Lentivirale Vector Platform voor de efficiënte levering van Epigenome-bewerkingsgereedschap in mens geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige ziekte modellen

Lentiviral vector platform hebben een groot voordeel ten opzichte van de meest populaire vector platform, met name vanwege het vermogen van lentivirale vectoren om grotere genetische insert tegemoet te komen. Het lijkt er dus op dat de lentivirale vector het platform van keuze zou zijn in de toepassing waarbij CRISPR/Cas-gereedschappen worden geleverd. Deze techniek imiteert het natuurlijke regulerende mechanisme van alfa-synuclein expressie die bij verminderde worden geassocieerd met ziekte.

Het maakt fine-tuning van het expressieniveau versus robuuste veranderingen in genexpressie mogelijk. Ik zou sterk aanbevelen het valideren van deze of soortgelijke benaderingen met behulp van meerdere gids RNAs voor screening. Er is grote variabiliteit in gids RNA potentie.

De enige manier om het te bepalen is er robuuste en uitgebreide screening en validatie. Het ontwikkelde systeem kan eenvoudig worden aangepast aan andere modelsystemen, zoals diermodellen, waaronder knaagdieren en niet-menselijke primaat. Deze follow-up experiment zou kunnen dienen als een proof of concept voor toekomstige klinische studies.

Het aantonen van de procedure zal Dr.Ekaterina Ilich, een senior medewerker in mijn lab, gericht op de uitvoering van moleculair klonen procedure voor het creëren van Lentiviral Vector Plasmids in verband met dit project. Ze zal ook de belangrijkste stappen laten zien die betrokken zijn bij de productie van lentivirale vectoren. Ook het aantonen van de procedure zal dr.Lidia Tagliafierro, een postdoc van mijn lab gericht op de differentiatie van menselijke iPS cellen in pathologische relevante cellen.

Ze zal de belangrijkste stappen in de oprichting van tests demonstreren om de methylatieprofielen van synuclein intron1 te evalueren. Ahila Sriskanda, een medewerker in mijn lab gericht op de cultuur van de menselijke iPS cel-afgeleide neurale voorloper cellen. Om te beginnen ontwikkelt u het DNMT3A-katalytische domein van de d-Cas9-DNMT3A-GFP door het DNMT3A-gedeelte van de vector te versterken.

Na het verteren van de DNMT3A fragment met behulp van een BamH1 beperking enzym. Cloat het in de BamH1 site van de gemodificeerde PBK-301 vector die d-Cas9 draagt en geverifieerd door directe Sanger sequencing, om het zuivere Meissen reporter gen en het resulterende plasmid te vervangen door GFP digest d-Cas9-DNMT3A-P2A pure Meissen en plasmid door FSC 1. Zuiver het vectorfragment met behulp van een gelzuiveringsmethode.

Bereid de wisselplaat voor door PBK-201 te verteren met FSC-1. Kloon het FSC 1-fragment in de vector om d-Cas9-DNMT3A-P2A-GFP te maken. Coat 15 centimeter platen met 0,2%gelatine voor de transfectie en wacht 10 minuten.

Dan aspirate de gelatine en voeg 22,5 milliliter hoge glucose medium en 2,5 milliliter van eerder gekweekte HEK-293T celsuspensie. Incubeer de platen bij 37 graden Celsius met 5%CO2 tot het bereiken van 70 tot 80%samenvloeiing. Om de plasmid mix voldoende voor 115 centimeter plaat te bereiden gebruik maken van de vier plasmiden beschreven in het manuscript.

Voeg 312,5 micro liter calciumchloride toe aan dezelfde buis van 15 milliliter met de plasmiden en breng het uiteindelijke volume op 1,25 milliliter met steriel dubbel gedestilleerd water. voeg voorzichtig 1,25 milliliter van twee X BBM-oplossing drop verstandig aan de buis tijdens het vortexen. Incubeer gedurende 30 minuten op kamertemperatuur.

Aspirate het medium uit de cellen en voeg 22,5 milliliter vers bereide hoge glucose DMEM zonder serum. Voeg 2,5 milliliter van het transfectiemengsel verstandig op elke plaat. Draai de platen en incubeer bij 37 graden Celsius met 5%CO2 gedurende twee tot drie uur na incubatie voeg 2,5 milliliter serum per plaat toe om 's nachts 10% verdunning en incubaat te bereiken bij 37 graden Celsius met 5%CO2.

Om het virus te oogsten verzamel je de supernatant van alle transfected cellen en trek ze in 50 milliliter conische buizen. Centrifuge op 400 tot 450 g gedurende 10 minuten op kamertemperatuur en vervolgens filteren de supernatant door 0,45 micrometer vacuümfilter eenheid. Maak vervolgens een sacharose gradiënt door de voorbereiding van conische ultra centrifugatie buizen.

Voeg voorzichtig de gefilterde supernatant toe aan het verloop door de virale supernatant gelijk te verdelen onder elke ultracentrifugatiebuis die ten minste drie kwart van elke buis vult. Centrifugeren de monsters op 70000 g gedurende twee uur bij 17 graden Celsius. Verzamel voorzichtig 30%tot 60% sacharosefracties in schone buizen voeg koude 1X PBS tot 100 milliliter van het totale volume en pipet meerdere keren te mengen.

Voeg voorzichtig vier milliliter van 20% sacharose in 1X PBS toe aan elke buis om het virale preparaat te stratificeren, ga verder door ongeveer 20 tot 25 milliliter van de virale oplossing per buis te pipetten. Breng de buizen zorgvuldig in balans en vercentrifugeren vervolgens twee uur lang op 70000 g bij 17 graden Celsius. Zorgvuldig aanzuigen de resterende vloeistof om volledig te verwijderen van alle vloeistof verlaten van het virus met pellets die nauwelijks zichtbaar zijn als kleine doorschijnende vlekken.

Na het legen van de supernatant omkeren de buizen op papieren handdoeken om de resterende vloeistof te laten uitlekken. Voeg 70 micro liter 1X PBS toe aan de eerste buis en laat de pellet grondig opschorten. Breng de vering naar de volgende buis en herhaal met pipetten en overbrengen totdat alle pellets opnieuw zijn opgehangen.

Voeg nog eens 50 micro liter 1X PBS toe aan de eerste buis en meng om het te wassen. Breng vervolgens de suspensie over naar de tweede buis om te wassen en verder te gaan met wassen en overbrengen zoals voorheen, wat ongeveer 120 micro liter van de licht melkachtige uiteindelijke suspensie oplevert. Centrifuge op 10000 g gedurende 60 seconden om een duidelijke schorsing te verkrijgen breng de supernatant naar een nieuwe buis en maak vijf micro liter aliquot en bewaar ze op negatieve 80 graden Celsius plaats een Cryovial met MD NPC in 37 graden Celsius warmteblok gedurende twee minuten en breng de ontdooide cellen naar een 15 milliliter conische buis met 10 milliliter van warme DMEM-F12.

Centrifuge op 300 g gedurende vijf minuten. Aspirate de supernatant en opnieuw opschorten de cellen in twee milliliter van voorverwarmde complete N2B2 medium. Voeg twee milliliter N2B27 toe aan de celsusopening en plaat twee milliliter cellen in elke put van de eerder bereide BMM gecodeerde zes putplaat.

Incubeer de cellen op 37 graden Celsius met 5% CO2 's nachts. Wanneer MD NPC's op 70% samenvloeiing zijn, vermengen ze door twee microliters lentivirusgeleiding RNA d-Cas9-DNMT3A-vectoren toe te voegen en de plaat zachtjes te wervelen. Na het uitbroeden van de cellen onder dezelfde omstandigheden als voorheen gedurende 16 uur vervangen de N2B27 medium 48 uur na de transductie.

Voeg N2B27 met vijf microgram per milliliter zuivere Meissen toe om de stabiele MD NPC-lijnen te verkrijgen, laat de cellen drie weken groeien in N2B27 plus pure Meissen om het methylatieprofiel van SNCA intron 1 te karakteriseren. Haal eerst DNA uit elke stabiele transducercellijn met behulp van een DNA-extractiekit en gebruik vervolgens 800 nanogram DNA om een bisulfideconversie uit te voeren met een commercieel beschikbare kit en vervolgens een de bisulfide omgezet DNA naar 20 nanogram per micro liter. Voor de pyro-sequencing analyse bereidt de PCR master mix in een kernvrije buis overdracht van de reactieplaat naar een thermo-cycler en start de PCR.

Visualiseer de amplicons met behulp van twee micro liter PCR product met een 30 en bromide kleuring na Agarose gel elektroforese. Voor pyro-sequencing tests gebruikte mengsels van onmethhyleerde en gemethyleerde door sulfide omgezet DNAs en pyro-sequencing reagentia zoals beschreven in het manuscript. Bereken de methylatiewaarden voor elke CPG-site met behulp van pyro-sequencing software fysieke opbrengsten van Lentivirus d-Cas9-DMMT3A-GFP vector en de Naïeve GFP vector gegenereerd met behulp van dit protocol zijn vergelijkbaar.

Dit suggereert dat het nut van de geoptimaliseerde vectorbackbone in combinatie met het geoptimaliseerde productieprotocol resulteert in hoge opbrengsten die strakker zijn van de CRISPR-dCas9 vectortransductiesnelheden van de Lentivirus d-Cas9-DNMT3 GFP-vector vier keer lager waren dan die van de Naïeve GFP-vector, wat suggereert dat de verpakkingsefficiëntie van de CRISPR d-Cas9-RNA wordt verminderd. De transductiesnelheden van de Naïeve PURO-vector waren vijf keer hoger in vergelijking met de d-Cas9-DNMT3A-vector. Deze resultaten werden verder bevestigd door gebruik te maken van de Naïeve GFP en d-Cas9-DNMT3A-GFP.

De EB gebaseerde protocol hier beschreven maakt de differentiatie van MD NPC's. hiPSCs uitgedrukt plezier potentie marker Oct4, terwijl de MD NPC wordt uitgedrukt zowel Nestin en FoxA2. Zeven pyro-sequencing tests werden ontworpen en gevalideerd voor de kwantificering van de methylatiestatus in de SNCA intron 1.

Alle 7 tests werden gevalideerd en toonden lineaire correlatie, met behulp van de gevalideerde tests was het mogelijk om de methylatieniveaus te bepalen op de 23 CPGs in de SNCA intron 1 Het belangrijkste om te onthouden dan het bijwonen van deze procedure is om te werken met cellen die de juiste groei en gezondheid tonen om consistentie tussen experimenten te garanderen. De productie van linzenvectoren die in deze presentatie worden benadrukt, kan gemakkelijk worden aangenomen voor de productie van integralen die antivirussen tekortschieten en ook gemakkelijk kunnen worden opgeschaald om grotere hoeveelheden of meer geconcentreerde vectoren te genereren. Deze techniek kan de weg vrijmaken om de pathogene impact van genen de-regulatie op leeftijdsgebonden, noch de generatieve aandoeningen met inbegrip van de ziekte van Alzheimer en aanverwante dementie te verkennen.

Het voordeel van linzenvectoren die zich hier ontwikkelen is dat het geen gevaar is of dat infectieuze linzenvectoren slechts een minimaal effect hebben op de celcyclus, ze zijn een veilig en betrouwbaar leveringsplatform voor gentherapietoepassingen.