Isolatie en kwantitatieve evaluatie van de penseel cellen van muis Tracheas
12 juni 2019
Penseel cellen zijn zeldzame cholinerge chemosensorische epitheelcellen gevonden in de naïeve muis trachea. Vanwege hun beperkte aantallen is de ex vivo-evaluatie van hun functionele rol in luchtweg-immuniteit en-renovatie een uitdaging. We beschrijven een methode voor isolatie van tracheale penseel cellen door flow cytometrie.
We ontwikkelden een procedure voor isolatie van tracheale borstelcellen, zeldzame gespecialiseerde chemosensorische epitheelcellen van choline acetyltransferase fluorescerende reporter muizen. Deze methode is gebaseerd op een eerste scheiding van tracheale epitheel van de submucosa waardoor een latere kortere incubatie van het epitheelblad met papaïne mogelijk is. Dit zorgt voor een robuust herstel van tracheale borstelcellen en is met succes gebruikt voor isolatie en transcriptie analyse van borstelcellen door RNA sequencing.
Lange incubatie met spijsverteringsenzymen kan de levensvatbaarheid van cellen verminderen en het transcriptieprofiel van cellen die uit weefsels zijn geïsoleerd, wijzigen. Hier scheiden we het tracheale epitheel met dispase en vervolgens uitbroeden met papaïne voor een korte tijd produceren hoge opbrengsten van levensvatbare borstelcellen. Onze methode kan bijdragen aan studies van bovenste luchtwegen epitheel.
Hetzelfde protocol kan worden toegepast op het isoleren van borstelcellen van andere slijmvliesplaatsen zoals neusweefsel. Demonstratie van onze zeer reproduceerbare techniek zal peer wetenschappers in staat stellen om tracheale borstelcellen te isoleren en verder te onderzoeken. Om deze procedure te beginnen, voeg dispase en DNase I toe aan PBS bij de laatste concentraties die hier worden getoond om de dispase spijsverteringsoplossing voor te bereiden.
Zorg ervoor dat het dispase poeder volledig is opgelost voordat u de oplossing opwarmt in een waterbad bij 37 graden Celsius. Voeg vervolgens 5% warmte-geïnactiveerde FBS toe aan DMEM om een stopoplossing voor te bereiden. Om de Tyrode I buffer voor te bereiden, voeg papaïne en L-cysteïne toe aan de buffer van HEPES Tyrode zonder calcium.
Om de Tyrode II buffer voor te bereiden, voeg leupeptine toe aan de buffer van HEPES Tyrode zonder calcium bij een concentratie van twee microliter per milliliter. Om de FACS buffer voor te bereiden, gebruik hank's Balanced Salt Solution zonder calcium, magnesium en fenol rood aangevuld met twee millimolar EDTA en 2%FBS. Na het euthanaseren van de muis, gebruik 21 maatnaalden om het op een chirurgische raad in de supinepositie met uitgebreide hogere en lagere uitersten te bevestigen.
Spray de vacht met 70% ethanol om het gebied te ontsmetten. Met behulp van rechte tangen, til de huid en vacht van de buik en gebruik ontleden schaar om een incisie in het midden te maken. Met behulp van de schaar, scheid de huid van het onderhuidse weefsel van de buik naar de manaman.
Terwijl u het onderhuidse weefsel omhoog houdt met de tangen, maakt u een kleine incisie met de schaar in het midden van de buikwand. Open vervolgens het buikvlies met een V-vormige incisie. Met behulp van de tang, voorzichtig verplaatsen van de dunne darm aan de zijkant.
Zoek de abdominale aorta en vena cava en maak een incisie met de ontleden schaar om snelle exsanguinatie mogelijk te maken. Zoek het middenrif. Met behulp van een 18-meter naald, maak een opening in het middenrif net onder het borstbeen om de longen leeglopen.
Met behulp van scherpe gerichte rechte ontleden schaar, snijd langs de basis van de ribben om zorgvuldig te scheiden het middenrif van de ribbenkast. Gebruik de tangen om het blootgestelde uiteinde van het borstbeen op te tillen en snijd het borstbeen in de lengterichting van de basis van de ribbenkast naar de nek. Gebruik een korte rechte schaar om een centrale cervicale incisie te maken en de twee lobben van de submandibulaire klier te scheiden.
Gebruik hierna een paar fijne punthoge precisiekrachten om het omringende bindweefsel en de thymus die de carina te boven gaat zorgvuldig te verwijderen. Ontleed de luchtpijp vrij door eerst het proximale uiteinde op het niveau van de epiglottis te scheiden en vervolgens het distale uiteinde te ontleden op het niveau van de splitsing van de luchtpijp. Zoek de epiglottis en snijd de luchtpijp in de lengterichting van de epiglottis naar de carina.
Om te beginnen, plaats de luchtpijp in een 1,5 milliliter buis met 750 microliter van dispase spijsvertering oplossing voorverwarmd tot 37 graden Celsius. Bedek de buis met aluminiumfolie om de blootstelling aan direct licht en incubate op een shaker bij 200 RPM en bij kamertemperatuur gedurende 40 minuten te verminderen. Voeg vervolgens 750 microliter DMEM met 5%FBS toe om de reactie te stoppen en de buis op ijs te plaatsen.
Breng de luchtpijp over op een petrischaaltje. Oriënteer de luchtpijp met de epitheelzijde naar boven gericht. De langslepende ontleede luchtpijp heeft een semi-cilindrische vorm onderhouden door de kraakbeenige ringen.
Het epitheel bevindt zich op het holle oppervlak. Met behulp van rechte tangen, tether de epiglottis gebied van de luchtpijp aan de Petri schotel en gebruik een maat 22 verwijdering scalpel om het epitheel schraap van de luchtpijp. De epitheellaag zal als doorschijnend blad scheiden.
Gebruik de scalpel om het epitheel gehakt en breng de epitheellaag over naar een twee milliliter buis. Spoel de petrischaal met 750 microliters Tyrode I buffer en breng deze over naar de buis met de epitheellaag. Bedek de buis met aluminiumfolie om de blootstelling aan direct licht en incubaat bij 37 graden Celsius te verminderen op een shaker bij 200 RPM gedurende 30 minuten.
Voeg vervolgens 750 microliters koude Tyrode II buffer toe. Vortex het verteerde weefsel krachtig gedurende 20 tot 30 seconden. Met behulp van een spuit bevestigd aan een 18-meter naald, trituraat het homogenaat 10 keer.
Schakel hierna nog 10 tot 20 keer over op een naald van 21 meter en trituraat. Filtreer de cellen door een zeef van 100 micrometer in een conische buis van 50 milliliter. Voeg koude FACS-buffer toe met een volumetrische verhouding van 30 tegen één.
Centrifuge op 350 keer g en bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Gooi de supernatant weg en verleg de pellet in een koude FACS-buffer. Breng deze ophanging over op een polystyreenbuis van 12 bij 75 millimeter.
Centrifuge opnieuw op 350 keer g en bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Gooi de supernatant weg en verleg de pellet in 100 microliter facs-buffer. Voeg vervolgens een microliter anti-muis CD1632 blokkeren antilichaam toe om niet-specifieke binding en incuberen op ijs gedurende 15 minuten te blokkeren.
Voeg vervolgens antilichamen toe in de respectieve isotypebesturingselementen zoals beschreven in het tekstprotocol. Incubeer op ijs gedurende 45 minuten, terwijl beschermd tegen direct licht. Voeg hierna 4,5 milliliter koude FACS-buffer toe en meng.
Centrifuge op 350 keer g en bij vier graden Celsius. Gooi de supernatant weg en verleg de pellet in 300 microliter koude FACS-buffer. Voeg propidium jodide onmiddellijk voor flow cytometrische sortering.
In deze studie worden tracheale borstelcellen van ChAT eGFP acetylcholine fluorescerende reportermuizen met succes geïsoleerd voor RNA-sequencing. Cellen worden geïdentificeerd van puin door voorwaartse en zijverstrooiingshoek. Doubletten zijn uitgesloten met behulp van voorwaartse spreidingshoogte en breedte en zijverstrooiingshoogte en -breedte.
De doubletten zijn de cellen met hoge breedtewaarden. Binnen de enkele cellen worden de levende cellen geïdentificeerd als de populatie die propidium jodide negatief is. Binnen de levende enkele cellen worden de CD45 lage tot negatieve cellen geïdentificeerd op basis van de isotypecontrole.
Binnen de CD45 lage negatieve cellen zijn de EpCAM-positieve cellen die ook eGFP-positief zijn in het FITC-kanaal de populatie van borstelcellen. Borstelcelnummers worden gewijzigd door blootstelling aan microbiële metabolieten en protozoa en weerspiegelen daarom de variabiliteit van institutionele microbiota. Daarom raden we aan om het aantal borstelcellen te schatten door fluorescentiemicroscopie om het verwachte aantal geïsoleerde borstelcellen te meten door cytometrische sortering van stroom.
Zorg ervoor dat u de epitheellaag van de luchtpijp goed scheidt, omdat deze de opbrengsten van geïsoleerde borstelcellen bepaalt. De geïsoleerde tracheale borstelcellen kunnen worden gebruikt in een breed scala van tests, zoals RNA sequencing, celcultuur en functionele analyse.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een methode voor het isoleren van tracheale brush-cellen, zeldzame cholinerge chemosensorische epitheelcellen in de trachea van de muis. De techniek verbetert het herstel van deze cellen voor functionele analyse van de immuniteit en remodellering van de luchtwegen.
Belangrijkste studieonderdelen
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Respiratoire fysiologie
Achtergrond
- Tracheale brushcellen zijn gespecialiseerde epitheelcellen.
- Ze spelen een rol bij de immuniteit van de luchtwegen.
- De isolatie van deze cellen is uitdagend vanwege hun zeldzaamheid.
- Bestaande methoden kunnen de celviabiliteit in gevaar brengen.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een betrouwbare methode voor het isoleren van tracheale borstelcellen.
- Het verdiepen van het inzicht in hun functionele rollen.
- Het faciliteren van transcriptionele analyse via RNA-sequencing.
Gebruikte methoden
- Scheiding van het tracheale epitheel van de submucosa.
- Korte incubatie met papaïene om de celviabiliteit te behouden.
- Gebruik van dispase voor een effectieve epitheliale scheiding.
- Hoge opbrengst bij het herstel van viabele borstelcellen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie van tracheale borstelcellen.
- Hoge levensvatbaarheidspercentages van de geïsoleerde cellen.
- De methode maakt daaropvolgende transcriptionele analyse mogelijk.
- Draagt bij aan studies naar het epitheel van de bovenste luchtwegen.
Conclusies
- De ontwikkelde methode is effectief voor het isoleren van brush-cellen.
- Het behoudt de celviabiliteit en transcriptionele integriteit.
- Deze techniek kan het onderzoek naar de biologie van de luchtwegen bevorderen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Managers
De isolatie van zeldzame chemosensorische epitheelcellen maakt mechanistische risicoreductie van targets in de luchtwegbiologie mogelijk door een gevalideerd biologisch systeem te bieden voor functionele analyse. Deze methode ondersteunt targetvalidatie en assayontwikkeling in onderzoek naar respiratoire aandoeningen door levensvatbare, transcriptioneel intacte brush-cellen te leveren voor downstream-analyse. De procedure verhoogt het voorspellend vertrouwen in de vroege ontdekkingsfase door de biologische variabiliteit die gepaard gaat met artefacten door enzymatische dissociatie te verminderen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek naar cholinerge chemosensorische paden in epitheelcellen van de luchtwegen mogelijk voor het testen van doelhypothesen.
- Operationele waarde: Biedt een reproduceerbare bron van levensvatbare brush-cellen voor functionele validatie van doelen in de luchtwegen.
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt biologische risicovermindering door transcriptionele profilering van geïsoleerde brush-cellen via RNA-sequencing.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Levert gestandaardiseerde epitheellaagjes voor een consistente bereiding van brush cell-suspensies in assay-workflows.
- Operationele waarde: Korte incubatie met papaïne behoudt de celviabiliteit en transcriptionele integriteit voor betrouwbare functionele read-outs.
- Wetenschappelijke waarde: Maakt kwantitatieve evaluatie mogelijk van de respons van brush cells op microbiële metabolieten en blootstelling aan protozoa.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Faciliteert ziekterelevante systeemmodellering van het epitheel van de bovenste luchtwegen voor preklinische validatie van targets.
- Operationele waarde: Biedt een overdraagbaar protocol dat toepasbaar is op de isolatie van brush-cellen uit neus- en andere mucosale weefsels.
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt de ontdekking van translationele biomarkers door de variabiliteit van brush-cellen te koppelen aan blootstelling aan institutionele microbiota.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode integreert in discovery biology-workflows door de isolatie van zeldzame epitheelcellen mogelijk te maken voor hypothese-gestuurde target-validatie en pathway-verduidelijking voorafgaand aan screeningcampagnes.
- Discovery Biology: Ondersteunt mechanistische risicoreductie van luchtwegdoelen via levensvatbare isolatie van borstelcellen en transcriptionele analyse.
- Screening: Levert gestandaardiseerde, levensvatbare cel-suspensies die geschikt zijn voor compound-screening en de ontwikkeling van functionele assays.
- Analytics: Biedt kwantitatieve resultaten via flowcytometrie en RNA-sequencing voor comparatieve analyse van condities.
- Translationeel onderzoek: Verbindt discovery met preklinische continuïteit door middel van ziekterelevante modellering van het epitheel van de bovenste luchtwegen.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar isolatieplatform voor borstelcellen over meerdere mucosaire locaties en programma's voor respiratoire ziekten.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellende betrouwbaarheid bij targetvalidatie door het behoud van cellevensvatbaarheid en transcriptionele profielen.
- Operationele waarde: Standaardisatie en reproduceerbaarheid via gedefinieerde enzymatische dissociatiestappen en bufferbereidingen.
- Strategische waarde: Vermindering van biologische risico's in een laat stadium door vroege functionele analyse van zeldzame chemosensorische cellen mogelijk te maken.
- Impact op portfolio: Onderbouwde go/no-go-beslissingen op basis van de variabiliteit in de respons van brush-cellen op microbiële metabolieten.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in epitheliale dissectie en enzymatische weefselverwerking.
- Afhankelijk van toegang tot dispase, papaine en flowcytometrie-instrumentatie.
- Vereist standaardisatie van de scheiding van epitheliale vellen voor consistente opbrengsten aan brush cells.
- Omvat overwegingen voor aanpassing bij het toepassen van het protocol op neus- of andere mucosaweefsels.
- Beperkt door de zeldzaamheid van brush cells, waardoor fluorescentiemicroscopie noodzakelijk is voor de schatting van de opbrengst voorafgaand aan het sorteren.
