In vivo toepassing van het systeem van de afstandsbediening voor de manipulatie van de endogene genexpressie

De betekenis van onze methode is de veelzijdigheid en potentie. Het stelt onderzoekers in staat om robuuste controle over endogene genexpressie hebben op manieren die zijn uitdagend om te bereiken met behulp van bestaande methoden. Het stelt onderzoekers in staat om de functie van een gen te onderzoeken op verschillende expressieniveaus en op een spatio-temporele manier.

Zo maakt het mogelijk om de omkeerbaarheid van een fenotype te testen, wat handig is bij het bestuderen van ziektegerelateerde genen. Om repressie te bereiken, is het doelgenintron ontworpen om repron R te bevatten, die 12 symmetrische lacoperators bevat. Wanneer de LacIGY-repressor wordt uitgedrukt uit de gewenste weefselspecifieke promotor, wordt het doelgen onderdrukt.

De onderdrukking van het doelgen kan aan het gewenste uitdrukkingsniveau door beleid van IPTG, een antagonist van de repressor LacIGY worden omgekeerd of worden aangepast. Om upregulation te bereiken, is de beoogde genpromotor ontworpen om vier of meer Tat-operators, T, te bevatten als bindende locaties voor de rtTA-M2-activators. Wanneer de activator wordt uitgedrukt uit de gewenste weefselspecifieke promotor in aanwezigheid van doxycycline, wordt upregulatie van het doelgen geïnduceerd.

Upregulatie van het doelgen kan worden teruggedraaid of aangepast aan het gewenste expressieniveau door de concentratie van doxycycline in te trekken of te wijzigen. Om zowel repressie als activering te bereiken, kunnen de Lac-drukpers- en Tat-activatorsystemen worden gecombineerd. Om het gen van belang voor repressie te wijzigen, moet een transcriptionally inert intron naar het vijfprimeeind van het gen van belang worden geïdentificeerd voor het inbrengen van de repronsequentie.

Om de genomische sequentie voor het gen van belang te verkrijgen, navigeer je naar de UCSC genoombrowser en selecteer je het nieuwste ontwerp van het muisgenoom onder het tabblad genomen. Voer de naam of het symbool van het gen van belang in de zoekbalk in om de transcripties voor het gen te bekijken en klik op gaan. Selecteer vervolgens de gewenste transcriptievariant voor het gen van belang en klik op het gensymbool naast de transcriptievariant van belang.

Klik vervolgens onder de reeks en koppelingen naar de banner tools en databases op de genomische sequentiekoppeling. Selecteer alleen exonen, introns en de standaardoptie FASTA-record per gen voor opties voor het ophalen van reeksen. Voor sequencing-opmaakopties selecteert u exonen in hoofdletters, al het andere in kleine letters en masker herhalingen naar N.Klik vervolgens op Verzenden.

Sla ten slotte deze reeks op, waarbij de opmaak in de bovenste en onderste letters behouden blijft in een document of programma dat kan worden geannoteerd. Om onderbreking van de CpG-eilanden te voorkomen, selecteert u de show voor het cpg-eilandenspoor onder de expressie- en regelgevingsbanner van de UCSC-genoombrowser en klikt u op vernieuwen. Inzoomen op de vijf prime introns, klik op elk CpG-eiland dat in het groen wordt weergegeven en selecteer DNA bekijken voor deze functie.

Na het selecteren van masker herhalingen naar N, klik op DNA om de CpG eilanden sequentie te verkrijgen. Tot slot, overlay deze sequenties met de oorspronkelijke sequentie bestand, en annoteren deze als intronic regio's te vermijden. Als u intronic-gebieden met versterkerhandtekeningen in de weefsels van belang wilt vermijden, gaat u naar de ENCODE-database en selecteert u het pictogram experimenten.

Selecteer voor het testtype ChiP-seq of DNase-seq en vul de andere categorieën in op basis van de cellen die moeten worden ontworpen. Selecteer na functieselectie het meest linkse pictogram in het blauw, waarvoor de resultaten worden weergegeven als lijst. Selecteer vervolgens de gegevenssets voor de doelen van h3k4 monomethylatie, h3k27-acetylatie, DNase 1 en CTCF die het meest overeenkomen met de cellen die moeten worden ontworpen.

Schuif in elke relevante gegevensset naar de bestandssectie, controleer of de mm10 en UCSC zijn geselecteerd en klik op de knop Visualiseren. Zoom nu in de UCSC genoombrowser in op de vijf priemgetallen en klik op elke piek in de geannoteerde pieksporen. Verkrijg de DNA-sequentie voor elk piekgebied door op de chromosomale coördinaten voor elke piek te klikken.

Selecteer in het vervolgkeuzemenu weergave DNA en klik op maskerrehals naar N.Ten slotte overlay deze sequenties met het oorspronkelijke sequentiebestand en annoteren deze als intronic-gebieden om te vermijden. Om een sgRNA te identificeren in de resterende intronic regio's met een hoge specificiteit en voorspelde efficiëntiescores, navigeer je naar een online sgRNA-ontwerptool naar keuze, zoals CRISPOR. Voer de volgorde van het intronic-gebied van belang in, geef het relevante referentiegenoom op en selecteer het gewenste naast elkaar motief protospacer.

Klik vervolgens op verzenden. Sorteer vervolgens de voorspelde sgRNA's op specificiteitsscore en selecteer een of meer sgRNA's die ook een hoge voorspelde efficiëntiescore hebben. Tot slot, ontwerp een DNA-sjabloon met een PITT landingsplatform sequentie geflankeerd aan beide zijden door 60-base homologie armen die overeenkomen met de sgRNA cut site.

Voor omkering van de onderdrukking van doelgen, beheren IPTG in het drinkwater van de homozygoot gefokte muizen met de gewijzigde allel van belang door volledig oplossen van de gewenste hoeveelheid IPTG in steriel gedestilleerd water op de dag van toediening. Wikkel de fles met folie en beheer het IPTG-water in een licht beschermde fles aan de muizen van het juiste genotype en controleert gedurende ten minste een week. Ga over tot het analyseren van de expressie van het gen van belang in het doelweefsel.

Om de gen upregulatie te induceren, toedient doxycycline in het dieet voor een week en ga over tot het analyseren van de expressie van het gen van belang in het doelweefsel. qRT PCR anaylisis toonde aan dat DNMT1 expressie werd onderdrukt tot 15% van de niet-gereglementeerde niveaus met behulp van de promotor-gebaseerde aanpak. De repressie werd op een dosisafhankelijke manier teruggedraaid door muizen met verschillende hoeveelheden IPTG te behandelen.

De waargenomen DNMT1-onderdrukking en de omkering van DNMT1-onderdrukking door IPTG-behandeling werden op eiwitniveau gevalideerd door immunostaining. qRT PCR-analyse van mKate2-expressie toonde aan dat de intron-gebaseerde aanpak meer dan 90% repressie bereikte van exploitanten die zich meerdere kilobases stroomafwaarts van de transcriptiestartsite bevonden door transcriptieverlenging te verzachten. Confocale beelden van de mKate2 expressie in de kleine intenstine van de muizen met of zonder de LacIGY onderdrukker valideerden de intron-gebaseerde aanpak.

Robuuste upregulatie en downregulatie van DNMT1 expressie werden bereikt in embryonale stamcellen met de gewijzigde endogene DNMT1 allel met Tat en Lac operator sequenties. Beide voorschriften waren volledig omkeerbaar en induceerbaar door IPTG en Dox behandelingen. Sterke upregulatie van DNMT1 werd waargenomen vanuit de lever, milt en nier.

Er werd echter geen detecteerbare upregulatie in het hart waargenomen, wat suggereert dat het celcyclusafhankelijke expressiepatroon van DMNT1 en de schaarste van proliferative cellen in het hart aan deze observatie kunnen ten grondslag liggen. Het bestuderen van de in vivo functie van een kritisch gen door het manipuleren van de expressie is vaak uitdagend als gevolg van letaliteit. Onze methode stelde ons in staat om het dodelijke fenotype voor ons gen van belang te overwinnen en stelde ons in staat om zijn rol in tumorogenese in vivo te bestuderen.

Ook deze technologie zal het mogelijk maken onderzoek van andere essentiële genen die moeilijk te bestuderen.