Na differentiatie Herbeplating van menselijke pluripotente stamcel afkomstige neuronen voor het screenen van hoge inhoud van Neuritogenese en Synapse rijping

Dit protocol vergemakkelijkt het gebruik van menselijke pluripotente stamcel-afgeleide neuronen voor hoge inhoud screening toepassingen. Het is bijzonder geschikt voor het testen van synapsen, die in menselijke neuronen vereisen lange cultuurperiodes. We tonen de replating van neuronen van groot formaat gerechten in HCS-compatibele multi putten op een manier die hun levensvatbaarheid behoudt.

Contra-intuïtief, tonen we aan dat de uitbreiding van protease incubatie voorafgaand aan resuspending en replating opbrengsten verbeterde neuronale overleving. Menselijke pluripotente stamcel-afgeleide neuronen zijn steeds relevanter op het gebied van fundamenteel onderzoek, ontwikkeling van geneesmiddelen, en degeneratieve geneeskunde. Deze zachte titratiemethode kan worden gebruikt om elke grote monolaag van cellen met een dik netwerk van processen opnieuw op te zetten.

Naast menselijke iPSCs, kan het worden gebruikt om de cultuur van primaire neuronen te replate of om ze opnieuw op te stellen voor fact sortering of single cell sequencing. Het is belangrijk om de protocollen stappen zorgvuldig te volgen en vaak toezicht op de protease bemiddelde onthechting van de neuronen van de plaat. De optimale incubatietijd kan variëren, afhankelijk van de cultuur.

Visuele demonstratie stelt zelfs onervaren onderzoekers in staat om deze procedure te reproduceren. Begin met het voorzichtig spoelen van de plaat van gedifferentieerde neuronen met PBS. Verspreid de PBS langs de wand van de plaat en niet direct op de cellen om te voorkomen dat ze verstoren.

Aspirate de PBS vanaf de rand van de schotel tijdens het kantelen, zorg ervoor dat de cellen niet aan te raken. Breng ten minste een milliliter proteolytisch enzym per 10-centimeter plaat. En breng de cellen 40 tot 45 minuten terug naar de couveuse.

Controleer tijdens de incubatie neuronen op een gefaseerde contrastmicroscoop en zet de proteasebehandeling voort totdat het neurale netwerk zich volledig losmaakt van de plaat en begint uit elkaar te vallen. Wanneer de neuronen zijn losgemaakt, stoppen met de spijsvertering door het toevoegen van vijf milliliter verse DEMEM media voor elke milliliter protease. Gebruik een serologische pipet om de cellen vijf tot acht keer tegen de plaat te titreren, om ervoor te zorgen dat er niet te veel druk wordt uitgeoefend.

Zeef de cellen door een 100 micrometer gaas in een 50 milliliter conische buis, druppel voor druppel. En spoel de zeef met nog eens vijf milliliter verse DMEM media. Gebruik een bench-top centrifuge om de cellen vijf minuten op 1000 keer G te draaien.

Na centrifugatie, breng de conische buis terug naar de bioveiligheidskast en aspirate het grootste deel van de media, waardoor 250 microliters om de cellen vochtig te houden. Voorzichtig resuspend de cellen in twee milliliter verse DMEM media dan passeren ze door het einde van een vijf milliliter serologische pipet. Ten slotte, omkeren van de buis twee tot drie keer.

Gebruik een hemocytometer en tripan blauw om de levensvatbare cellen te tellen. En dan DMEM naar de gewenste concentratie. Voeg de juiste supplementen aan de buis, afhankelijk van de eisen van de specifieke cellijn en meng voorzichtig de cellen door het kantelen van de conische buis twee tot drie keer.

Aspirate laminine coating van een 24-well plaat en spoel het een keer met PBS. De PBS aanzuigen. En toepassing van cel oplossing voor elke put in een figuur acht beweging om te voorkomen dat klonteren.

Wanneer u klaar bent met het platbeteren van de cellen, breng de plaat terug naar de incubator set op 37 graden Celsius en 5%kooldioxide. Kortvortex de voorraadoplossing van de vroege verslaggever van de celdood en voeg het aan de putten volgens de manuscriptrichting toe. Wacht 20 minuten.

En dan beeld de levende en dode cellen op glazen bodem multi putten. Het verlengen van de protease incubatie maakt het mogelijk los te maken van het neuronale netwerk binnen het opgeheven blad van cellen. Dit resulteert in verminderde celdood op het moment van dissociatie en resulteert in een efficiënter herstel in de volgende dagen.

Met behulp van de uitgebreide enzym incubatieprocedure vertonen de culturen een geschatte verdubbeling van de cel levensvatbaarheid tijdens de dagen na het replating en een lagere dichtheid van dode of stervende cellen. De overgangsfase van neuronale differentiatie vindt plaats over meerdere dagen, waarbij de cellen geleidelijk late neuronale markers uitdrukken. Deze markers worden onmiddellijk gedetecteerd in culturen die na vier weken van pre-differentiatie werden gereplateerd.

De uitgebreide protease protocol ook matig verbetert neuride uitgroei. Zowel de totale neuridelengte als de denddrite groei worden verbeterd. Replating is ook handig voor het bestuderen van synapsen.

Slechts een week na het replating werden markers voor pre- en post-synaptische eiwitten waargenomen. Bovendien is elektrische activiteit van spontane depolarisatie en synaptisch aangedreven stromen detecteerbaar met behulp van calciumbeeldvorming of multi-elektrodenarrays. Deze replating procedure kan worden aangepast aan vele soorten toepassingen.

Naast screening met een hoog gehalte om potentiële therapeutische verbindingen te identificeren, kan het worden gebruikt voor het beeldvorming van groeikegels of multi-elektrodenarray-opnames. Mechanische dissociatie van neuronen die al lange processen hebben gevormd is stressvol. Langwerpige enzymatische incubatie en zachte titratie van cellen zijn essentiële stappen voor het succes van deze procedure.