Morfologische en functionele evaluatie van het lint synapsen op specifieke frequentiegebieden van de muis cochlea

Het primaire rapport is echt stress belang van het nauwkeurig lokaliseren van de specifieke frequentie regio van de basilaire membraan in de meeste modellen, waar synaps nummers veranderd en functie kan worden geanalyseerd. De cochleaire lokalisatie van de specifieke frequentiegebieden wordt betrouwbaar uitgevoerd met behulp van frequentiekaarten in combinatie met cochleogramgegevens. De microscoop geeft inzicht in verschillende onderzoeken.

Het ondersteunt het idee dat de cochleaire neuropathie de primaire eerste gebeurtenissen is die specifiek voorafgingen aan gehoorverlies, tinnitus en hyperacusis. Na de bevestiging van een gebrek aan reactie op teen knijpen in een verdoofde acht weken oude volwassen C57 zwarte 6J mannelijke muis. Plaats de muis op een 37 graden Celsius warmtepad in een elektrisch en akoestisch afgeschermde ruimte.

Plaats vervolgens een onderhuidse 20 millimeter 28-meter naaldopname-elektrode, met de diepte van drie millimeter onder de huid op het hoekpunt van de schedel. Een referentie-elektrode in het ipsilaterale parotidgebied, onder de pinna van gemeten oor en een grondelektrode in het contralaterale parotidgebied. Plaats een gesloten veldluidspreker uitgerust met een twee centimeter plastic buis met een kegelvormige punt naast de muis en plaats de punt in de externe gehoorgang.

Voor een auditieve hersenstamrespons, of ABR-opname, genereren toonpitten bij afnemende geluidsdrukniveaus van 90 tot 10 decibel, in vijf tot 10 decibel geluidsdrukniveaustappen. Tijdens deze stap worden de antwoorden versterkt, gefilterd en gemiddeld. Bepaal bij elke frequentie de ABR-drempel, het minimale geluidsdrukniveau dat resulteert in een betrouwbare ABR-opname met een of meer te onderscheiden golven die duidelijk kunnen worden geïdentificeerd door visuele inspectie.

Na de ABR-opname, bloot de bulla van de ventrale kant en open de bulla met een scherpe schaar om toegang te krijgen tot het slakken. Met behulp van fijne tangen, verwijder de tijdelijke botten en verbreken de stapes slagader. Verwijder vervolgens de stapes uit het ovale venster en scheur het ronde raammembraan.

Draai voorzichtig de punt van een 13 millimeter 27-meter naald om een klein gaatje te maken aan de top van het slakkenvlies, voordat u een fijne gekantelde pipet gebruikt om 4%paraformaldehyde voorzichtig door het raam in de perilymphatische ruimten te spoelen. Spoel vervolgens de botten drie keer gedurende vijf minuten per wasbeurt met koude verse 0,1 molaire PBS per wasbeurt. Gevolgd door ontkalking van de botten met 10%EDTA gedurende vier uur bij kamertemperatuur en 20 rotaties per minuut op een horizontale shaker.

Breng aan het einde van de incubatie een ontkalkt tijdelijk bot over in verse 0,1 molaire PBS onder een ontledende microscoop. Gebruik 3 en 5 Dumont tangen en een 27-meter naald om op hun beurt de apicale, middelste en basale slakkenagebieden te ontleden. Gebruik een scheermesje om een kleine reeks sneden langs de spiraalligament te maken en verwijder tectorial membraan en Reissner's membraan.

Ontleden verder het resterende auditieve epitheel, met inbegrip van de spiraalvormige limbus, in individuele cochleaire bochten voor hele mount preparaten. Gebruik vervolgens de 40X oliedoelstelling van een lichtmicroscoop om de basilaire membraanlengte te meten met een schaal van 250 micrometer die in het oogstuk is geplaatst. Het kan worden aangepast langs de stereocilia van de binnenste haarcellen.

Na dissectie, plaats elke cochleaire beurt in individuele 2,5 milliliter centrifuge buizen. Blokkeer elke niet-specifieke binding met 10% geitenserum in PBS in 0,1%Triton X-100 gedurende een uur bij kamertemperatuur op een rotator. Gebruik aan het einde van de incubatie 200 microliter pipetpunt om de oplossing onder een dissectiemicroscoop te verwijderen.

Incubeer de specimens met de primaire antilichamen van belang verdund in 5%geitenserum en PBS in 0,1%Triton X-100 's nachts bij 4 graden Celsius op een rotator. De volgende ochtend, spoel de weefselmonsters drie keer gedurende vijf minuten met koude 0,1 molaire PBS per was om eventuele resterende primaire antilichamen te verwijderen. Label vervolgens de monsters met de juiste secundaire antilichamen verdund in 5%geitenserum in PBS in 0,1%Triton X-100 gedurende twee tot drie uur bij kamertemperatuur op de rotator, beschermd tegen licht.

Aan het einde van de incubatie, was de monsters drie keer met 0,1 molaire PBS zoals aangetoond en breng de monsters in individuele 35 millimeter platen met 0,1 molaire PBS. Plaats een druppel DAPI-aangevuld montagemedium op de glijbaan en breng de exemplaren van PBS naar het montagemedium. Plaats een rand van een deksel slip op elke dia en laat om de cover slips zachtjes vallen.

Droog vervolgens de dia's in een diavak op vier graden Celsius 's nachts. Om de monsters in beeld te brengen, gebruikt u een confocale microscoop met de juiste lasers en 63X olieonderdompelingslens met hoge resolutie om acht micrometer confocale Z-stapels van elke cochleaire draai te verwerven. Voor synaptische puncta telt, stel de Z-stapels met de 0,3 micrometer stap grootte om de gehele lengte van de binnenste haarcellen overspannen, verzekeren van alle synaptische puncta kan worden afgebeeld en voeg de puncta met afbeeldingen in een Z-stack om de Z-toegang projectie te verkrijgen.

Importeer de samengevoegde afbeeldingen in een geschikt softwareprogramma voor beeldverwerking. Verdeel het synaptische totaal aantal in elke Z-stack op specifieke frequentiegebieden door het aantal DAPI-positieve binnenhaarcellen om het aantal synaptische puncta voor elke cel te berekenen. Bij elk specifiek frequentiegebied, gemiddeld alle synaptische puncta in drie beelden van verschillende microscopische velden, met negen tot 11 binnenhaarcellen.

Om de cytoskeletale architectuur en synaptische lokalisatie beter te visualiseren, gebruikt u het penseelgereedschap om de synaptische structuur en verdeling van de afzonderlijke binnenhaarcellen visueel te beoordelen. Om de nevenschikking van presynaptische linten en postsynaptische receptorpatches te inspecteren, gebruikt u het rechthoekige selectiekadergereedschap de voxelruimte rond de linten en gebruikt u afbeeldingsknippen om de afzonderlijke linten te isoleren. Klik vervolgens op afbeeldings- en afbeeldingsgrootte om een miniatuurarray van deze miniatuurprojecties te verkrijgen die kunnen worden gebruikt om gekoppelde synapsen versus weeslinten te identificeren.

Alle tien muizen in dit representatieve experiment vertoonden ABR-drempels in reactie op toonuitbarstingen variërend tussen 25 en 70 decibel per geluidsdrukniveau, afhankelijk van de frequentie van de stimulus. De gehoordrempel voor dit experiment was het laagst met 16 kilohertz, wat overeenkomt met een ongeveer 43% van de afstand tot de cochleaire top, wat erop wijst dat de akoestische gevoeligheid in andere cochleaire gebieden aanzienlijk wordt verminderd. Hele mounts van het auditieve epitheel wordt in drie stukken ontleed en de lengtes worden gemeten en omgezet in hun procenten afstand van de cochleaire top.

De frequentielocatie op het basilaire membraan van elke cochleaire draai wordt berekend met behulp van logaritmische functie. In normale oren van volwassen muizen, immunostaining onthult naast elkaar geplaatste paren van synaptische linten en glutamaat receptor patches. Het bestuderen van het oppervlak van het basolaterale membraan van de binnenhaarcellen, met acht tot 20 paren per cel.

Hoewel de overgrote meerderheid van de puncta verschijnen als naast elkaar geplaatste paren in normale oren, worden weeslinten zelden waargenomen bij hoge vergrotingen. Het aantal binnenste haarcel lint synapsen is het hoogst op de 16 kilohertz regio en aanzienlijk afneemt als de afstand tot deze locatie toeneemt. Het belangrijkste om te onthouden tijdens deze procedure is dat men de integriteit van cochleair basaal membraan moet garanderen.

We moeten de nauwkeurigheid benadrukken totdat de technische vaardigheid is bereikt. Na deze procedure kan de gentherapie worden uitgevoerd om te beantwoorden of de cochleaire neuropathie met deze maatregel kan worden hersteld. Deze maatregel is een bredere techniek voor het verkennen van cochleaire neuropathie, die als de primaire eerste gebeurtenissen associëren met het hebben van gehoorverlies, tinnitus, en hyperacusis.