Direct meten van krachten binnen gereconstitueerde actieve microtubulibundels

Ons protocol stelt onderzoekers in staat om cytoskeletale motieven te bouwen uit gezuiverde componenten en direct de krachten te meten die deze netwerken genereren om te begrijpen hoe deze mechanische componenten van de cel functioneren in zowel gezonde als ziektetoestanden. Deze methode stelt ons in staat om krachten te kwantificeren en deze getallen direct te correleren om parameters van de betrokken eiwitten te behouden, inclusief eiwitconcentratie en -dichtheid. Parameters die over het algemeen onmogelijk te verkrijgen zijn in de cel.

Deze methode kan inzicht geven in elk type cytoskeletnetwerk, zoals die betrokken zijn bij mitose of neurale ontwikkeling. Het kan gemakkelijk worden aangepast aan het bestuderen van netwerken die betrokken zijn bij spiercontractie of celmigratie door simpelweg deze specifieke eiwitten die worden gebruikt te verwisselen. Het lastigste aspect van deze methode is de coördinatie van de verschillende technologieën, waaronder een optische val met één bundel en een TIRF-microscoop.

Bovendien vereisen experimenten met één molecuul een zorgvuldige voorbereiding van oppervlakken, zoals de afdekslip, dus het voorbereiden van hoogwaardige monsters is van het grootste belang. Begin met het bouwen van een vochtigheidskamer door een opgevouwen, pluisvrij weefsel bevochtigd met ultrapuur water op de bodem van een lege pipetpuntdoos te plaatsen. Introduceer alle reagentia door de vloeistof aan het ene uiteinde van het kanaal te pipetteren en de vloeistof aan het andere uiteinde af te voeren.

Met behulp van een 20-microliter-schuine pipetpunt, langzaam stromen in 10 microliter van 0,5 milligram per milliliter streptavidin of NeutrAvidin. Incubeer de glijbaan gedurende 4 minuten in de vochtigheidskamer met de afdekslip naar beneden gericht. Spoel de kamer uit met 20 microliter van een 1x BRB80 met behulp van een pluisvrij weefsel om vloeistoffen eruit te trekken.

Na het herhalen van stromende reagentia en incubatie nog een keer, spoel stap met 10 microliter van 0,5 milligram per milliliter caseïne blokkerende oplossing. Stroom 10 microliter verdunde biotinylated-far-red microtubules in de kamer en spoel de kamer vervolgens met 20 microliter van 1x BRB80. Na het vloeien van het reagens en het incuberen zoals eerder aangetoond, spoelt u de stap met 10 microliter van een geschikte concentratie niet-motorisch eiwit dat moet worden bestudeerd, stroomt u vervolgens 10 microliter rhodaminemicrotubuli in en herhaalt u de incubatie en spoeling.

Combineer vervolgens 1 microliter rigor kinesine-gecoate kralen en 19 microliter reactiebuffer. Sluit beide randen van de kamer af met heldere nagellak en wacht tot de lak droogt. Gebruik een omgekeerd microscoopinstrument dat totale interne reflectiefluorescentiebeeldvormingsmogelijkheden heeft en waarin een optische val met één bundel is gebouwd.

Voeg 1 druppel dompelolie toe aan de afdekslip van de monsterkamer. Plaats het monster op het microscoopplatform met de afdekslipzijde van de monsterkamer naar beneden gericht. Breng het objectief langzaam omhoog zodat er contact is tussen zowel de cover slip als het objectief door de olie.

Pas de hoogte van het objectief zo aan dat het afdekvlak van de monsterkamer scherp is. Neem single-frame beelden van de samples op in alle drie de kanalen. Gebruik voor de experimenten hier 100 tot 200 milliseconden blootstelling.

Pas het laservermogen aan om een goede signaal-ruisverhouding van de monsters te bereiken en minimaliseer het bleken van foto's gedurende 2 tot 5 minuten wanneer de afzonderlijke bundel wordt getest. De frequentie van microtubulibundels per gezichtsveld moet ongeveer drie tot vier microtubulibundels per 100 microliter bij 100 microliter gezichtsveld per kamer zijn. Observeer de dichtheid van kralen in het monster met behulp van een helder veld en het 100x-objectief op de microscoop.

Gebruik een concentratie van kralen, zodat de kralen gemiddeld minimaal 10 micrometer van elkaar verwijderd zijn en zorg ervoor dat ze vrij zijn van elke vorm van oppervlakte-opsluiting of clustering. Zorg ervoor dat de gebiotinyleerde verrode microtubuli stevig aan het oppervlak van de cover zijn bevestigd en dat de rhodamine zonder zichtbare Brownse beweging. Zorg ervoor dat de rhodamine microtubuli via de cross-linking map aan gebiotinyleerde microtubuli zijn bevestigd en zichtbaar fluctueren aan hun vrije uiteinden.

Identificeer een geschikte microtubule-bundel die slechts twee microtubuli bevat, één gebiotinyleerd met volledige oppervlakteaanhechting en één niet-gebiotinyleerde microtubuli die gedeeltelijk vrij in oplossing is en is uitgelijnd op de x- of y-as. Gebruik de optische val om een vrije kraal vast te leggen die brownse beweging demonstreert. Zodra de kraal is gevangen, verplaatst u de kraal voorzichtig naar de geselecteerde microtubulebundel om ervoor te zorgen dat er tijdens het proces geen andere kralen in de val worden getrokken.

Zorg ervoor dat de kraal enkele micron verwijderd is van het overlapgebied dat cross-linking eiwitten bevat. Laat de kraal voorzichtig in de z-as zakken totdat deze contact maakt met de rand van het vrije segment van de rhodaminemicrotubuli. Trek voorzichtig omhoog en beweeg loodrecht op de microtubule-as om te controleren op bevestiging door de rhodamine microtubule te observeren die buigt en de kraalpositie volgt.

Lijn de rhodaminemicrotubuli zorgvuldig opnieuw uit langs de microtubule-as van de aan het oppervlak bevestigde microtubuli door de nanopositioneringsfase te verplaatsen en de parameters in te stellen voor het automatisch trekken van de microtubulebundel. Stel de richting in langs de parallelle as van de microtubuli. Stel de gewenste treksnelheid en gewenste trektijd in, afhankelijk van de overlaplengte.

Begin met het opnemen van fluorescentiegegevens in de drie kanalen met een snelheid van 1 tot 2 frames per seconde. Gebruik de geoptimaliseerde laservermogens en belichtingstijden. Start geautomatiseerde podiumbeweging en registreer vanggegevens van de positiegevoelige detectorfase en de totale interne reflectiefluorescentiecamerafase.

Deactiveer de vallen om de kraal los te laten en herhaal het experiment naar wens. Ensembles van het essentiële mitotische motoreiwit kinesine-5 kunnen microtubule-glijden reguleren door zowel duw- als remkrachten te genereren die lineair schalen met overlaplengte. Het bleek dat het C-terminal staartdomein nodig is voor efficiënte cross-linking en krachtgeneratie.

Het eiwit over de volledige lengte is in staat om aanhoudende krachten te genereren die plateau wanneer alle motoreiwitten hun individuele stalkracht bereiken. De kinesine-5-motor die zijn C-terminale staart mist, genereert echter maximale krachten die bijna vijf keer kleiner zijn in omvang. Ensembles van het niet-motorische mitotische eiwit PRC1 werken als een mechanische dash pod om microtubuli te weerstaan die in de middenzone van de anafasespil glijden.

De resistieve krachten zijn niet afhankelijk van de lengte van overlappende gebieden tussen microtubuliparen of de lokale crosslinkerdichtheid, maar ze zijn wel sterk afhankelijk van de totale concentratie van ingeschakelde PRC1-moleculen. Deze methode kan worden aangepast om verschillende biologische systemen zoals microbiële organisatie en neuronen te bestuderen door alternatieve eiwitten te gebruiken. Het kan ook gemakkelijk worden uitgebreid om op actine gebaseerde netwerkgeometrieën te analyseren om spiercontractie of celmotiliteit te bestuderen.

Met deze techniek kan men unieke celtotaalgeometrieën bestuderen, waarbij filamenten zowel spoor als lading zijn en worden georganiseerd door kleine ensembles van eiwitten. Deze geometrieën bootsen beter na wat er in cellen gebeurt tijdens tal van biologische processen.