AAV-implementatie van enhancer-gebaseerde expressieconstructies in vivo in muizenhersenen

Dit protocol is belangrijk omdat het visualisatie mogelijk maakt van niet alleen of een enhancer-reeks expressie kan stimuleren, maar ook waar het expressie in een bepaald deel van het lichaam kan stimuleren. Het is snel. De injecties duren minder dan 10 minuten om te voltooien, en of en waar een reporter-gen tot expressie komt, is binnen enkele dagen na het verzamelen van monsters te zien.

Als u wilt beginnen met klonen, kiest of ontwerpt u een reporterconstructie. De hier gebruikte constructie plaatst de enhancer-kandidaat in het drie belangrijkste onvertaalde gebied van een EGFP-reportergen dat tot expressie komt onder controle van de minimale hsp68-promotor. Om de PCR-primers te ontwerpen voor het versterken van een reeks van interesses en klonen in de vector, voegt u de juiste homologiearm voor Gibson-klonen toe aan het vijf priemeinde van de primers.

Voer met behulp van de ontworpen primers PCR uit een DNA-monster uit. Verwerk één tot 10 microgram vector-DNA met Pac1 en Asc1, afhankelijk van het gewenste aantal vereiste kloonreacties. Door 0,7 tot 1% gel-elektroforese gedurende 30 tot 60 minuten bij 100 volt te gebruiken, scheidt u de restrictie-digestfragmenten.

Extraheer de band voor de gelineariseerde vector en zuiver deze met een commerciële gelextractiekit. Zodra het Gibson klonen en transformeren van cellen is voltooid, plaatst u de cellen op selectieve media en incubeert u 's nachts bij 37 graden Celsius. Na verificatie van het succesvol klonen van de reporterconstructie, ent u vijf milliliter van de startercultuur met behulp van de glycerolvoorraad.

Kweek de kweek gedurende acht tot 16 uur in een schuddende incubator bij 30 graden Celsius en 180 rotaties per minuut. Terwijl de bouillon troebel wordt, verdunt u de startercultuur 1.000x in 250 tot 300 milliliter verse selectieve LB-bouillon en incubeert u deze een nacht in een schuddende incubator bij 30 graden Celsius en 180 rotaties per minuut. Gebruik een commerciële plasmide maxi kit om het plasmide te zuiveren.

Om te testen op de recombinatie van de ITR's, voert u een Xma1-vertering uit. Visualiseer de banden. Zorg ervoor dat je digest het verwachte aantal banden weergeeft.

Recombinatie zal resulteren in minder dan verwachte banden. Bereid recombinant AAV-mengsel voor levering. Als u de expressiepatronen van meerdere enhancer reporter-virussen vergelijkt, verdunt u elk virus om de virustiters gelijk te stellen aan het minst geconcentreerde virus.

Meng het enhancer reporter-virus en constitutief uitgedrukt controlerapportervirus in een verhouding van twee tot één of drie op één. Voeg een kleine hoeveelheid snelle groene kleurstof toe met een uiteindelijke concentratie van 0,06% Breek de punt van een getrokken glazen pipet gemaakt van een microliter-gegradueerde capillaire buis door deze voorzichtig in een delicaat, pluisvrij doekje te prikken. Plaats de pipet in een aspiratorassemblage met een drukapparaat dat is aangesloten op een rubberen pakking voor het vasthouden van een microcapillaire pipet.

Trek een klein volume van ongeveer 0,2 tot 0,5 microliter minerale olie in de pipet door negatieve druk uit te oefenen door de aspirator. Houd de aspirator opzij en plaats het virus op ijs totdat het klaar is om te injecteren. Na cryo-anesthetische de neonatale muizen, oefent u negatieve druk uit met behulp van de aspiratorassemblage en trekt u het virusmengsel in de getrokken glazen pipet totdat de meniscus het vinkje van twee microliter passeert.

Haal de muis uit de buurt van de koude kamer en plaats hem op de bovenkant van de bank. Lokaliseer de bilaterale injectieplaatsen halverwege tussen lambda en bregma, evenals de sagittale hechting en elk oog. Ontsmet ze met een alcoholdoekje.

Prik de schedel van de neonatale muizen door met behulp van de getrokken glazen pipet. Als de naald de schedel binnendringt, oefent u een positieve druk uit door de aspiratorassemblage. Doseer één microliter van het virus in de laterale ventrikel en trek de pipet terug.

Plaats de muis op een verwarmingskussen of een verwarmingskamer om te herstellen. Breng het dier terug naar de thuiskooi zodra het wakker is geworden. Neem fluorescentiebeelden op die het hersengedeelte overschrijden met behulp van een 5x subjectieve lens met lage vergroting.

Door de injectieplaats te lokaliseren, evalueert u de mate van virustransductie, afhankelijk van de dichtheid en intensiteit van rode fluorescerende cellen. Vergelijk de dieren die op dezelfde manier werden getransduceerd. Neem fluorescerende beelden op met een lens met een hoger vergrotingsobjectief van meer dan 25x.

Open vervolgens de analysesoftware en pas een mediaanfilter van drie bij drie toe om ruis te verminderen. Klik op het menu Proces, klik vervolgens op Ruis en kies de optie Despeckle. Als u vervolgens de achtergrondfluorescentie van de afbeeldingen wilt aftrekken, begint u met het scheiden van de kanalen van een meerkanaalsafbeelding.

Klik op het menu Afbeelding, klik vervolgens op Kleur en selecteer de optie Kanalen splitsen. Teken met het gereedschap rechthoek of cirkelselectie een kleine vorm in een gebied van de afbeelding zonder fluorescerende cellen. Meet de gemiddelde pixelintensiteit van de achtergrond door op Analyseren en vervolgens Meten te klikken en herhaal om meerdere keren te samplen.

Gemiddelde van de gemiddelde grijswaarde van vijf tot acht achtergrondgebieden en verlaag de decimale waarden. Trek de waarden van elke pixel in de afbeelding af door het menu Proces te selecteren en klik vervolgens op Wiskunde en aftrekken. Voer vervolgens de achtergrondwaarde in die u wilt aftrekken en klik op OK. Voeg indien nodig de kanalen weer samen tot een meerkanaalsafbeelding door het menu Afbeelding te selecteren, klik vervolgens op Kleur en selecteer Kanalen samenvoegen.

Als u het aantal groene fluorescerende cellen wilt tellen, verbergt u het groene kanaal en tekent u een vorm rond het hersengebied die rode fluorescentie tot expressie brengt met behulp van het gereedschap voor het selecteren van vrije vorm. Klik op de functie Meten om het gebied, de geïntegreerde dichtheid en de gemiddelde grijswaarde van het rode kanaal in de geselecteerde zone te meten. Tel het aantal groene cellen met behulp van een meerpuntsselectietool en normaliseer het aantal groene cellen door de geïntegreerde intensiteit van het rode kanaal.

Na het transduceren van de enhancer reporter dat de muis intracraniaal op P0 injecteerde met een positief AAV-construct vertoonde enhancer-gedreven EGFP-expressie in de middelste onderste lagen van de cortex 28 dagen na injectie. De muis geïnjecteerd met een negatief controleconstruct op P0 vertoont 28 dagen na injectie geen enkele expressie van EGFP, wat aantoont dat de enhancer-elementen de transcriptie van EGFP in de muizenhersenen blijken te stimuleren. Om het succesvol getransduceerde gebied en de controle op potentiële variabiliteit te visualiseren, werden AAV-geleverde enhancer reporter-bibliotheken van verschillende titers onderzocht.

De hoge titerbibliotheek van kandidaat-versterkers stimuleert brede EGFP-expressie, terwijl de lagere titerbibliotheek van kandidaat-versterkers schaarse CGFP-expressie in het P7-muizenbrein stimuleert. Het is van vitaal belang om de enhancer reporter AAV te mengen met de positieve controle bij elke injectie om onderscheid te maken tussen versterkers zonder activiteit en mislukte leveringen. Deze procedure kan worden gecombineerd met immunohistochemie, RNA FISH of eencellige RNA-sequencing om te bepalen in welke celtypen een versterker actief is.