeneration research.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability through automated laser microdissection workflows.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in CNS target programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on disease-relevant proteomic signatures.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in laser microdissection operation and mass spectrometry-based proteomics.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs include UV laser microdissection systems and LC-MS/MS platforms.
- Cross-team standardization requirements for granule selection thresholds and sample preparation protocols.
- Adaptation considerations across model systems, including optimization of laser settings for different tissue types.
- Practical limitations include dependency on post-mortem tissue availability and potential protein degradation effects.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:46
Laser Microdissection and Pressure Catapulting
2:46
Sample Preparation for HPLC-MS and Proteomic Raw Data Analysis
5:10
Statistical Analysis
5:50
Results: Protein Identification in Neuromelanin Granules (NMGs) and Substantia nigra (SN)
7:00
Conclusion
