Isolatie en kwantitatieve evaluatie van de penseel cellen van muis Tracheas
June 12th, 2019
Penseel cellen zijn zeldzame cholinerge chemosensorische epitheelcellen gevonden in de naïeve muis trachea. Vanwege hun beperkte aantallen is de ex vivo-evaluatie van hun functionele rol in luchtweg-immuniteit en-renovatie een uitdaging. We beschrijven een methode voor isolatie van tracheale penseel cellen door flow cytometrie.
We ontwikkelden een procedure voor isolatie van tracheale borstelcellen, zeldzame gespecialiseerde chemosensorische epitheelcellen van choline acetyltransferase fluorescerende reporter muizen. Deze methode is gebaseerd op een eerste scheiding van tracheale epitheel van de submucosa waardoor een latere kortere incubatie van het epitheelblad met papaïne mogelijk is. Dit zorgt voor een robuust herstel van tracheale borstelcellen en is met succes gebruikt voor isolatie en transcriptie analyse van borstelcellen door RNA sequencing.
Lange incubatie met spijsverteringsenzymen kan de levensvatbaarheid van cellen verminderen en het transcriptieprofiel van cellen die uit weefsels zijn geïsoleerd, wijzigen. Hier scheiden we het tracheale epitheel met dispase en vervolgens uitbroeden met papaïne voor een korte tijd produceren hoge opbrengsten van levensvatbare borstelcellen. Onze methode kan bijdragen aan studies van bovenste luchtwegen epitheel.
Hetzelfde protocol kan worden toegepast op het isoleren van borstelcellen van andere slijmvliesplaatsen zoals neusweefsel. Demonstratie van onze zeer reproduceerbare techniek zal peer wetenschappers in staat stellen om tracheale borstelcellen te isoleren en verder te onderzoeken. Om deze procedure te beginnen, voeg dispase en DNase I toe aan PBS bij de laatste concentraties die hier worden getoond om de dispase spijsverteringsoplossing voor te bereiden.
Zorg ervoor dat het dispase poeder volledig is opgelost voordat u de oplossing opwarmt in een waterbad bij 37 graden Celsius. Voeg vervolgens 5% warmte-geïnactiveerde FBS toe aan DMEM om een stopoplossing voor te bereiden. Om de Tyrode I buffer voor te bereiden, voeg papaïne en L-cysteïne toe aan de buffer van HEPES Tyrode zonder calcium.
Om de Tyrode II buffer voor te bereiden, voeg leupeptine toe aan de buffer van HEPES Tyrode zonder calcium bij een concentratie van twee microliter per milliliter. Om de FACS buffer voor te bereiden, gebruik hank's Balanced Salt Solution zonder calcium, magnesium en fenol rood aangevuld met twee millimolar EDTA en 2%FBS. Na het euthanaseren van de muis, gebruik 21 maatnaalden om het op een chirurgische raad in de supinepositie met uitgebreide hogere en lagere uitersten te bevestigen.
Spray de vacht met 70% ethanol om het gebied te ontsmetten. Met behulp van rechte tangen, til de huid en vacht van de buik en gebruik ontleden schaar om een incisie in het midden te maken. Met behulp van de schaar, scheid de huid van het onderhuidse weefsel van de buik naar de manaman.
Terwijl u het onderhuidse weefsel omhoog houdt met de tangen, maakt u een kleine incisie met de schaar in het midden van de buikwand. Open vervolgens het buikvlies met een V-vormige incisie. Met behulp van de tang, voorzichtig verplaatsen van de dunne darm aan de zijkant.
Zoek de abdominale aorta en vena cava en maak een incisie met de ontleden schaar om snelle exsanguinatie mogelijk te maken. Zoek het middenrif. Met behulp van een 18-meter naald, maak een opening in het middenrif net onder het borstbeen om de longen leeglopen.
Met behulp van scherpe gerichte rechte ontleden schaar, snijd langs de basis van de ribben om zorgvuldig te scheiden het middenrif van de ribbenkast. Gebruik de tangen om het blootgestelde uiteinde van het borstbeen op te tillen en snijd het borstbeen in de lengterichting van de basis van de ribbenkast naar de nek. Gebruik een korte rechte schaar om een centrale cervicale incisie te maken en de twee lobben van de submandibulaire klier te scheiden.
Gebruik hierna een paar fijne punthoge precisiekrachten om het omringende bindweefsel en de thymus die de carina te boven gaat zorgvuldig te verwijderen. Ontleed de luchtpijp vrij door eerst het proximale uiteinde op het niveau van de epiglottis te scheiden en vervolgens het distale uiteinde te ontleden op het niveau van de splitsing van de luchtpijp. Zoek de epiglottis en snijd de luchtpijp in de lengterichting van de epiglottis naar de carina.
Om te beginnen, plaats de luchtpijp in een 1,5 milliliter buis met 750 microliter van dispase spijsvertering oplossing voorverwarmd tot 37 graden Celsius. Bedek de buis met aluminiumfolie om de blootstelling aan direct licht en incubate op een shaker bij 200 RPM en bij kamertemperatuur gedurende 40 minuten te verminderen. Voeg vervolgens 750 microliter DMEM met 5%FBS toe om de reactie te stoppen en de buis op ijs te plaatsen.
Breng de luchtpijp over op een petrischaaltje. Oriënteer de luchtpijp met de epitheelzijde naar boven gericht. De langslepende ontleede luchtpijp heeft een semi-cilindrische vorm onderhouden door de kraakbeenige ringen.
Het epitheel bevindt zich op het holle oppervlak. Met behulp van rechte tangen, tether de epiglottis gebied van de luchtpijp aan de Petri schotel en gebruik een maat 22 verwijdering scalpel om het epitheel schraap van de luchtpijp. De epitheellaag zal als doorschijnend blad scheiden.
Gebruik de scalpel om het epitheel gehakt en breng de epitheellaag over naar een twee milliliter buis. Spoel de petrischaal met 750 microliters Tyrode I buffer en breng deze over naar de buis met de epitheellaag. Bedek de buis met aluminiumfolie om de blootstelling aan direct licht en incubaat bij 37 graden Celsius te verminderen op een shaker bij 200 RPM gedurende 30 minuten.
Voeg vervolgens 750 microliters koude Tyrode II buffer toe. Vortex het verteerde weefsel krachtig gedurende 20 tot 30 seconden. Met behulp van een spuit bevestigd aan een 18-meter naald, trituraat het homogenaat 10 keer.
Schakel hierna nog 10 tot 20 keer over op een naald van 21 meter en trituraat. Filtreer de cellen door een zeef van 100 micrometer in een conische buis van 50 milliliter. Voeg koude FACS-buffer toe met een volumetrische verhouding van 30 tegen één.
Centrifuge op 350 keer g en bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Gooi de supernatant weg en verleg de pellet in een koude FACS-buffer. Breng deze ophanging over op een polystyreenbuis van 12 bij 75 millimeter.
Centrifuge opnieuw op 350 keer g en bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Gooi de supernatant weg en verleg de pellet in 100 microliter facs-buffer. Voeg vervolgens een microliter anti-muis CD1632 blokkeren antilichaam toe om niet-specifieke binding en incuberen op ijs gedurende 15 minuten te blokkeren.
Voeg vervolgens antilichamen toe in de respectieve isotypebesturingselementen zoals beschreven in het tekstprotocol. Incubeer op ijs gedurende 45 minuten, terwijl beschermd tegen direct licht. Voeg hierna 4,5 milliliter koude FACS-buffer toe en meng.
Centrifuge op 350 keer g en bij vier graden Celsius. Gooi de supernatant weg en verleg de pellet in 300 microliter koude FACS-buffer. Voeg propidium jodide onmiddellijk voor flow cytometrische sortering.
In deze studie worden tracheale borstelcellen van ChAT eGFP acetylcholine fluorescerende reportermuizen met succes geïsoleerd voor RNA-sequencing. Cellen worden geïdentificeerd van puin door voorwaartse en zijverstrooiingshoek. Doubletten zijn uitgesloten met behulp van voorwaartse spreidingshoogte en breedte en zijverstrooiingshoogte en -breedte.
De doubletten zijn de cellen met hoge breedtewaarden. Binnen de enkele cellen worden de levende cellen geïdentificeerd als de populatie die propidium jodide negatief is. Binnen de levende enkele cellen worden de CD45 lage tot negatieve cellen geïdentificeerd op basis van de isotypecontrole.
Binnen de CD45 lage negatieve cellen zijn de EpCAM-positieve cellen die ook eGFP-positief zijn in het FITC-kanaal de populatie van borstelcellen. Borstelcelnummers worden gewijzigd door blootstelling aan microbiële metabolieten en protozoa en weerspiegelen daarom de variabiliteit van institutionele microbiota. Daarom raden we aan om het aantal borstelcellen te schatten door fluorescentiemicroscopie om het verwachte aantal geïsoleerde borstelcellen te meten door cytometrische sortering van stroom.
Zorg ervoor dat u de epitheellaag van de luchtpijp goed scheidt, omdat deze de opbrengsten van geïsoleerde borstelcellen bepaalt. De geïsoleerde tracheale borstelcellen kunnen worden gebruikt in een breed scala van tests, zoals RNA sequencing, celcultuur en functionele analyse.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie presenteert een methode voor het isoleren van trachea-borstelcellen, die zeldzame cholinerge chemosensorische epitheelcellen zijn in de muizentrachea. De techniek verbetert het herstel van deze cellen voor functionele analyse in luchtwegimmuniteit en remodellering.
Belangrijkste studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Ademhalingsfysiologie
Achtergrond
- Tracheale borstelcellen zijn gespecialiseerde epitheelcellen.
- Ze spelen een rol in luchtwegimmuniteit.
- Isoleren van deze cellen is uitdagend vanwege hun zeldzaamheid.
- Bestaande methoden kunnen de celviabiliteit aantasten.
Doel van het onderzoek
- Om een betrouwbare methode te ontwikkelen voor het isoleren van trachea-borstelcellen.
- Om het begrip van hun functionele rollen te verbeteren.
- Om transcriptionele analyse via RNA-sequencing te vergemakkelijken.
Gebruikte methoden
- Afscheiding van het trachea-epitheel van de submucosa.
- Korte incubatie met papaïne om celviabiliteit te behouden.
- Gebruik van dispase voor effectieve epitheliale scheiding.
- Hoge opbrengst herstel van levensvatbare borstelcellen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie van trachea-borstelcellen.
- Hoge levensvatbaarheidspercentages van geïsoleerde cellen.
- Methode maakt daaropvolgende transcriptionele analyse mogelijk.
- Draagt bij aan studies van het epitheel van de bovenste luchtwegen.
Conclusies
- De ontwikkelde methode is effectief voor het isoleren van borstelcellen.
- Het behoudt de celviabiliteit en transcriptionele integriteit.
- Deze techniek kan onderzoek in luchtwegbiologie bevorderen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Isolation of rare chemosensory epithelial cells enables mechanistic de-risking of airway biology targets by providing a validated biological system for functional interrogation. This method supports target validation and assay development in respiratory disease research by delivering viable, transcriptionally intact brush cells for downstream analysis. The procedure enhances predictive confidence in early discovery by reducing biological variability associated with enzymatic dissociation artifacts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of cholinergic chemosensory pathways in airway epithelial cells for target hypothesis testing.
- Operational Value: Provides a reproducible source of viable brush cells for functional validation of airway targets.
- Scientific Value: Supports biological de-risking through transcriptional profiling of isolated brush cells via RNA sequencing.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers standardized epithelial sheets for consistent preparation of brush cell suspensions in assay workflows.
- Operational Value: Short papain incubation preserves cell viability and transcriptional integrity for reliable functional readouts.
- Scientific Value: Enables quantitative evaluation of brush cell responses to microbial metabolites and protozoa exposure.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates disease-relevant system modeling of upper airway epithelium for preclinical target validation.
- Operational Value: Offers a transferable protocol applicable to brush cell isolation from nasal and other mucosal tissues.
- Scientific Value: Supports translational biomarker discovery by linking brush cell variability to institutional microbiota exposure.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery biology workflows by enabling isolation of rare epithelial cells for hypothesis-driven target validation and pathway clarification prior to screening campaigns.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking of airway targets through viable brush cell isolation and transcriptional analysis.
- Screening: Delivers standardized, viable cell suspensions suitable for compound screening and functional assay development.
- Analytics: Provides quantitative outputs via flow cytometry and RNA sequencing for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity through disease-relevant upper airway epithelium modeling.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable isolation platform for brush cells across multiple mucosal sites and respiratory disease programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through preservation of cell viability and transcriptional profiles.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via defined enzymatic dissociation steps and buffer preparations.
- Strategic Value: Reduced late-stage biological risk by enabling early functional analysis of rare chemosensory cells.
- Portfolio Impact: Informed go/no-go decisions based on brush cell response variability to microbial metabolites.
Implementation Considerations
- Requires expertise in epithelial dissection and enzymatic tissue processing.
- Dependent on access to dispase, papain, and flow cytometry instrumentation.
- Necessitates standardization of epithelial sheet separation for consistent brush cell yields.
- Involves adaptation considerations for applying the protocol to nasal or other mucosal tissues.
- Limited by the rarity of brush cells, necessitating fluorescence microscopy for yield estimation prior to sorting.
